一種用于低溫堆肥的復(fù)合菌劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于低溫堆肥的復(fù)合菌劑，由下述菌株組成：假單胞菌屬B6-15?1.0×1010～1.0×1012cfu/mL；假單胞菌屬B5-16?1.0×1010～1.0×1012cfu/mL；總菌數(shù)為2.0×1010-2.0×1012cfu/mL。在低溫條件下，使用本發(fā)明所述的復(fù)合菌劑，可以在堆肥升溫過程中起到階段性作用，顯著縮短堆肥升溫階段所需時(shí)間，并提高堆肥溫度，對于解決國內(nèi)北方地區(qū)冬季低溫環(huán)境條件下堆肥升溫困難的現(xiàn)狀具有一定現(xiàn)實(shí)意義。
【專利說明】一種用于低溫堆肥的復(fù)合菌劑及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及一種用于低溫堆肥的復(fù)合菌劑及其制備方法和應(yīng)用，屬于微生物制劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]我國農(nóng)業(yè)廢棄物的種類繁多，其中，畜禽糞便年產(chǎn)生量約為18.6X108t，其中牛糞
10.7X108t，豬糞2.7X108t，羊糞3.4X108t，家禽糞1.8X 108t，并且隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅速發(fā)展和人口數(shù)量的激增，這些廢棄物以年5%~10%的速度遞增。堆肥技術(shù)作為一種保持良好環(huán)境效應(yīng)的產(chǎn)物，具有生物處理的可持續(xù)性和廢棄資源的循環(huán)利用等特征，已被許多國家和地區(qū)所接受，成為處理有機(jī)固體廢物的有效方法之一。
[0003]微生物在堆肥過程中是作為一種添加劑加入的，即微生物接種劑。市售普通的微生物接種劑通常為中溫菌劑或高溫菌劑。但是在低溫環(huán)境下，這些微生物接種劑在堆肥過程中的作用大大折扣，導(dǎo)致升溫階段時(shí)間長，影響了堆肥無害化進(jìn)程和發(fā)酵周期。因此，篩選出能有效縮短升溫時(shí)間的復(fù)合微生物接種菌系對于華北地區(qū)冬季低溫堆肥具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用于低溫堆肥前期幫助快速升溫的復(fù)合菌劑。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。
[0006]一種用于低溫堆肥的復(fù)合菌劑，由下述菌株組成:
[0007]假單胞菌屬B6-15 1.0X IO10 ~1.0X 1012cfu/mL ；
[0008]假單胞菌屬B5-16 1.0X IO10 ~1.0X 1012cfu/mL ；
[0009]總菌數(shù)為2.0 X 1010-2.0 X 1012cfu/mL。
[0010]作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述用于低溫堆肥的復(fù)合菌劑，由下述菌株組成:
[0011]假單胞菌屬B6-152.6X101。~20.0X10lclcfu/mL ;
[0012]假單胞菌屬B5-161.8X101。~15.0X10lclcfu/mL。
[0013]本發(fā)明所述假單胞菌屬B6-15 (Pseudomonas sp.)、假單胞菌屬B5-16(Pseudomonas sp.)均可以通過北京沃土天地生物科技有限公司購買得到。
[0014]本發(fā)明還提供上述復(fù)合菌劑的制備方法，包括如下步驟:
[0015]I)斜面培養(yǎng):將B6-15, B5-16原始菌種無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基上,在15-25°C條件下培養(yǎng)1-2天，活化菌株；
[0016]2) 一級種子培養(yǎng):將步驟I)活化的菌種無菌條件下分別接種于NR液體培養(yǎng)基，15-25°C搖床培養(yǎng)1-2天，制得一級種子液；
[0017]3)混合發(fā)酵培養(yǎng):將步驟2) —級種子液B6-15、B5_16接種到發(fā)酵罐中，20°C條件下混合培養(yǎng)3-5天，得到復(fù)合菌劑。
[0018]其中，在步驟I)中，所述固體培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaC15g/L,瓊脂15g/L,去離子水1000ml,滅菌。
[0019]在步驟2)中，所述NR液體培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaC15g/L，去離子水1000ml，滅菌。
[0020]在步驟2)中，所述搖床培養(yǎng)條件為:通氣量1:1-1.2，150-200r/min。
[0021]在步驟3)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:糖蜜^^，玉米漿]1^，MgSO40.05%,K2HPO40.15%, NaCl0.1%，葡萄糖 1.5%0
[0022]在步驟3)中，所述接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1_10%。
[0023]本發(fā)明還提供復(fù)合菌劑在低溫堆肥中的應(yīng)用。具體為將復(fù)合菌劑以堆肥材料干重的3-6%。接入堆肥材料中，2-4°C進(jìn)行堆肥15-48h。
