半胱氨酸蛋白酶抑制劑s的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了半胱氨酸蛋白酶抑制劑S（CystatinS）的新用途，具體為CystatinS在制備診斷和預(yù)示肝癌、胃腸間質(zhì)瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌標(biāo)志物中的應(yīng)用；本發(fā)明還公開(kāi)了診斷和預(yù)示肝癌、胃腸間質(zhì)瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌標(biāo)志物的捕獲劑，并將捕獲劑用于制備診斷和預(yù)示肝癌、胃腸間質(zhì)瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌的試劑盒，制得的試劑盒具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠用于肝癌、胃腸間質(zhì)瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌的早期診斷、治療過(guò)程中的療效評(píng)估以及治療后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。
【專利說(shuō)明】半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)理研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)Cystatin家族作為組織蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶的內(nèi)源性抑制劑，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著非常重要的作用。研究結(jié)果顯示，Cystatin家族成員在不同腫瘤中的表達(dá)水平有所上升,例如CystatinC在卵巢癌和頭頸部癌癥中的表達(dá)有不同水平的上升，stefin A在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)水平有所增加，Cystatin F在多種腫瘤中的表達(dá)水平都有顯著增加，很可能是由于在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中需要組織蛋白酶的參與，先誘導(dǎo)其表達(dá)量增加，再激活機(jī)體本身的應(yīng)激機(jī)制，導(dǎo)致Cystatin的表達(dá)量上升以抑制過(guò)里量的組織蛋白酶活性。但Cystatin的表達(dá)量并不與腫瘤的發(fā)展呈正相關(guān)，例如在膠質(zhì)瘤中，Cystatin C的低表達(dá)意味著疾病的晚期，患者的生存期較短，且易于復(fù)發(fā)，這可能是到了腫瘤的后期階段，會(huì)有一些其他的機(jī)制對(duì)Cystatin的水平進(jìn)行調(diào)控，以促進(jìn)腫瘤的進(jìn)一步惡化。
[0003]半胱氨酸蛋白酶抑制劑S (Cystatin S)是人類(lèi)Cystatin家族成員，由CST4基因編碼的含141個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為16.4Kda。Cystatin S分子中含有兩個(gè)二硫鍵，為典型的分泌蛋白，分布于體液和分泌物中，如眼淚、唾液、血清、血漿等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CST4在胃癌組織中的表達(dá)量高于正常胃粘膜組織，在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)部位與胃癌組織較一致，且表達(dá)率隨細(xì)胞系的分化程度降低而降低。臨床資料分析表明，CST4的表達(dá)與浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及腫瘤分期(!TM分析)相關(guān)；生存分析表明，CST4表達(dá)陽(yáng)性患者的5年生存率顯著高于無(wú)表達(dá)組；Cox回歸分析表明，CST4是一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因子；從而提示CST4可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮類(lèi)似腫瘤抑制因子的作用。但迄今為止，CST4可用于胃癌的療效評(píng)估、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控未見(jiàn)報(bào)道，同時(shí)也未見(jiàn)CST4與其他疾病如胰腺癌、食管癌、肝癌和胃腸間質(zhì)瘤等相關(guān)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因編碼的Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽在制備診斷和預(yù)示肝癌、胃腸間質(zhì)瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌標(biāo)志物中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之二在于提供肝癌、胃腸間質(zhì)瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌標(biāo)志物的捕獲劑；本發(fā)明的目的之三在于提供含有上述捕獲劑的試劑盒。
[0005]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
1.CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因編碼的Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽在制備診斷和預(yù)示肝癌、胃腸間質(zhì)瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌標(biāo)志物中的應(yīng)用，所述CST4基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006] 優(yōu)選的，所述CST4基因截短片段是以SEQ ID N 0.2、5所示核苷酸序列為上游引物，SEQ ID N 0.3、6所示核苷酸序列為下游引物擴(kuò)增所得的核苷酸序列，所述SEQ ID N0.2與 SEQ ID N0.3 配對(duì)，所述 SEQ ID N0.5 與 SEQ ID N0.6 配對(duì)。
[0007]優(yōu)選的，所述CST4基因編碼的Cystatin S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所
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[0008]優(yōu)選的，所述診斷和預(yù)示為診斷、療效評(píng)估或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。
