基于單分子靶向測(cè)序技術(shù)檢測(cè)egfr/kras/braf基因突變位點(diǎn)的探針、方法、試劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種基于單分子靶向測(cè)序技術(shù)檢測(cè) EGFR/KRAS/BRAF基因突變位點(diǎn)的探針、方法、試劑及其應(yīng)用，以及一種無創(chuàng)檢測(cè)基因突變位 點(diǎn)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR)是位于7號(hào)染色 體短臂上的原癌基因 C-erbB-l(HER-l)的表達(dá)產(chǎn)物，是表皮生長(zhǎng)因子受體家族(HER)中的4 個(gè)成員之一，HER家族在細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的突變 主要發(fā)生在18~21號(hào)外顯子，其中19和21號(hào)外顯子突變占總突變的90% AGFR信號(hào)傳導(dǎo)的 異常是導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生的原因。研究表明，EGFR在多種腫瘤中都有表達(dá)，如結(jié)直腸癌、乳 腺癌、胰腺癌、前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌等。
[0003] K-ras基因是一種原癌基因，長(zhǎng)約35kb，位于12號(hào)染色體短臂上，是ras基因家族成 員之一，編碼KRAS蛋白。K-ras基因常見的突變位點(diǎn)位于2號(hào)外顯子的12號(hào)密碼子和13號(hào)密 碼子上、3號(hào)外顯子的61號(hào)密碼子，其中有7個(gè)突變熱點(diǎn):G12C、G12R、G12S、G12V、G12D、G12A、 G13V/D，占 K-ras基因總突變的98%以上。研究表明體細(xì)胞K-ras基因突變與多種人類惡性 腫瘤，如肺癌、白血病、黏蛋白腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌有關(guān)，而生殖細(xì)胞K-ras基因突變與努 南綜合征和心臟-面部-皮膚(cardi〇-facio_cutaneous，CFC)綜合征相關(guān)。
[0004] BRAF基因是一種原癌基因，定位于7號(hào)染色體上，編碼絲/蘇氨酸特異性激酶。約 90%的BRAF基因突變發(fā)生在外顯子15的1799位核苷酸上，T突變?yōu)锳，導(dǎo)致纈氨酸被谷氨酸 取代(V600E)』RAF基因突變?cè)诤谏亓?、結(jié)直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肉瘤、卵巢癌、乳腺癌以及 肺癌等腫瘤細(xì)胞系中的發(fā)生率依次為59%、18%、11%、9%、14%、2%、3%;此外，81^? V600E在甲狀腺乳頭狀癌中的發(fā)生率高達(dá)35.8% ARAF基因突變是晚期及復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌 最重要的預(yù)后指標(biāo)之一，與患者較差的總體生存期密切相關(guān)。
[0005] 目前常見的檢測(cè)這三個(gè)基因突變的方法有Sanger測(cè)序法和熒光定量PCR法。 Sanger測(cè)序法中，單對(duì)引物可檢測(cè)多個(gè)突變，但對(duì)多個(gè)基因、或同一基因的不同外顯子上的 突變位點(diǎn)就需分別進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，操作繁瑣，并且靈敏度較低約20%，假陰性率較高。熒光 定量PCR法雖然靈敏度高，但每對(duì)引物只能檢測(cè)一種突變，且每種突變需單獨(dú)建立一個(gè)PCR 反應(yīng)體系，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本多個(gè)突變位點(diǎn)操作繁瑣。這兩種方法對(duì)樣本的需要量都較大， 不適合同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因突變位點(diǎn)。
[0006] 高通量測(cè)序法(NGS)雖然靈敏度高，同時(shí)可檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)，但其建庫流程復(fù) 雜，操作繁瑣，時(shí)間長(zhǎng)，成本高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于此，本發(fā)明提供了一種基于單分子靶向測(cè)序技術(shù)檢測(cè)EGFR/KRAS/BRAF基因突 變位點(diǎn)的探針、方法和應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種用于單分子靶向測(cè)序的樣品的制備方法。