[0024]本發(fā)明所述的復(fù)合微生物菌劑具有低溫條件下生長速度快，共生、協(xié)同促進(jìn)且不產(chǎn)生拮抗作用的特點(diǎn)，培 養(yǎng)20h即達(dá)到穩(wěn)定期，OD600=2.9 ;在傳代過程中菌株數(shù)量穩(wěn)定性保持在較高水平，生長PH較穩(wěn)定，介于7.5-8之間。
[0025]在低溫條件下，使用本發(fā)明所述的復(fù)合菌劑，可以在堆肥升溫過程中起到階段性作用，顯著縮短堆肥升溫階段所需時(shí)間，對于解決國內(nèi)北方地區(qū)冬季低溫環(huán)境條件下堆肥升溫困難的現(xiàn)狀具有一定現(xiàn)實(shí)意義。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0027]實(shí)施例1
[0028]一種用于低溫堆肥的復(fù)合菌劑，組成為:
[0029]假單胞菌屬B6-15 2.6 X 1010cfu/mL ；
[0030]假單胞菌屬B5-16 1.8 X 1010cfu/mL ；
[0031]兩種菌株的總含量范圍值為3.0X 101Q-6.0X 101Qcfu/mL.[0032]上述復(fù)合菌劑的制備方法，包括如下步驟:
[0033]I)斜面培養(yǎng):將B6-15, B5-16原始菌種無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基上,在20°C條件下培養(yǎng)I天，活化菌株；
[0034]2) 一級種子培養(yǎng):將步驟I)活化的菌種無菌條件下分別接種于NR液體培養(yǎng)基，在20°C條件下，通氣量1:1.2，160r/min搖床培養(yǎng)I天，制得一級種子液；
[0035]3)混合發(fā)酵培養(yǎng):將步驟2) —級種子液B6-15，B5-16按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5%接種到發(fā)酵罐中，培養(yǎng)3天，得到復(fù)合菌劑。
[0036]其中，在步驟I)中，所述固體培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaC15g/L,瓊脂15g/L,去離子水1000ml,滅菌。
[0037]在步驟3)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:糖蜜15 %，玉米漿2 %，MgSO40.05% , K2HPO40.15% , NaCl0.1%，葡萄糖 1.5%0
[0038]實(shí)施例2
[0039]一種用于低溫堆肥的復(fù)合菌劑，組成:
[0040]假單胞菌屬B6-15 5.0X 1010cfu/mL ；
[0041 ]假單胞菌屬 B5-16 4.5 X 1010cfu/mL ；
[0042]兩種菌株的總含量范圍值為9.0X IOic1-L OX 1012cfu/mL。[0043]上述復(fù)合菌劑的制備方法，包括如下步驟:
[0044]I)斜面培養(yǎng):將B6-15，B5-16原始菌種無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基上，在20°C條件下培養(yǎng)I天，活化菌株；
[0045]2) 一級種子培養(yǎng):將步驟I)活化的菌種無菌條件下分別接種于NR液體培養(yǎng)基，在20°C條件下，通氣量1:1.2，160r/min搖床培養(yǎng)I天，制得一級種子液；
[0046]3)混合發(fā)酵培養(yǎng):將步驟2) —級種子液B6-15，B5-16按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5%接種到發(fā)酵罐中，培養(yǎng)3天，得到復(fù)合菌劑。
[0047]其中，在步驟I)中，所述固體培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaC15g/L,瓊脂15g/L,去離子水1000ml,滅菌。
[0048]在步驟3)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:糖蜜15 %，玉米漿2 %，MgSO40.05% , K2HPO40.15% , NaCl0.1%，葡萄糖 1.5%0
[0049]實(shí)施例3
[0050]一種用于低溫堆肥的復(fù)合菌劑，組成:
[0051]假單胞菌屬B6-15 2.0X10ncfu/mL ；
[0052]假單胞菌屬B5-16 1.5X10ncfu/mL ；
[0053]兩種菌株的總含量范圍值為3.0X 10n-2.0X 1012cfu/mL。
[0054]上述復(fù)合菌劑的制備方法，包括如下步驟: [0055]I)斜面培養(yǎng):將B6-15, B5-16原始菌種無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基上,在20°C條件下培養(yǎng)I天，活化菌株；
[0056]2) 一級種子培養(yǎng):將步驟I)活化的菌種無菌條件下分別接種于NR液體培養(yǎng)基，在20°C條件下，通氣量1:1.2，160r/min搖床培養(yǎng)I天，制得一級種子液；
[0057]3)混合發(fā)酵培養(yǎng):將步驟2) —級種子液B6-15，B5-16按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5%接種到發(fā)酵罐中，培養(yǎng)3天，得到復(fù)合菌劑。
[0058]其中，在步驟I)中，所述固體培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaC15g/L,瓊脂15g/L,去離子水1000ml,滅菌。