[0009]2.肝癌、胃腸間質(zhì)瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌標(biāo)志物的捕獲劑，所述標(biāo)志物為CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因編碼的CystatinS蛋白或Cystatin S多肽，所述CST4基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010]優(yōu)選的,所述捕獲劑為識(shí)別Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽的特異性抗體。
[0011]優(yōu)選的，所述捕獲劑為檢測(cè)CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA或CST4基因的截短片段的特異引物和探針。
[0012]優(yōu)選的，所述特異引物如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示。
[0013]3.含有所述捕獲劑的試劑或試劑盒。
[0014]優(yōu)選的，所述試劑盒為CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA或CST4基因截短片段實(shí)時(shí)定量檢測(cè)試劑盒，其上游引物如SEQ ID N0.5，下游引物SEQ ID N0.6所示，探針的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示；或，
所述試劑盒為Cystatin S酶聯(lián)免疫檢測(cè)檢測(cè)試劑盒,包括包被有單克隆抗體的固相載體、生物素標(biāo)記的多克隆抗體和顯色底物。
[0015]更優(yōu)選的，所述單克隆抗體為鼠抗人Cystatin S單克隆抗體，所述多克隆抗體為兔抗人Cystatin S多克隆抗體，所述顯色底物為四甲基聯(lián)苯胺。
[0016]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開(kāi)了 CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因編碼的Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽作為檢測(cè)肝癌、胃腸間質(zhì)瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌的標(biāo)志物，并公開(kāi)了檢測(cè)上述標(biāo)志物的捕獲劑，將捕獲劑與常規(guī)試劑組成檢測(cè)試劑盒，獲得的試劑盒具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠用于肝癌、胃腸間質(zhì)瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌的早期診斷，利用試劑盒的診斷結(jié)果可早于臨床癥狀，同時(shí)還可以用于治療過(guò)程的療效評(píng)估和治療后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
圖1為重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
[0018]圖2為CST4基因的mRNA絕對(duì)定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胰腺癌ROC曲線。
[0019]圖3為CST4基因的mRNA絕對(duì)定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)食管癌ROC曲線。
[0020]圖4為CST4基因的mRNA絕對(duì)定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肝癌ROC曲線。
[0021]圖5為CST4基因的mRNA絕對(duì)定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胃腸間質(zhì)瘤ROC曲線。
[0022]圖6為CST4基因的mRNA絕對(duì)定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胃癌ROC曲線。
[0023]圖7為Cystatin S酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Cystatin S蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0024]圖8為Cystatin S酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胰腺癌ROC曲線。
[0025]圖9為Cystatin S酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)食管癌ROC曲線。[0026]圖10為Cystatin S酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肝癌ROC曲線。
[0027]圖11為Cystatin S酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胃腸間質(zhì)瘤ROC曲線。
[0028]圖12為Cystatin S酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胃癌ROC曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0030]本發(fā)明使用的試劑如下:Taq DNA聚合酶購(gòu)自羅氏公司(貨號(hào)為:12032953001)；尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)購(gòu)自NEB公司；dNTPs購(gòu)自TAKARA公司；引物和探針由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成；Cystatin S單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司(貨號(hào)為:MAB1296);兔抗人Cystatin S多克隆抗體(貨號(hào)為:11542_RP02)、Cystatin S蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(貨號(hào)11542-H08H)購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司。
[0031]實(shí)施例1制備重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品
重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備，按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中的步驟及條件制備:
根據(jù)報(bào)道的CST4基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增CST4基因截短片段的引物(CST4基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示)，具體如下:
上游引物:5，- ctgcctctgaggagaccatggc-3’ (SEQ ID N0.2)；
下游引物:5，- ggcgatgctactgtttaattgcag-3’ (SEQ ID N0.3)。
