選擇性抗hla抗體去除裝置及其生產(chǎn)方法和用途
【專利摘要】抗MHC去除裝置包括與固相支持物共價偶聯(lián)的具有血清學(xué)活性的可溶性MHC部分。生產(chǎn)方法包括將具有血清學(xué)活性的可溶性MHC部分共價偶聯(lián)到固相支持物上。抗MHC去除裝置的使用方法包括使生物學(xué)樣品與裝置接觸以從生物學(xué)樣品中去除MHC部分特異性抗體。隨后回收生物學(xué)樣品。
【專利說明】選擇性抗HLA抗體去除裝置及其生產(chǎn)方法和用途
[0001 ] 有關(guān)聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明
[0002]不適用。
[0003]發(fā)明構(gòu)思的【背景技術(shù)】
1.發(fā)明領(lǐng)域
[0004]本發(fā)明公開和要求的發(fā)明構(gòu)思總體涉及從樣品中去除抗HLA抗體的方法學(xué)以及其使用的設(shè)備。
[0005]2.【背景技術(shù)】描述
[0006]人細(xì)胞在其表面表達(dá)非常大量的膜結(jié)合蛋白，所有這些蛋白都顯示各自的特性和生理功能。一些臨床方法需要從這大批的表面細(xì)胞蛋白中描述人I類和II類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)膜結(jié)合分子的特征。人I類和II類MHC分子被稱為人白細(xì)胞抗原或HLA。人I類和II類HLA分子負(fù)責(zé)將肽抗原呈遞給位于T-淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)以及可能地其他免疫效應(yīng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞表面上的受體。MHC I和MHC II分子上肽抗原的展示是識別“自我與非我”的基礎(chǔ)以及重要免疫應(yīng)答如移植排異、移植物抗宿主疾病、自身免疫性疾病和正常的抗病毒和抗細(xì)菌免疫應(yīng)答的起始。
[0007]I類和II類HLA分子因人而異。每個人在其細(xì)胞表面表達(dá)不同的I類和II類補體。出于移植目的，確定細(xì)胞上表達(dá)的多種HLA中的哪些被另一個個體的抗體識別是很重要的。移植受者中抗HLA抗體的存在可以導(dǎo)致超急性器官排異。常常難以確定許多HLA中的哪些被抗體識別，因為血清可含有非HLA蛋白和多種HLA分子的抗體，而且血清可以在不同HLA分子之間交叉反應(yīng)。由于存在許多人蛋白、許多HLA蛋白、多種人蛋白的抗體和與各種HLA蛋白交叉反應(yīng)的抗體，難以·篩選器官移植的患者以確定群體中在待移植的器官上表達(dá)的眾多HLA中的哪些被抗體識別。由于血液供者的血液中的抗體可能與血液制品受者的I類和II類HLA抗原反應(yīng)，HLA蛋白的抗體還會在血液制品輸血期間引起問題。血液制品中識別受者HLA的抗體會引起輸血相關(guān)的急性肺損傷(TRALI)。
[0008]I類MHC分子在人類中被命名為I類HLA，其結(jié)合肽抗原配體并將之展示在細(xì)胞表面上。由I類MHC分子呈遞的肽抗原配體源自正常內(nèi)源蛋白(“自我”)或?qū)氲郊?xì)胞中的外來蛋白(“非我”)。非我蛋白可以是惡性轉(zhuǎn)化或胞內(nèi)病原體如病毒的產(chǎn)物。這樣，I類MHC分子將有關(guān)細(xì)胞內(nèi)部適合度的信息傳遞給免疫效應(yīng)細(xì)胞，包括但不限于CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，其與“非我”肽相互作用后被活化，從而裂解或殺死呈遞這種“非我”肽的細(xì)胞。