[0059]在步驟3)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:糖蜜15 %，玉米漿2 %，MgSO40.05% , K2HPO40.15% , NaCl0.1%，葡萄糖 1.5%0
[0060]實(shí)驗(yàn)例I菌株生長情況考察
[0061]將假單胞菌屬B6-15、B5-16分別挑取一環(huán)接入50ml液體培養(yǎng)基中，于20°C的搖床，轉(zhuǎn)速為160r/min,培養(yǎng)24h制成種子液,然后各取Iml上述種子液接入100ml新鮮的液體培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)，于20°C、160r/min搖床中連續(xù)培養(yǎng)，每4h測定液體的OD6tltl值，結(jié)果見表1。
[0062]其中，牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaC15g/L，去離子水1000ml,滅菌備用。
[0063]表1復(fù)合菌劑生長的0D_值
[0064]
[Oh [4h [8h [l2h~[l6h [20h~[24h
OD600 fl 0 02 TTo~~L9~272 ?79~179[0065]如表1所示，復(fù)合菌劑在20°C環(huán)境中可較快生長，于20h基本達(dá)到穩(wěn)定期。
[0066]實(shí)驗(yàn)例2復(fù)合菌劑在傳代過程中的穩(wěn)定性及pH變化
[0067]將實(shí)施例1-3復(fù)合菌劑按I %的接種量接種于裝有滅好菌NR培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，20°C條件下傳代培養(yǎng)24h得到第二代菌液；同理進(jìn)行第三次傳代培養(yǎng)。共傳代20次，分別測定傳代過程中0D_值及pH，結(jié)果見表2、表3。
[0068]表2復(fù)合菌劑的穩(wěn)定性
[0069]
【權(quán)利要求】
1.一種用于低溫堆肥的復(fù)合菌劑，其特征在于，由下述菌株組成: 假單胞菌屬 B6-151.0X IO10 ~L OX 1012cfu/mL ； 假單胞菌屬 B5-161.0X IO10 ~L OX 1012cfu/mL ；
總菌數(shù)為 2.0X10lcl-2.0X1012cfu/mLo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合菌劑，其特征在于，由下述菌株組成:
假單胞菌屬 B6-15 2.6 X 101° ~ 20.0X 1010cfu/mL ； 假單胞菌屬 B5-16 1.8X 101° ~15.0X 101Qcfu/mL。
3.權(quán)利要求1或2所述復(fù)合菌劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: O斜面培養(yǎng):將B6-15，B5-16原始菌種無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基上，在15-25°C條件下培養(yǎng)1-2天，活化菌株； 2)一級種子培養(yǎng):將步驟I)活化的菌種無菌條件下分別接種于NR液體培養(yǎng)基，15-25°C搖床培養(yǎng)1-2天，制得一級種子液； 3)混合發(fā)酵培養(yǎng):將步驟2)—級種子液B6-15，B5-16接種到發(fā)酵罐中在20°C條件下混合培養(yǎng)3-5天，得到復(fù)合菌劑。
4.根據(jù) 權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，在步驟I)中，所述固體培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaC15g/L，瓊脂15g/L，去離子水1000ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，在步驟2)中，所述NR液體培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaC15g/L，去離子水1000ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，在步驟2)中，所述搖床培養(yǎng)條件為:通氣量 I:1-1.2，150-200r/min。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，在步驟3)中，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:糖蜜 15%，玉米漿 2%, MgSO40.05%, K2HPO40.15%, NaCl0.1%，葡萄糖 1.5%0
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，在步驟3)中，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1_10%。
9.權(quán)利要求1或2所述復(fù)合菌劑在低溫堆肥中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/20GK103540548SQ201310488121
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月17日
【發(fā)明者】郄晶晶, 李季, 彭生平, 任莉 申請人:北京沃土天地生物科技有限公司