一種植物耐錳毒害重要基因ShMDH1的克隆及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個促進植物耐錳毒害的關鍵基因ShMDH1的克隆及其應用。該ShMDH1的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所編碼蛋白質的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。ShMDH1基因調控了柱花草蘋果酸的合成與分泌，對增強植物的耐錳能力具有重要作用。
【專利說明】—種植物耐錳毒害重要基因ShMDHI的克隆及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物【技術領域】，具體涉及耐錳毒害基因的克隆及其應用?！颈尘凹夹g】
[0002]世界上50%以上的潛在可耕作土壤為酸性土壤，主要分布在熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)(Kochian et al.，2004)。在酸性土壤中，除了缺磷和鋁毒外，錳毒害也是限制作物生長和產量的重要障礙因素(de Carvalho et al., 1980; Horst et al.,1988 ；Raghothama, 1999 ；Vance et al.，2003)。錳是植物生長必需的微量元素之一(Mukhopadhyay and Sharma, 1991)。但是,過量猛也會對植物造成毒害作用。猛毒害的癥狀一般表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)褐色錳氧化斑，葉綠素含量的降低、光合作用的減弱等癥狀，最終抑制植物的生長和產量(Horst et al., 1999; Millaleo et al., 2010)。
[0003]以往的研究表明植物在長期的進化和人工選育過程中，通過增加根系蘋果酸的合成與分泌，螯合根際中的鋁，鎳，銅和鋅等金屬元素，從而緩解金屬離子對植物生長的毒害作用(Yang et al., 1997; Parker et al., 2001; Sasaki et al., 2004; Delhaize etal., 2012)。前期通過在苜蓿和煙草中超量表達蘋果酸脫氫酶(MDH)基因，能夠提高轉基因植株根系蘋果酸的合成與分泌，有效地增強了轉基因植株的耐鋁能力(Tesfaye et al,,2001; Wang et al.，2010)，但是關于蘋果酸分泌及其耐錳毒害的機制鮮有報道。
[0004]柱花草起源于熱帶和亞熱帶地區(qū)，具有良好的營養(yǎng)價值和飼用價值，是優(yōu)質的豆科牧草(Liu et al., 1997)。柱花草對含有高錳濃度的酸性土壤具有良好的適應性，其可能通過調控植株體內基因表達，從而增強自身的耐猛能力(de Carvalho et al., 1980)。但是，控制柱花草耐錳毒害的關鍵基因尚未報道。
[0005]基于上述研究背景， 申請人:通過雙向電泳的方法，鑒定了一個錳毒害上調表達的蛋白，ShMDHl，而且克隆了編碼該蛋白的基因，該基因的表達受外源錳毒害的調控，與植物其它的蘋果酸脫氫酶有較高的相似性。在擬南芥和酵母中超量表達該基因，結果表明
基因編碼的蛋白具有調控蘋果酸合成與分泌的功能，最終提高轉基因株系耐錳毒害能力。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種蘋果酸脫氫酶基因ShMDHl，本I明的另一個目的是提供上述基因編碼的蛋白質，本發(fā)明的進一步目的是提供上述基因及其編碼的蛋白質的應用。
[0007]本發(fā)明上述目的通過以下技術方案予以實現(xiàn):
本發(fā)明所提供的蘋果酸脫氫酶基因可以來源于柱花草，其包含或具有選自如下的核苷酸序列:
(1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
(2)與(I)的核苷酸序列的互補序列在低等嚴格條件、中等嚴格條件、優(yōu)選高嚴格條件下雜交的核苷酸序列；
(3)與(I)的核苷酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、特別優(yōu)選至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的核苷酸序列；