[0009]II類MHC分子在人類中被命名為II類HLA，其也結(jié)合肽抗原配體并將之展示在細(xì)胞表面上。與在幾乎所有有核細(xì)胞上表達(dá)的I類MHC分子不同，II類MHC分子一般局限于特化的細(xì)胞，如B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和通過內(nèi)吞途徑從胞外液體中攝入外來抗原的其他抗原呈遞細(xì)胞。由II類HLA結(jié)合并呈遞的肽抗原源自胞外外來抗原，如在細(xì)胞外部繁殖的細(xì)菌的產(chǎn)物，其中此類產(chǎn)物包括由細(xì)菌分泌的蛋白毒素或人體免疫系統(tǒng)以保護方式對其產(chǎn)生應(yīng)答的任何其他細(xì)菌蛋白。這樣，II類分子將有關(guān)胞外易進(jìn)入的空間中病原體存在的信息傳遞給展示II類分子的細(xì)胞。表達(dá)II類HLA的細(xì)胞隨后將源自胞外抗原/細(xì)菌的肽抗原呈遞給免疫效應(yīng)細(xì)胞，包括但不限于CD4+輔助性T細(xì)胞，從而幫助消除這樣的病原體。通過輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗微生物以及由這些微生物所產(chǎn)生毒素的抗體以及通過活化巨噬細(xì)胞以破壞所攝入的微生物，從而完成這樣病原體的消除。
[0010]I類和II類HLA分子顯示出由系統(tǒng)重組和點突變事件產(chǎn)生的廣泛多態(tài)性；因此，在整個世界的人群中存在數(shù)百種不同的HLA類型，導(dǎo)致大量的免疫多樣性。整個人群中這種廣泛的HLA多樣性導(dǎo)致個體間組織或器官的移植排異以及對感染性疾病的不同易感性和/或抗性。HLA分子還在自身免疫和癌癥上起顯著作用。因為，即使并非全部，HLA分子介導(dǎo)大多數(shù)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，并且由于其巨大的多樣性，需要大量的單獨的HLA蛋白，以有效地研究移植、自身免疫性病癥以及用于疫苗的開發(fā)。
[0011]識別I類和II類人白細(xì)胞抗原(HLA)的抗體目前在器官移植過程的多個階段中均是不利的。在移植之前，已被致敏而產(chǎn)生HLA特異性抗體的患者通常等待更久以接受移植。移植后，識別供者器官HLA的抗體導(dǎo)致被移植器官的超急性、急性和慢性排異。然而，可能并非所有識別HLA的抗體都促進(jìn)器官衰竭。因此對抗HLA抗體更透徹的理解將指示出真正對移植不利的那些免疫球蛋白。
[0012]一直以來難以評估任何給定HLA分子的抗體的表型和功能特性，因為抗HLA體液應(yīng)答傾向于是多克隆抗體并且無法輕易分離這些抗體以進(jìn)行個體表征?？贵w濃度、同種型、表位特異性、交叉反應(yīng)性和固定補體的能力都被暗示為導(dǎo)致抗HLA抗體致病性的因素(6)。最近，更先進(jìn)的工具如基于珠的半定量測定已經(jīng)提供了這些抗體的HLA特異性的更明確指示。然而，人血清的復(fù)雜性質(zhì)和不能對與單獨的HLA抗原反應(yīng)的抗體進(jìn)行研究使得抗體同種型、濃度和對移植排異的特異性繼續(xù)不明朗。
[0013]目前的抗體去除方法僅去除廣泛特異性的抗體。PROSORBA?(CypressBioscience, San Diego, CA)和后續(xù)的IMMUNOSORBA?1 (Fresenius Medical Care,Waltham, MA)產(chǎn)品(以 及其他與之類似的)使用A蛋白結(jié)合大范圍的抗體。血漿通過IMMUNOSORBA?裝置過濾，以從血清中除去大部分IgG抗體。然而，IgG3和IgM以及其他亞型并沒有去除。這些現(xiàn)有裝置沒有提供在“想要的”和“不想要的”抗體之間選擇的方法。
[0014]因此，本領(lǐng)域中存在對于從樣品中選擇性去除抗MHC / HLA抗體的改良的裝置以及其生產(chǎn)方法和用途的需求，以克服現(xiàn)有技術(shù)的劣勢和缺陷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]本專利或申請文件包含至少一幅彩繪圖。在提出請求并且支付必要的費用后，專利局將提供帶有彩圖的本專利或?qū)＠暾埞_文本的拷貝。
[0016]圖1是按照本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思而產(chǎn)生的可溶性II類HLA三分子復(fù)合物的示意性展示。