[0008] 第一方面，本發(fā)明提供了 一種基于單分子靶向測(cè)序技術(shù)檢測(cè)EGFR/KRAS/BRAF基因 突變位點(diǎn)的探針，包括檢測(cè)EGFR、KRAS和BRAF基因中一個(gè)或多個(gè)基因的突變位點(diǎn)的一條或 多條探針，所述探針的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1~SEQ ID N0:16所示序列中的一條或多 條。
[0009] 具體地，如SEQ ID NO: 1~SEQ ID N0:16所示探針如下表1所示。
[0010]表1·SEQIDN0:1~SEQIDN0:16所示探針
[0011]
[0012] 具體地，具有SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2所示序列的探針用于檢測(cè)EGFR基因的外 顯子18區(qū)域的突變位點(diǎn)；具體地，具有SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4所示序列的探針用于檢測(cè) EGFR基因的外顯子19區(qū)域的突變位點(diǎn)；具體地，具有SEQ ID N0:5~SEQ ID N0:8所示序列 的探針用于檢測(cè)EGFR基因的外顯子20區(qū)域的突變位點(diǎn)；具體地，具有SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10所示序列的探針用于檢測(cè)EGFR基因的外顯子21區(qū)域的突變位點(diǎn)；具體地，具有SEQ ID N0:11、SEQ ID NO: 12所示序列的探針用于檢測(cè)KRAS基因的外顯子2區(qū)域的突變位點(diǎn)；具體 地，具有SEQ ID NO: 13、SEQ ID N0:14所示序列的探針用于檢測(cè)KRAS基因的外顯子3區(qū)域的 突變位點(diǎn)；具體地，具有SEQ ID N0:15、SEQ ID勵(lì)：16所示序列的探針用于檢測(cè)81^?基因的 外顯子15區(qū)域的突變位點(diǎn)。
[0013] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述SEQ ID NO: 1~SEQ ID N0:16任一所示序列的5'端連 接有-(CH2)n-p〇ly(T)m-、-p 〇ly(T)m-或 _(CH2)n_，其中，n、m為自然數(shù)。
[0014]優(yōu)選地，η為6-10的自然數(shù)。
[0015] 優(yōu)選地逆為10-30的自然數(shù)。
[0016] 優(yōu)選地，n、m均為10。
[0017] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述的多條探針檢測(cè)EGFR、KRAS和BRAF基因中任意兩個(gè)或 三個(gè)基因的突變位點(diǎn)；其中，所述EGFR基因的突變位點(diǎn)位于:EGFR基因的外顯子18~外顯子 21區(qū)域中的至少一個(gè);所述KRAS基因的突變位點(diǎn)位于:KRAS基因的外顯子2~外顯子3區(qū)域 中的至少一個(gè);所述BRAF基因的突變位點(diǎn)位于:BRAF基因的外顯子15區(qū)域。
[0018] 優(yōu)選地，所述多條探針為SEQ ID NO: 1~SEQ ID N0:16所示的核苷酸序列組成的 探針組。
[0019] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的，若摸索的檢測(cè)探針（比如，SEQ ID N0:1~SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列組成的探針組)獲得了較佳的雜交效果，一般情況下，設(shè)計(jì)探針的 時(shí)候，適當(dāng)?shù)膶⑻结樈M中任一一條探針序列的長(zhǎng)度延長(zhǎng)或截短〇~3個(gè)堿基，也可以獲得不 錯(cuò)的檢測(cè)效果，也應(yīng)納入本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0020]第二方面，本發(fā)明提供了一種用于單分子靶向測(cè)序的樣品的制備方法，包括:通過 封阻反應(yīng)在待測(cè)DNA片段的3 '端修飾雙脫氧核糖核酸，獲得3 '端修飾有雙脫氧核糖核酸的 待測(cè)DNA片段;其中，封阻反應(yīng)中，脫氧核糖核酸與待修飾的DNA片段的摩爾比為1: 25~1: 200 〇
[0021]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述的在待測(cè)DNA片段選自PCR產(chǎn)物、片段化的基因組DNA或 經(jīng)純化的血液中的游離DNA。