[0032]以SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列為引物，人cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系:上、下游引物終濃度為250nM，Taq DNA聚合酶終濃度為IU/反應(yīng)；dNTPs終濃度為250 nM，其他試劑參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件為:37°C，2分鐘；95°C預(yù)變性5分鐘；95°C變性10秒，60°C退火并延伸30秒，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，獲得如SEQ IDN0.4所示的核苷酸序列。將擴(kuò)增獲得的序列連入PMD18-T載體中，得含CST4基因截短片段的重組質(zhì)粒，結(jié)構(gòu)如圖1所示。將含CST4基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5ci，篩選陽(yáng)性克隆，然后提取重組質(zhì)粒，作為標(biāo)準(zhǔn)品S。將重組質(zhì)粒分別稀釋至濃度為IO6Copy/μ L、105copy/μ L、IO4Copy/ μ L、2000copy/ μ L、500 copy/ μ L、250copy/ μ L 和 62.5copy/ μ L,并分別命名為標(biāo)準(zhǔn)品S1、標(biāo)準(zhǔn)品S2、標(biāo)準(zhǔn)品S3、標(biāo)準(zhǔn)品S4、標(biāo)準(zhǔn)品S5、標(biāo)準(zhǔn)品S6和標(biāo)準(zhǔn)品S7。
[0033]實(shí)施例2構(gòu)建CST4熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒
根據(jù)CST4基因序列設(shè)計(jì)定量檢測(cè)CST4基因、CST4基因的cDNA、CST4基因的mRNA或CST4基因截短片段的引物和探針，具體如下:
上游引物為:5’ -aacaaggccaccgaagatga-3’ (SEQ ID N0.5)；下游引物為:5，-ccacctctacgtcgaagaagta-3，(SEQ ID N0.6)；探針為:FAM_cccaaaggtctgctccctggctcgca-TAMRA (SEQ ID N0.7)。同時(shí)以人B2M基因?yàn)閮?nèi)控，并設(shè)計(jì)內(nèi)控基因的檢測(cè)引物和探針:上游引物為:5’ -actgaattcacccccactga-3’ (SEQ IDN0.8)；下游引物為:5’ -cctccatgatgctgcttaca-3’ (SEQ ID N0.9);探針為:FAM-tatgcctgccgtgtgaaccatgtgac- TAMRA (SEQ ID N0.10)。然后利用設(shè)計(jì)的引物和探針與其他常規(guī)試劑組成CST4熒光定量檢測(cè)試劑盒，試劑盒成分如表1所示。
[0034] 表1、CST4熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒
【權(quán)利要求】
1.CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因編碼的Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽在制備診斷和預(yù)示肝癌、胃腸間質(zhì)瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌標(biāo)志物中的應(yīng)用，所述CST4基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述CST4基因截短片段是以SEQIDN0.2、5所示核苷酸序列為上游引物，SEQ ID N0.3、6所示核苷酸序列為下游引物擴(kuò)增所得的核苷酸序列，所述SEQ ID N0.2與SEQ ID N0.3配對(duì)，所述SEQ ID N0.5與SEQ ID N0.6配對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述CST4基因編碼的CystatinS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.11所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述診斷和預(yù)示為診斷、療效評(píng)估或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。
5.肝癌、胃腸間質(zhì)瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌標(biāo)志物的捕獲劑，其特征在于:所述標(biāo)志物為CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因編碼的Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽,所述CST4基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的捕獲劑，其特征在于:所述捕獲劑為識(shí)別CystatinS蛋白或Cystatin S多肽的特異性抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的捕獲劑，其特征在于:所述捕獲劑為檢測(cè)CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA或CST4基因截短片段的特異引物和探針。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的捕獲劑，其特征在于:所述特異引物如SEQID N0.5和SEQID N0.6所示,所述探針的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示。
9.含有權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述捕獲劑的試劑或試劑盒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒為CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA或CST4基因截短片段實(shí)時(shí)定量檢測(cè)試劑盒，其上游引物如SEQ IDN0.5，下游引物SEQ ID N0.6所示，探針的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示；或， 所述試劑盒為Cystatin S酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒,包括包被有單克隆抗體的固相載體、生物素標(biāo)記的多克隆抗體和顯色底物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其特征在于:所述單克隆抗體為鼠抗人CystatinS單克隆抗體，所述多克隆抗體為兔抗人Cystatin S多克隆抗體，所述顯色底物為四甲基聯(lián)苯胺。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103911426SQ201310164671
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2013年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月7日
【發(fā)明者】王弢, 秦勇, 渠香云 申請(qǐng)人:上海良潤(rùn)生物醫(yī)藥科技有限公司