(4)與(I)的核苷酸序列編碼相同氨基酸序列的蛋白質、但在序列上不同的核苷酸序
列；
(5)編碼如下氨基酸序列之一的核苷酸序列:SEQID NO:2所示的氨基酸序列，或者，由于一或多個(例如1-25個、1-20個，1-15個，1-10個，1-5個，1-3個)氨基酸殘基的替代、缺失和/或插入而與SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，與SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的氨基酸序列；
(6)(1)-(5)任何一個的核苷酸序列的活性片段；
(7)與(1)-(5)任何一個的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
[0008]SEQ ID NO:1由1038個堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為第1-1038位堿基，編碼具有序列SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述氨基酸序列組成的蛋白質在本發(fā)明中稱為ShMDHl 蛋白。
[0009]本發(fā)明提供的蘋果酸脫氫酶基因編碼的蛋白質，其包含或具有選自如下的氨基酸序列:
(1)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列；
(2)由于一或多個(例如1-25個、1-20個，1-15個，1-10個，1-5個，1-3個)氨基酸殘基的替代、缺失和/或插入而與SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列；
(3)與SEQID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、特別優(yōu)選至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的
氨基酸序列；
(4)(I)或⑵或(3)所述氨基酸序列的活性片段；
(5)本發(fā)明的多核苷酸分子編碼的氨基酸序列。
[0010]本發(fā)明提供的基因和蛋白質能夠調控包含它的轉基因生物體內蘋果酸的合成。
[0011]擴增上述基因全長或其任一片段的引物對屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0012]本發(fā)明還提供含有上述基因的表達載體，可用現(xiàn)有的植物表達載體構建含有ShMDHl基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體等，如pYLRNAi(由劉耀光研究員實驗室惠贈，具體描述見文獻:胡旭霞和劉耀光，2006，分子植物育種)或其它衍生植物表達載體。
[0013]本發(fā)明還提供一種基因工程菌，其含有上述的表達載體。
[0014]本發(fā)明還涉及細胞，其包含本發(fā)明的基因或重組載體。所述細胞可以是植物細胞，例如豆科植物細胞，或者微生物細胞，例如細菌或真菌細胞，例如酵母細胞。所述細胞可以是分離的、離體的、培養(yǎng)的、或者是植物的一部分。
[0015]本發(fā)明還涉及植物或者植物部分，植物材料，植物種子，其包含本發(fā)明的細胞。所述植物可以是豆科植物，例如柱花草和大豆，也可以是其它植物，例如單子葉植物如水稻、小麥、大麥、玉米、高粱、甘蔗、燕麥、或黑麥等，或者其他雙子葉植物如煙草、向日葵、甜菜、辣椒、馬鈴薯、番茄等。還涉及來自所述植物的轉基因種子。
[0016]本發(fā)明還涉及生產植物的方法，該方法包括:從本發(fā)明的植物細胞再生轉基因植物，或者將本發(fā)明的植物與另一植物雜交。
[0017]本發(fā)明還涉及本發(fā)明的方法生產的植物。
[0018]本發(fā)明還涉及本發(fā)明的基因或重組載體在調控植物蘋果酸合成中的用途，包括制備轉基因植物以及制備促進植物適應酸性土壤的制劑。
[0019]本發(fā)明還涉及調控植物適應酸性土壤的方法，該方法包括制備含有本發(fā)明的ShMDHl基因或重組載體的植物。例如，所述方法可以包括從本發(fā)明的植物細胞再生轉基因植物或者將本發(fā)明的植物與另一植物雜交。