[0017]圖2是按照本發(fā)明公開和要求的發(fā)明構(gòu)思而產(chǎn)生(圖1的)可溶性II類HLA(II類sHLA)三分子復(fù)合物的方法的示意圖。
[0018]圖3是在中空纖維生物反應(yīng)器單元中產(chǎn)生II類sHLA三分子復(fù)合物的示意圖。
[0019]圖4圖示了在已轉(zhuǎn)染細(xì)胞中產(chǎn)生的II類sHLADRBl*0103的產(chǎn)生，表明由T175燒瓶擴大生產(chǎn)規(guī)模至中空纖維生物反應(yīng)器單元(CELLPHARM? )的能力。
[0020]圖5圖示了市售單克隆抗體(mAb)和患者血清特異性檢測圖4中產(chǎn)生的sHLADRB1*0103 的能力。
[0021]圖6圖示了按照本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明方法從已轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生多種不同的II類sHLA復(fù)合物的能力。
[0022]圖7圖示了生物反應(yīng)器中毫克量II類sHLA隨時間的產(chǎn)生。
[0023]圖8展示了利用電噴霧質(zhì)譜對II類sHLA DRB*0103 / DRA*0101 (圖7中產(chǎn)生的)
的定量。
[0024]圖9圖解利用電噴霧電離TOF質(zhì)譜得到的圖8的蛋白的分子量結(jié)果和分析。
[0025]圖10圖示了可溶性DRB1*1101ZP II類HLA分子與固相支持物的偶聯(lián)以及其以ELISA形式輔助去除II類HLA特異性抗體的用途。A圖:為了特異性抗體去除而進(jìn)行的連續(xù)吸收基質(zhì)ELISA的示意圖。B圖:加到連續(xù)吸收基質(zhì)上的3種不同的II類HLA特異性mAb抗體:L243、0L(0ne Lambda)和2H11的吸收和保留值。
[0026]圖11圖示了可溶性DRB1*1101以ELISA形式識別DRB1*1101特異性人血清。
[0027]圖12圖示了可溶性DRB1*1101可以偶聯(lián)到SEPHAROSE?上并用于吸收H類HLA特異性抗體9.3F10。A圖:可溶性DRB1*1101與SEPHAROSE? Fast Flow偶聯(lián)并被包裝入重力柱中。將具有DR反應(yīng)性的mAb9.3F10過柱并收集流過物作為流分。隨后向柱中加入DEA(二乙醇胺)緩沖液(pHll.3)洗脫mAb，并收集流分。B圖:還對小鼠總IgG和人總HLA的流過物和洗脫物分別·進(jìn)行ELISA，以檢測可能已經(jīng)被洗脫下柱的HLA蛋白特異性抗體。
[0028]圖13圖示了人血清中所含的DRB1*1101特異性抗體可以通過DRB1*1101特異性柱去除。將供者#1血清通過DRB1*1101 SEPHAROSE?柱，并收集流過物的兩份2ml流分。將DEA緩沖液(pHll.3)加入柱中洗脫，并收集兩份2ml流分。A圖:進(jìn)行直接的DRB1*1101ELISA以檢測流過物和洗脫物中殘留的DRB1*1101特異性抗體的量。B圖:還進(jìn)行人總IgG夾心ELISA以評估人總IgG的通過情況。
[0029]圖14圖示了偶聯(lián)DRB1*1101的SEPHAROSE?:對于DRB1101而非其他DR等位基因是特異的。以與圖13相同的方式將供者#2血清通過DRB1*1101柱，并對兩份流過物流分和一份洗脫物流分進(jìn)行多等位基因DR反應(yīng)性的評估。
[0030]圖15描述了 DRA*0101 α鏈亮氨酸拉鏈構(gòu)建體的核酸(SEQ ID NO:1)和氨基酸(SEQ ID Ν0:2)序列。高亮顯示的序列編碼將DRA1*0101等位基因的序列連接到亮氨酸拉鏈基序序列的連接子。下劃線序列編碼亮氨酸拉鏈基序。
[0031]圖16描述了 DRA*0401 β鏈亮氨酸拉鏈構(gòu)建體的核酸(SEQ ID NO:3)和氨基酸(SEQ ID Ν0:4)序列。高亮顯示的序列編碼將DRA1*0401等位基因的序列連接到亮氨酸拉鏈基序序列的連接子。下劃線序列編碼亮氨酸拉鏈基序。
