一種提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶比酶活及活化效率的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的比酶活及活化效率的方法，在谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶C端插入融合蛋白中常用的連接肽，上述連接肽的基因序列設(shè)計在引物上，利用定點突變技術(shù)插入到前導肽C端，其優(yōu)選GS或PT。采用本發(fā)明提供的方法在不改變谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶分泌效率的前提下，顯著提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的比酶活，具有重要的意義。此外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)使用本發(fā)明提供的短肽能顯著提高TGase前導肽切割效率，縮短反應時間2/3。
【專利說明】一種提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶比酶活及活化效率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶比酶活及活化效率的方法，特別是一種通過使用短肽提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶比酶活及活化效率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(蛋白質(zhì)-谷氨酸-谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，MicrobialTransglutaminase, EC2.3.2.13簡稱MTG)能夠催化蛋白質(zhì)肽鏈中谷氨酰胺殘基的Y-羧酰胺基與賴氨酸ε-酰基或其他?；磻纬搔臺( Y-谷氨?；?賴氨酸共價鍵。特殊的催化能力使TGase廣泛應用于食品工程、紡織與皮革加工、材料工程、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。但由于MTG異源表達分泌量低等缺陷，限制了 MTG的應用范圍。
[0003]前導肽C端雖非TGase必需區(qū)域，但可影響TGase分泌和催化活性。目前TGase的改造限于成熟酶分子內(nèi)部，忽略了前導肽對TGase催化性能的影響。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，共表達TGase前導肽和成熟酶可以實現(xiàn)TGase在E.coli中的活性表達,但TGase不能夠分泌到胞外。共表達結(jié)果表明，前導肽和成熟酶之間的共價連接對TGase折疊沒有影響，但是促進TGase分泌的必要條件。因此,為不影響pro_TGase分泌,又可改善TGase酶學性質(zhì)，在不影響前導肽和成熟酶共價相連前提下，選取前導肽C端為改造區(qū)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的問題提供一種提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的比酶活的方法，在谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶C端插入融合蛋白中常用的連接肽。
[0005]所述連接肽的基因序列設(shè)計在引物上，利用定點突變技術(shù)插入到前導肽C端。
[0006]所述連接肽優(yōu)選GS或PT，插入位點選定在前導肽切割位點(L53-F54)前，即L53之前。
[0007]谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活力的測定方法:
[0008]比色法測定酶活:以N- a -CBZ-GLN-GLY為作用底物，L-谷氨酸-Y單羥胺酸做標準曲線。I個單位谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶活定義為:37°C時每分鐘催化形成lymol L-谷氨酸-Y單羥胺酸的酶量(U/mL)。
[0009]試劑A:1OOmg 的 N a -CBZ-GLN-GLY 溶解于 2mL0.2moL/L 的 NaOH 溶液中，加入0.2mol/L pH6.0 的 Tris-HC 緩沖液 4mL，0.lmol/L 羥胺 2mL，0.01mol/L 的還原型谷胱甘肽2mL,并調(diào)節(jié)pH至6.0。
[0010]試劑B:3mol/L 的 HCL, 12%TCA, 5%FeCL3 按 1:1:1 混合。
[0011 ] 配制0-4 μ mol/mL的L-谷氨酸-Y -單異羥肟酸標準溶液。取ImL試劑A與0.4mL不同濃度的L-谷氨酸-Y -單異羥肟酸標準溶液混合，37°C水浴10分鐘。加0.4mL試劑B終止反應，在525nm比色，繪制出標準曲線。以0.4mL經(jīng)適當稀釋的酶液代替標準溶液，在相同條件下保溫和比色，從標準曲線求出酶活。以100°C加熱10分鐘的離心后的上清液為空白。[0012]酶活力(u/mL)= (6.8548 X 0D525-0.0164) X 稀釋倍數(shù)
[0013]采用本發(fā)明提供的方法在不改變谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶分泌效率的前提下，顯著提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的比酶活，具有重要的意義。此外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)使用本發(fā)明提供的短肽能顯著提高TGase前導肽切割效率，縮短反應時間2/3。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1突變體及其表達
[0015]a: pro-TGase結(jié)構(gòu)示意圖及插入短肽位序列；b:野生酶及突變酶胞外蛋白電泳；c:野生酶及突變酶全細胞蛋白電泳；0:野生酶；1:pro-52GG ；2:pro_52GGG ；3:pro-52GGGG ；4:pro-52GS ；5:pro-52PT:M:蛋白質(zhì)標準分子量
[0016]圖2SDS-PAGE 分析純化 TGase
[0017]I:WT ；2:pro-52GG ；3:pro-52GGG ；4:pro-52GGGG, 5:pro-52GS,4:pro-52PT
[0018]圖3突變酶pro_52GS和pro_52PT活化過程
[0019].:WT ；▲:pro-52GS ；:pro-52GS
[0020]圖4蛋白電泳檢測突變酶pro_52GS和pro_52PT活化過程
[0021]a:野生酶；b:pro-52GS ；c:pro_52PT
[0022]圖5前導肽突變酶 結(jié)構(gòu)模擬
[0023]a:野生酶；b:pro-52GGG ；c:pro-52GS ；d:pro-52-PT
【具體實施方式】
[0024]培養(yǎng)基
[0025]LB 培養(yǎng)基:胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaC110g/L，ρΗ7.0 ；
[0026]TB 培養(yǎng)基:蛋白胨 12g/L，酵母膏 24g/L，甘油 8g/L，17mmol/L KH2PO4, 7 2mmo I/LK2HPO4。
[0027]實施例1:吸水鏈霉菌來源MTG晶體結(jié)構(gòu)模擬
[0028]以已報道的S.mobaraensis pro-TGase (PDB code: 3IU0)為模板(兩者氛基酸相似度為73.1%)，利用在線模擬軟件SWISS-M0DEL，模擬S.hygroscopicus TGase的晶體結(jié)構(gòu)。
[0029]實施例2:突變體的獲得
[0030]將短肽的基因序列設(shè)計在引物上，利用定點突變技術(shù)插入到前導肽C端。以
S.hygroscopicus pro-TGase表達質(zhì)粒pBBl-1011為模板(在前期研究中，本研究室篩選出一株新的產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的菌株(Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062),通過基因克隆方法，得到了 MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的啟動子和終止子(Genbank:EU477523)，具體文獻為 Liu S，Zhang D, Wang M, Cui W，Chen K, Liu Y, Du G, ChenJ, Zhou Z(2011)The pro-region of Streptomyces hygroscopicus transglutaminaseaffects its secretion by Escherichia col1.FEMS Microbiol Lett324(2):98-105),進行全質(zhì)粒PCR。引物如表 1所示，由上海生工生物工程公司合成。其中引物Pro-52-R是構(gòu)建所有突變酶的下游引物，而其余引物為構(gòu)建對應突變酶的上游引物，對應的突變體命名見表1。[0031]表1
【權(quán)利要求】
1.一種提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的比酶活及活化效率的方法，其特征在于在谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶C端插入融合蛋白中常用的連接肽。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述連接肽的基因序列設(shè)計在引物上，利用定點突變技術(shù)插入到前導肽C端。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述連接肽優(yōu)選GS或PT。
4.權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于插入位點選定在前導肽切割位點L53-F54前，即L53之前 。
【文檔編號】C12N9/10GK103540574SQ201310428806
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月25日
【發(fā)明者】陳堅, 王廣圣, 陳康康, 劉松, 堵國成 申請人:江南大學