[0020]本發(fā)明所提供的一個優(yōu)選 實施方案是將上述基因ShMDHl導入擬南芥和酵母細胞中，得到轉基因株系；所述轉基因株系的耐錳能力等高于所述目的對照植株和菌株。
[0021]所述基因可以例如是通過所述重組表達載體導入受體擬南芥和酵母細胞。
[0022]攜帶有本發(fā)明的基因ShMDHl的植物表達載體可通過例如農桿菌介導的轉化法轉化到擬南芥中，酵母表達載體可轉化到酵母細胞中。
[0023]本發(fā)明的優(yōu)點和效果:
1.纖ShMDHl所屬的蘋果酸脫氫酶家族在擬南芥、苜蓿、玉米和水稻等雖已被克隆及報道，但其在豆科牧草蘋果酸合成方面的生物學功能并不清楚。本發(fā)明克隆的基因ShMDHl對柱花草蘋果酸合成有顯著的影響，這對闡明蘋果酸合成和分泌在豆科牧草適應酸性土壤錳毒害的生物學功能有著重要意義。
[0024]2.基因ShMDHl不僅影響了蘋果酸的合成，超量表達該基因還增加了擬南芥和酵母細胞對錳毒的忍耐能力；該基因的功能研究對于解析豆科作物適應酸性土壤的分子機理有著深遠的研究意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1:水培試驗中不同錳濃度處理對柱花草生長的影響；A:圖中所示為不同錳濃度處理對柱花草葉綠素含量的影響；B:圖中所示為不同錳濃度處理對柱花草生物量的影響；C:圖中所示為不同錳濃度處理對柱花草葉部和根部錳濃度的影響；其中錳處理濃度分別為5 μΜ和400 μΜ ;試驗中每個處理設4個生物學重復，圖中柱子為4個生物學重復數(shù)據(jù)的平均值和標準誤差；*表示同一指標在同一基因型不同處理之間差異顯著，P〈0.05表示同一指標在同一基因型不同處理之間差異極顯著，0.001 <Ρ <0.01。
[0026]圖2:水培試驗中不同錳濃度處理對柱花草根系蘋果酸積累和分泌的影響；Α:不同錳濃度處理對柱花草根系內源蘋果酸濃度的影響；Β:不同錳濃度處理對柱花草根系蘋果酸分泌的影響；其中錳處理濃度分別為5 μΜ和400 μΜ;試驗中每個處理設4個生物學重復，圖中柱子為4個生物學重復數(shù)據(jù)的平均值和標準誤差；*表示同一指標在同一基因型不同處理之間差異顯著，P〈0.05 ;**表示同一指標在同一基因型不同處理之間差異極顯著，0.001 <Ρ〈0.01。
[0027]圖3 ,ShMDHl的亞細胞定位；圖3A_C為35S啟動子驅動的空載體對照洋蔥表皮質壁分離后的細胞:A為GFP熒光信號；B*PI信號；C為六和B的融合結果；D-F為ShMDHl-GFP在洋蔥表皮質壁分離后的細胞定位，D為ShMDHl-GFP熒光信號；E為PI信號；F為D和E的
融合結果。
[0028] 圖4:錳處理對基因在柱花草根系表達的調控；圖中數(shù)據(jù)為4個生物學重復的平均值和標準誤差；*號表示同一指標在不同處理之間的差異顯著，/7〈0.05。
[0029] 圖5 '
【權利要求】
1.一個植物耐錳毒害關鍵基因其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所/Jn o
2.—種權利要求1所述的編碼的蛋白質，其特征在于其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
3.一種表達載體，其特征在于含有權利要求1所述耐錳毒基因
4.一種基因工程菌，其特征在于含有權利要求3所述的表達載體。
5.權利要求1所述耐錳毒基因ShMDHl在制備轉基因植物中的應用。
6.權利要求1所述耐錳毒基因ShMDHl在制備促進植物適應酸性土壤制劑或提高植物錳耐受力上的應用。
7.權利要求3所述的表達載體在制備轉基因植物中的應用。
8.權利要求3所述的表達載體在制備促進植物適應酸性土壤的制劑或提高植物錳耐受力上的應用。
9.根據(jù)權利要求5-8中任一項所述的應用，其特征在于所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
10.根據(jù)權利要求9所述 的應用，其特征在于所述雙子葉植物為豆科植物、煙草、向日葵、甜菜、辣椒、馬鈴薯或番茄；所述的單子葉植物為水稻、小麥、大麥、玉米、高粱、甘蔗、燕麥或黑麥。
【文檔編號】C12N15/29GK103525825SQ201310290864
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年7月11日 優(yōu)先權日:2013年7月11日
【發(fā)明者】田江, 廖紅, 陳志堅 申請人:華南農業(yè)大學