[0032]圖17描述了 DRA*0103i3鏈亮氨酸拉鏈構(gòu)建體的核酸(SEQ ID NO:5)和氨基酸(SEQ ID N0:6)序列。高亮顯示的序列編碼將DRA1*0103等位基因的序列連接到亮氨酸拉鏈基序序列的連接子。下劃線序列編碼亮氨酸拉鏈基序。
[0033]圖18 圖解了 sHLA-DRll 的結(jié)構(gòu)。A) a (DRA1*01:01)和 β (DRB1*11:01)鏈的跨膜域被刪除并被7個氨基酸的連接子取代，其后分別接有亮氨酸拉鏈ACIDpl (LZA)和亮氨酸拉鏈BASEpl (LZB)。B)成熟DRA1*01:01和DRB1*11:01構(gòu)建體的氨基酸序列，紅色字母表示MS分析所覆蓋的序列。下劃線字母顯示亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
[0034]圖19圖解了用sHLA-DRll柱去除和回收L243。A)從sHLA_DRll柱的流過和洗脫所獲得流分的A280值。B)經(jīng)洗脫的L243抗體的II類反應(yīng)性。顯示了每個單獨的HLA復(fù)合物檢測的原始(raw)MFI，該結(jié)果通過基因座聚集到一起。
[0035]圖20圖解了利用sHLA-DRll柱特異性去除抗HLA-DRll抗體。A，B)從兩個致敏供者獲得的起始血清中的典型II類HLA的反應(yīng)性(A:供者1，B:供者2)。HLA類型根據(jù)基因座以顏色編碼(DR11:黑色，其他DR:藍(lán)色陰影，DQ:紅色陰影，DP:綠色)。數(shù)據(jù)以經(jīng)背景校準(zhǔn)的MFI (BCMFI)顯示。C，D)對來自供者I(C)和供者2 (D)的柱流過物和洗脫物中流分的抗HLA反應(yīng)性進(jìn)行如A和B中的分析。每條曲線顯示不同II類HLA類型的反應(yīng)譜，如圖例中所顯示。HLA類型如A和B中以顏色編碼。
[0036]圖21圖解了補體和非補體固定的抗體的去除。A)利用抗HLA-DRll抗體對HLA-DRll陽性細(xì)胞(C433、C418、C428、C423)進(jìn)行補體依賴性細(xì)胞溶解。如材料和方法中所描述計算細(xì)胞死亡平均值。起始血清顯示為藍(lán)色，流過物為紅色，洗脫物為綠色。誤差條代表3次獨立實驗的標(biāo)準(zhǔn)差。利用Turkey posthoc測試通過單因素ANOVA (方差分析)顯示并確定平均值的顯著性差異(p〈0.05)。B)用于A中定量分析的代表性熒光顯微鏡圖像。死亡細(xì)胞是紅色(嗅化乙錠)，有活力的細(xì)胞是綠色(吖啶橙)。
[0037]圖22圖解了經(jīng)純化的抗HLA-DRll抗體的同種型譜。利用基于LUMINEX?的ELISA對起始血清、流過物和洗脫物中的抗體同種型譜進(jìn)行定量并將其表示為抗體總量的百分比。
[0038]圖23圖解了抗HLA-DRll抗體從敏化血清中的去除。利用單抗原珠測定對來自兩個敏化供者的起始血清的II類反·應(yīng)性進(jìn)行測試。血清通過sHLA-DRll柱后，利用相同的II類單抗原珠測定對柱的流過物和洗脫物進(jìn)行測試。
[0039]圖24圖解了兩種不同的SEPHAROSE?基質(zhì)與I類可溶性HLA的偶聯(lián)效率。將Img sHLA-B加入到Iml經(jīng)CNBr活化的或NHS活化的SEPHAROSE? 4Fast Flow基質(zhì)中。偶聯(lián)反應(yīng)I小時后終止。利用以下等式計算偶聯(lián)效率:偶聯(lián)效率=起始sHLA (mg) /偶聯(lián)后溶液中的sHLA(mg)。
[0040]圖25圖解了兩種不同的SEPHAROSE?基質(zhì)對于I類可溶性HLA的結(jié)合能力。飽和量的泛I類HLA單克隆抗體W6 / 32在Iml已偶聯(lián)的基質(zhì)(ImgOlmg / ml)上流過?；|(zhì)是經(jīng)CNfc活化的或NHS活化的SEPHAROSE? 4Fast Flow基質(zhì)。本實驗中使用的sHLA是sHLA-B*07:02。通過測量洗脫中回收的抗體量確定結(jié)合能力。為了根據(jù)偶聯(lián)效率的變化進(jìn)行調(diào)整，數(shù)據(jù)顯示為洗脫中每mg偶聯(lián)到基質(zhì)上的sHLA對應(yīng)的W6 / 32的量(yg)。
