一種快速獲取鵝oaz1基因全長cds序列及快速檢測其表達規(guī)律的方法
【專利摘要】一種快速獲取鵝OAZ1基因全長CDS序列及快速檢測其表達規(guī)律的方法，包括以下步驟：提取鵝卵巢組織中的總RNA，然后將總RNA反轉錄為cDNA；分別以鳥類OAZ1和β-actin基因的保守區(qū)作為模板，設計OAZ1基因的全長CDS序列引物(OAZ1-L)，快速檢測OAZ1基因表達規(guī)律的OAZ1和β-actin熒光定量特異性引物；通過RT-PCR擴增反應，PCR產物的回收純化，DH5α感受態(tài)細胞的制備，目的基因的連接、連接產物的轉化，陽性菌落的篩選，菌液測序獲取全長OAZ1基因全長CDS序列，并測序鑒定所設計的熒光定量引物能特異性的擴增OAZ1和β-actin基因；然后再利用熒光定量PCR進一步鑒定，鑒定結果表明所建立的方法能快速、準確地檢測鵝機體中OAZ1基因的表達規(guī)律。
【專利說明】—種快速獲取鵝0AZ1基因全長CDS序列及快速檢測其表達規(guī)律的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一個鵝OAZl相關基因及其編碼蛋白的應用，特別涉及一種快速獲取鵝OAZl基因全長CDS序列及快速檢測其表達規(guī)律的方法。
【背景技術】
[0002]多胺是活細胞的必需組分，可以參與DNA復制，翻譯，轉錄和細胞凋亡等多種生理活動。細胞內缺乏多胺將抑制細胞的生長，而多胺水平過高則會導致癌癥的發(fā)生。鳥氨酸脫羧酶(Ornithine Decarboxylase, 0DC)是多胺合成的限速酶,在維持細胞多胺穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮重要作用。鳥氨酸脫羧酶抗酶(Ornithine Decarboxylase Antizyme, 0AZ)是由OAZ基因通過特殊的閱讀框移碼機制翻譯的蛋白質。目前已研究證實的OAZ基因家族的4個成員中 OAZl (Ornithine Decarboxylase Antizymel, 0AZ1)是調節(jié) ODC 活性的重要成員，可介導ODC被26S蛋白酶體降解并且能抑制多胺的轉運，負性調控細胞內多胺水平，從而使細胞內多胺濃度維持相對穩(wěn)定。OAZl還能通過介導Cyclin Dl和Cyclin El降解，抑制細胞周期。研究證實，在各種癌細胞中多胺水平均顯著高于正常水平，細胞的多胺含量與多胺的合成、分解和運輸相關，合理的調節(jié)這些途徑可以抑制腫瘤細胞的生長。而研究表明，OAZl可通過結合ODC并介導其降解來調節(jié)ODC活性，進而調節(jié)細胞內多胺水平，抑制腫瘤細胞生長。近年來研究表明，OAZl還可參與動物繁殖功能的調節(jié)。籽鵝卵巢組織中的OAZl的表達量顯著高于產蛋前期，提示OAZl能通過抑制多胺的生物合成來使卵泡發(fā)育處于靜止狀態(tài)。而我們前期研究表明產蛋期四川白鵝小黃卵泡中OAZl基因的表達量顯著高于Fl級卵泡，提示OAZl在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。綜上，OAZl是參與調節(jié)細胞內多胺代謝的關鍵酶，闡明OAZl基因的結構和功能，建立起OAZl基因表達規(guī)律的快速檢測方法具有重要理論意義和實際意義。
.[0003]分段克隆:將目的基因分成幾段來克隆，然后將所有分段的片段進行拼接，最終獲得完整的目的片段。在進行分段克隆時需要設計多對引物，且每對引物必須有重疊，在將所有片段克隆出來后還需進行一次PCR反應檢測所獲取的片段是否為目的片段。
[0004]快速擴增cDNA末端技術:RACE技術是基于PCR技術基礎之上，分別在cDNA序列的3’末端和5’末端設計特定引物，然后進行克隆，從而獲得cDNA全長序列的方法。