[0022] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述的PCR產(chǎn)物為采用多重PCR引物擴(kuò)增待測(cè)樣品所得的多 重PCR產(chǎn)物，其中，所述的多重PCR引物為引物組，所述引物組中各引物的核苷酸序列為SEQ ID N0:17~SEQ ID N0:30所示。
[0023] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述的雙脫氧核糖核酸修飾有光學(xué)檢測(cè)標(biāo)記。
[0024]可以理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用任一常規(guī)的方法在待測(cè)DNA片段的上修 飾雙脫氧核糖核酸；比如，可參照二代高通量測(cè)序文庫構(gòu)建方法中加 A的方法進(jìn)行DNA片段 的封阻;相比之下，本發(fā)明后續(xù)實(shí)施例中采用的封阻方法更佳，因?yàn)榧幢闶菍?duì)于對(duì)片段化的 基因組進(jìn)行封阻，本發(fā)明后續(xù)實(shí)施例中采用的封阻方法也不需要進(jìn)行末端補(bǔ)平即可直接進(jìn) 行封阻反應(yīng)，操作非常簡(jiǎn)便。更優(yōu)選地，可采用Terminal Transferase Kit(NEB，M0315L)或 等同的試劑體系進(jìn)行封阻反應(yīng)。更進(jìn)一步地，本申請(qǐng)人對(duì)該商用試劑盒的封阻反應(yīng)條件進(jìn) 行多次優(yōu)化，摸索出較佳的對(duì)DNA片段的3 '端修飾雙脫氧核糖核酸的封阻反應(yīng)條件，當(dāng)脫氧 核糖核酸與待修飾的DNA片段的摩爾比為1:100時(shí)，封阻效率可達(dá)到98%以上；而即使在該 摩爾比為1:25~1:200時(shí)，封阻效率仍然可達(dá)到70%~9%以上。
[0025]相比現(xiàn)有二代測(cè)序文庫的制備，本發(fā)明第二方面提供了的用于單分子靶向測(cè)序的 樣品的制備方法所獲得的3'端修飾有雙脫氧核糖核酸的待測(cè)DNA片段，可直接用于單分子 靶向測(cè)序，與5'端連接到基底表面的靶向引物進(jìn)行雜交，進(jìn)行測(cè)序反應(yīng);而不需要進(jìn)行添加 測(cè)序接頭(adaptor)等步驟，極大簡(jiǎn)化了測(cè)序樣品文庫的制備步驟。
[0026] 第三方面，本發(fā)明提供了 一種基于單分子靶向測(cè)序技術(shù)檢測(cè)EGFR/KRAS/BRAF基因 突變位點(diǎn)的方法，包括如下步驟：
[0027] (i)將靶向引物的5'端連接到基底表面;其中，所述的靶向引物為本發(fā)明第一方面 所述的探針；
[0028] (ii)提供或制備待測(cè)模板核酸，其中，所述的待測(cè)模板核酸的3'端修飾有帶光學(xué) 檢測(cè)標(biāo)記的雙脫氧核糖核酸;將所述待測(cè)模板核酸與所述步驟(i )中連接到基底表面上的 靶向引物進(jìn)行雜交，形成雜交的靶向引物/模板核酸復(fù)合物；
[0029] (i i i)對(duì)所述靶向引物/模板核酸復(fù)合物進(jìn)行成像；
[0030] (iv)將所述靶向引物/模板核酸復(fù)合物、聚合酶以及一種或多種帶光學(xué)檢測(cè)標(biāo)記 的核苷酸混合，通過聚合酶反應(yīng)將一種或多種帶光學(xué)檢測(cè)標(biāo)記的核苷酸添加至靶向引物鏈 的3'端;獲得延伸產(chǎn)物;其中，所述帶光學(xué)檢測(cè)標(biāo)記的核苷酸還具有可斷裂的基團(tuán)；
[0031] (V)對(duì)延伸后的靶向引物/模板核酸復(fù)合物進(jìn)行成像，并結(jié)合步驟（iii)中靶向引 物/模板核酸復(fù)合物的定位結(jié)果，進(jìn)行圖像比對(duì)和糾偏，以鑒定模板核酸上的待測(cè)核苷酸序 列；
[0032] (vi)除去延伸產(chǎn)物上帶光學(xué)檢測(cè)標(biāo)記的核苷酸的可斷裂的基團(tuán)：
[0033] (vi i)重復(fù)步驟(iii)至(vi)-次或多次以鑒定所述模板核酸中的1個(gè)或多個(gè)核苷 酸。
[0034] 本發(fā)明通過延伸反應(yīng)、成像檢測(cè)和切除光學(xué)檢測(cè)標(biāo)記分子的反復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)單分 子靶向測(cè)序技術(shù)(SMTS)實(shí)時(shí)測(cè)序。
[0035]如本發(fā)明所述的，所述的"待測(cè)DNA片段"與"待測(cè)模板核酸"可以互換。
[0036]可以理解的是，可采用本領(lǐng)域常規(guī)的探針固定方法將本發(fā)明第一方面的探針序列 (即所述步驟(i)中的靶向引物)的5'端連接到基底表面。但申請(qǐng)人在研究過程中發(fā)現(xiàn)，不同