[0041]圖26圖解了裝載I類可溶性HLA的兩種不同的SEPHAROSE?基質(zhì)的再生能力。飽和量的泛I類HLA單克隆抗體W6 / 32在Iml已偶聯(lián)的基質(zhì)(lmg@lmg/ml)上流過?；|(zhì)是經(jīng)CNBr活化的或NHS活化的SEPHAROSE? 4Fast Flow基質(zhì)。隨后如x軸所示使柱連續(xù)裝載并洗脫5次。顯示了每個循環(huán)的初始(循環(huán)I)抗體結(jié)合能力的百分比。
[0042]圖27圖解了兩種不同的SEPHAROSE?基質(zhì)與II類可溶性HLA的偶聯(lián)效率。將Img sHLA-DRll 加入到 Iml 經(jīng) CNBr 活化的或 NHS 活化的SEPHAROSE? 4Fast Flow 基質(zhì)中。偶聯(lián)反應(yīng)I小時后終止。利用以下等式計算偶聯(lián)效率:偶聯(lián)效率=起始sHLA (mg) /偶聯(lián)后溶液中的sHLA(mg)。
[0043]圖28圖解了兩種不同的SEPHAROSE?基質(zhì)對于II類可溶性HLA的結(jié)合能力。飽和量的泛HLA-DR單克隆抗體L243在Iml已偶聯(lián)的基質(zhì)(ImgOlmg / ml)上流過?；|(zhì)是經(jīng)CNBr活化的或NHS活化的SEPHAROSE? 4Fast Flow基質(zhì)。本實驗中使用的sHLA是sHLA-DRll。通過測量洗脫中回收的抗體量確定結(jié)合能力。為了根據(jù)偶聯(lián)效率的變化進(jìn)行調(diào)整，數(shù)據(jù)顯示為洗脫中每mg偶聯(lián)到基質(zhì)上的sHLA對應(yīng)的L243的量(μ g)。
[0044]圖29圖解了裝載有II類可溶性HLA的兩種不同SEPHAROSE?基質(zhì)的再生能力。飽和量的泛HLA-DR單克隆抗體L243在Iml已偶聯(lián)的基質(zhì)(ImgOlmg / ml)上流過?；|(zhì)是經(jīng)CNBr活化的或NHS活化的SEPHAROSE? 4Fast Flow基質(zhì)。隨后如x軸所示使柱連續(xù)裝載并洗脫5次。顯示了每個循環(huán)的初始(循環(huán)I)抗體結(jié)合能力的百分比。
[0045]圖30圖解了利用I類HLA SHARC (可溶性HLA抗體去除柱)從PBS中清除單克隆抗HLA抗體。飽和量的泛I類HLA單克隆抗體W6 / 32在65ml已偶聯(lián)的基質(zhì)(以97 μ tg /ml的24.4mg)上流過。隨后用PBS(pH7.4)清洗柱并用0.1M甘氨酸(pHll)洗脫。在裝載和清洗期過程中，11.7mg通過柱子。在洗脫期過程中，回收了 8mg抗體。
[0046]圖31圖解了利用I類HLA-A2SHARC從患者血漿中清除抗HLA-A2多克隆抗體。`
2.5L含有抗HLA抗體的患者血漿在65ml sHLA_A2SHARC上流過。利用如生產(chǎn)商(LABScreenSingle Antigen, Onelambda, Inc., Canoga Park, CA)所描述的多重的基于LUMINEX?的檢測方法對SHARC前和SHARC后的血漿進(jìn)行分析。如圖例中所示，該個體具有多種HLA特異性。如附圖中所顯示，抗HLA-A2抗體以及血清學(xué)相關(guān)抗體(B57、B58)從初始血漿中減少。血清學(xué)不相關(guān)的抗HLA抗體(B61、B81、B18、B60)通過SHARC，與SHARC前血漿中相比未改變。這表明HLA-A2SHARC的特異性。
[0047]圖32圖解了利用HLA-A2-SHARC從患者血清中清除多克隆抗HLA-A2抗體。2.5L含有抗HLA抗體的患者血漿在65ml sHLA_A2SHARC上流過。隨著血漿通過SHARC，收集流分。利用如生產(chǎn)商所描述的多重的基于LUMINEX?的檢測方法對所得流分進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)表示為BCMFI減少的百分比BCMFI減少=1_(流分的BCMFI /起始血清的BCMFI))。