[0005]但是分段克隆和RACE技術都需要做許多次的PCR和克隆工作，操作過程繁瑣，工作量大，耗時長，且成本高。采用半定量反轉錄-聚合酶鏈式反應進行定量檢測時，其技術原理為PCR反應的終點法，因此只能在PCR反應結束時，獲得目的基因片段的拷貝數(shù)，不能了解定量過程中的準確變化，期間由于電泳操作的影響，會出現(xiàn)較大誤差，不能十分準確的檢測目的基因表達量。分段克隆和RACE技術都需要做許多次的PCR和克隆工作，操作過程繁瑣，工作量大，耗時長，且成本高。
[0006]半定量反轉錄-聚合酶鏈式反應:首先將mRNA反轉錄成cDNA，再進行PCR擴增，取等量的PCR產物在同一塊瓊脂糖凝膠上電泳檢測，然后采用生物信息學分析軟件來比較電泳圖中目的基因和內參基因條帶的光密度值，最后計算目的基因表達量(或拷貝數(shù))的定量檢測技術。
[0007]采用半定量反轉錄-聚合酶鏈式反應進行定量檢測時，其技術原理為PCR反應的終點法，因此只能在PCR反應結束時，獲得目的基因片段的拷貝數(shù)，不能了解定量過程中的準確變化，期間由于電泳操作的影響，會出現(xiàn)較大誤差，不能十分準確的檢測目的基因表達量。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明設計全長OAZl基因的引物，通過RT-PCR擴增直接可以獲取全長OAZl序列，一次PCR和克隆過程就可以獲得OAZl的全長⑶S區(qū)序列。相較于分段克隆和RACE技術，本方法大大的提高了試驗的簡便性，節(jié)省了試驗時間，也很大程度上的降低了試驗成本。
[0009]半定量法只能通過最終產物的電泳圖來判斷是否表達，表達量的高低，相當于終點法，這其中還有很多人為影響因素，特別是在進行凝膠電泳的時候加樣量是否準確。而本發(fā)明采取SYBR-Green染料法進行QRT-PCR檢測，設計特異性強的熒光定量PCR引物。在PCR反應過程中，可對整個擴增過程進行實時監(jiān)測，連續(xù)地分析與擴增產物相關的熒光信號的變化，采用我們設計的方 法(方案)可以直觀并準確的測定OAZl基因在不同組織和不同發(fā)育時期的表達規(guī)律。
[0010]本發(fā)明技術方案帶來的有益效果:
[0011]本發(fā)明設計了全長OAZl基因的引物，應用普通的RT-PCR技術即可獲取全長的OAZl序列，一次性克隆OAZl的全長⑶S序列。相較于以前的分段克隆和RACE技術，該方法能快速的獲取OAZl基因的全長CDS序列，大大的節(jié)省了試驗時間和試驗成本，也避免了分段克隆可能出現(xiàn)的拼接不成功的情況，提高了試驗的準確性。另外，本發(fā)明設計了 OAZl的短片段熒光定量PCR檢測所需的特異性強、PCR反應效率高的引物序列，該引物序列適合應用SYBR-Green染料進行快速檢測不同組織和不同發(fā)育時期OAZl基因mRNA表達規(guī)律的研究。在實時定量PCR檢測過程中，可對整個反應擴增過程進行實時監(jiān)測，連續(xù)地分析與擴增產物相關的熒光信號的變化。因此，該項發(fā)明技術為鵝OAZl基因的結構和功能研究提供了一個快速獲取OAZl基因全長CDS序列的方法，并建立了一套快速、準確、省時省力的研究鵝OAZl基因mRAN表達規(guī)律的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]附圖10AZ1全長⑶S序列PCR擴增電泳圖
[0013]附圖20AZ1開放閱讀框及其氨基酸序列圖
[0014]附圖3短片段OAZl和β -actin基因PCR擴增電泳圖
[0015]附圖4 β -actin熒光定量標準曲線