[0048]圖33圖解了利用II類HLA SHARC (可溶性HLA抗體去除柱)從PBS中清除單克隆抗HLA抗體。飽和量的泛HLA-DR單克隆抗體L243在65ml已偶聯(lián)的基質(zhì)(30.0mgil20y g /ml)上流過。隨后用PBS(pH7.4)清洗柱并用0.1M甘氨酸(pHll)洗脫。在裝載和清洗期過程中，2mg通過柱。在洗脫期過程中，回收了 23.1mg抗體。
[0049]圖34圖解了利用HLA-DRl ISHARC從患者血漿中清除多克隆抗HLA-DRl I抗體。2.5L含有抗HLA抗體的患者血漿在65ml sHLA_DRllSHARC上流動。利用如生產(chǎn)商(LABScreen Single Antigen, Onelambda, Inc., Canoga Park, CA)所描述的多重的基于LUMINEX?的檢測方法對SHARC前和SHARC后的血漿進(jìn)行分析。如圖例中所示，該個體具有多種HLA特異性。如附圖中所顯示，抗HLA-DRll抗體以及血清學(xué)相關(guān)抗體(DR13、DR4、DR17)從初始血漿中減少。血清學(xué)不相關(guān)的抗HLA抗體(DQ7、DQ8、DQ9)通過SHARC，與SHARC前血漿相比未改變。這表明HLA-DR11SHARC的特異性。[0050]圖35圖解了利有HLA-DRl ISHARC從患者血清中清除抗HLA-DRl I多克隆抗體。
2.5L含有抗HLA抗體的患者血漿在65ml sHLA-DRIISHARC上流過。隨著血漿通過SHARC，收集流分。利用如生產(chǎn)商所描述的多重的基于LUMINEX?的檢測方法對所得流分進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)表示為BCMFI減少的百分比BCMFI減少=1-(流分的BCMFI /起始血清的BCMFI))。
[0051 ] 圖36圖解了可溶性I類HLAA*0201與NHS活化的SEPHAROSE? Fast FlowMatrix柱的偶聯(lián)效率。
[0052]圖37圖解了基于吸收單位(mAU)評估圖36的柱圖譜以檢測蛋白質(zhì)物質(zhì)的可重復(fù)性研究。
[0053]圖38圖解了基于pH評估圖36的柱圖譜的可重復(fù)性研究。
[0054]圖39圖解了基于電導(dǎo)率評估圖36的柱圖譜以檢測緩沖液相的變化的可重復(fù)性研究。
[0055]圖40-42圖解了圖36的柱的穩(wěn)定性評估，其中利用W6 / 32對柱進(jìn)行了的多輪裝載-洗脫-平衡的循環(huán)。
[0056]圖43圖解了利用不同量的W6 / 32評估圖36的柱的容量。
[0057]圖44圖解了利用不同量的抗β 2m評估圖36的柱的容量。
[0058]圖45圖解了利用不同量的抗VLDL (針對導(dǎo)入A*0201分子的人工尾部的抗體)評估圖36的柱的容量。
[0059]圖46圖解了利用W6 / 32評估圖36的柱的結(jié)合效率。
[0060]圖47圖解了利用抗β 2m評估圖36的柱的結(jié)合效率。
[0061]圖48圖解了利用抗VLDL評估圖36的柱的結(jié)合效率。
[0062]圖49圖解了根據(jù)本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思的一個【具體實施方式】所推薦的應(yīng)用方案。
[0063]發(fā)明詳述
[0064]在通過示例性附圖、實驗、結(jié)果和實驗室方法的方式詳細(xì)解釋本發(fā)明構(gòu)思的至少一個實施方案之前，要理解的是，本發(fā)明構(gòu)思在其應(yīng)用中不限于以下描述中所示或者附圖、實驗和/或結(jié)果中所闡述的構(gòu)建詳述和組分排列。本發(fā)明構(gòu)思可以是其他實施方案或者能夠以多種方式實踐或?qū)嵤?。同樣地，本文中所使用的語言意在給出可能的最廣義的范圍和意義；并且實施方案意在示例而非窮舉。此外，要理解的是，本文中使用的措詞和術(shù)語是出于描述的目的，其不應(yīng)當(dāng)被視為是限制性的。