[0016]附圖5 β-actin熒光定量溶解曲線
[0017]附圖60AZ1熒光定量標準曲線
[0018]附圖70AZ1熒光定量溶解曲線
【具體實施方式】[0019]下面結合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0020]實施案例1.[0021]一種快速獲取鵝OAZl基因全長⑶S序列及快速檢測其表達規(guī)律的方法包括以下步驟:
[0022]1.取鵝卵巢組織中的總RNA，并將其反轉錄為cDNA ；
[0023]2.設計OAZl-L基因的引物，長度為874bp ；
[0024]Forward: TGCGGGGTGTTCAAGATGT
[0025]Reverse:GAGGGAGAGGACCTGCAAAC
[0026]設計OAZl-S基因的引物，長度為141bp ；
[0027]Forward:ACTTCAGGAACCCTCGCATCAACT
[0028]Reverse:GCTGCCCTCATCTTTCTAATACGG
[0029]設計β -actin基因的引物，長度為222bp ；‘
[0030]Forward:GCGGCATGCCACACCGTGCCCATCTATGAG
[0031]Reverse:GCGAAGCTTGGCCATCTCCTGCTCGAAGT
[0032]3.通過RT-PCR擴增反應、PCR產物的回收純化、DH5 α感受態(tài)細胞的制備、目的基因的連接、連接產物的轉化、陽性菌落的篩選、菌液測序獲取全長OAZl序列。
[0033]4.應用實時熒光定量PCR技術構建OAZl和β-actin熒光定量PCR引物的標準曲線和溶解曲線，進一步鑒定所設計的OAZl和β -actin熒光定量引物的特異性和準確性。
【權利要求】
1.一種快速獲取鵝OAZl基因全長CDS序列及快速檢測其表達規(guī)律的方法包括以下步驟: 1)取鵝卵巢組織中的總RNA，并將其反轉錄為CDNA； 2)設計OAZl-L基因的引物，長度為874bp；
Forward:TGCGGGGTGTTCAAGATGT
Reverse:GAGGGAGAGGACCTGCAAAC 設計OAZl-S基因的引物，長度為141bp ；
Forward:ACTTCAGGAACCCTCGCATCAACT
Reverse:GCTGCCCTCATCTTTCTAATACGG
設計β-actin基因的引物，長度為222bp ；
Forward:GCGGCATGCCACACCGTGCCCATCTATGAG
Reverse:GCGAAGCTTGGCCATCTCCTGCTCGAAGT 3)通過RT-PCR擴增反應、PCR產物的回收純化、DH5α感受態(tài)細胞的制備、目的基因的連接、連接產物的轉化、陽性菌落的篩選、菌液測序獲取全長OAZl序列。 4)應用實時熒光定量PCR技術構建OAZl和β-actin熒光定量PCR引物的標準曲線和溶解曲線，進一步鑒定所設計的OAZl和β -actin熒光定量引物的特異性和準確性。
2.一種如權利要求1所述的快速獲`取鵝OAZl基因全長CDS序列及快速檢測其表達規(guī)律的方法，其特征在于:設計了采用常規(guī)的RT-PCR方法進行一次性克隆即可快速獲得OAZl基因全長CDS序列的基因特異性引物。
3.一種采用權利要求1所述方法快速、直觀并準確的測定OAZl基因在不同組織和不同發(fā)育時期的表達規(guī)律。
【文檔編號】C12N15/11GK103436600SQ201310164452
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年4月19日 優(yōu)先權日:2013年4月19日
【發(fā)明者】康波, 姜冬梅, 白林, 馬容, 何琿, 鄒明峰 申請人:四川農業(yè)大學