[0065]除非本文中另有定義，與本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思關(guān)聯(lián)使用的科學(xué)性和技術(shù)性術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍理解的含義。此外，除非上下文另有需要，單數(shù)術(shù)語包括復(fù)數(shù)形式，復(fù)數(shù)術(shù)語包括單數(shù)形式。一般來講，本文中描述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)和寡聚或多核苷酸化學(xué)以及雜交關(guān)聯(lián)使用的專業(yè)名詞和上述學(xué)科的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知和普遍使用的。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行重組DNA、寡聚核苷酸合成以及組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染)中。酶促反應(yīng)和純化技術(shù)依照生產(chǎn)商的說明書或如本領(lǐng)域普遍實現(xiàn)的或如本文中所描述而進(jìn)行。上述技術(shù)和方法一般依照本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法以及如本說明書引用和討論的多篇綜合的且更具體的參考文獻(xiàn)中所描述而進(jìn)行。參見例如Sambrook 等人 Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)和 Coligan 等人 Current Protocolsin Immunology (Current Protocols, Wiley Interscience (1994)),其通過引用并入本文。與本文中描述的分析化學(xué)、合成有機化學(xué)以及藥物和制藥化學(xué)關(guān)聯(lián)使用的專業(yè)名詞以及上述學(xué)科的實驗室方法和技術(shù)是本領(lǐng)域熟知和普遍使用的那些。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、配制和遞送以及患者的治療中。
[0066]本說明書中提及的所有專利、已公開的專利申請和非專利出版物是指示本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的技術(shù)水平。本申請任何部分中引用的所有專利、已公開的專利申請和非專利出版物作為整體通過引用明確地并入本文，其程度與每個單獨的專利或出版物特別地并且單獨地通過引用而并入相同。
[0067]根據(jù)本文公開的內(nèi)容，無需過度的實驗，即可制備和實施本文中公開和要求保護的所有組合物和/或方法。雖然已經(jīng)以優(yōu)選實施方案的方式對本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)行了描述，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，在不偏離本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍的情況下，可以對本文中描述的組合物和/或方法以及在方法的步驟中或步驟順序進(jìn)行改變。所有這種類似的替代和修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，其被視為屬于由所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明構(gòu)思的精神、范圍和構(gòu)思。
[0068]如根據(jù)本文公開的內(nèi)容所使用，除非另有說明，以下術(shù)語應(yīng)當(dāng)被理解為具有以下含義:
[0069]當(dāng)在權(quán)利要求和/或說明書中與術(shù)語“包含”關(guān)聯(lián)使用時，詞語“一個(a) ”或“一個(an)”的使用可以意指“一個”，但是其還與“一個或多個”、“至少一個”和“一個或多于一個”的含義一致。盡管本文公開的內(nèi)容支持僅指替代物以及“和/或”的定義，但是權(quán)利要求中術(shù)語“或者”的使用是用于意指“和/或”，除非明確說明僅指替代物或者替代物是互斥的。貫穿本申請，術(shù)語“大約”用于表示數(shù)值包括設(shè)備、確定數(shù)值所使用方法的誤差的內(nèi)在差異或者研究對象之間存在的差異。例如·但是不以限制的方式，當(dāng)使用術(shù)語“大約”時，所指的數(shù)值可以以加或減12%、或11%、或10%、或9%、或8%、或7%、或6%、或5%、或4<%、或3%、或2(%、或I %而變化。術(shù)語“至少一個”的使用理解為包括一個以及多于一個的任意數(shù)量，包括但不限于2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100等。術(shù)語“至少一個”可以擴展至100或1000或更多，這取決于其所附的術(shù)語；此外，100 / 1000的數(shù)量不被認(rèn)為是限制性的，因為更高的限值也可以產(chǎn)生滿意的結(jié)果。此外，術(shù)語“X、Y和Z的至少一個”理解為包括單獨的X、單獨的Y和單獨的Z以及X、Y和Z的任意組合。序號術(shù)語(即“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等)的使用僅僅是出于區(qū)分兩個或多個術(shù)語的目的，并不意味著暗示例如任何順序或次序或者一個術(shù)語的重要性超過另一個或者加入的任何次序。
[0070]如本說明書和權(quán)利要求中所使用，詞語“包含(comprising)”(和包含的任何形式，例如“comprise”和“comprises” )、“具有(having) ” (和具有的任何形式，例如“have”和“has”)、“包括(including) ” (和包括的任何形式,例如“includes”和“include”)、或者“含有(containing)”(和含有的任何形式,例如“contains”和“contain”)是包括性的或者開放式的，其不排除額外的、未列舉的要素或方法步驟。
[0071 ] 如本文中所使用，術(shù)語“或其組合”是指術(shù)語前面所列項目的所有排列和組合。例如，“A、B、C或其組合”是指包括以下至少一種:A、B、C、AB、AC、BC或ABC，以及如果在特定上下文中次序是重要的，還有BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB, BAC或CAB。繼續(xù)該示例，明確包括的是含有一個或多個項目或術(shù)語的重復(fù)的組合，例如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA,CABABB等。除非從上下文另外是清楚的，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解通常對于以任意組合的項目或術(shù)語的數(shù)量沒有限制。
[0072]如本文中所使用，“基本上是純的”意指目標(biāo)種類是所存在的主要種類(即在分子基礎(chǔ)上，其比組合物中任何其他的單獨的種類豐富)。一般基本上是純的組合物將包含多于50%百分比的存在于組合物中的所有大分子種類，例如多于大約55 %、60%、65 %、70 %、75%、80%、85%、90%、95%和99%。在一個實施方案中，目標(biāo)種類被純化至基本同質(zhì)(通過常規(guī)檢測方法不能檢測出組合物中的污染物種類)，其中所述組合物基本上由單一的大分子種類組成。
[0073]如本文中所使用，術(shù)語“分離的多核苷酸”和“分離的核酸區(qū)段”意指基因組、cDNA或合成來源的多核苷酸或其一些組合，其中根據(jù)其來源，“分離的多核苷酸”或“分離的核酸區(qū)段”:(1)與“分離的多核苷酸”或“分離的核酸區(qū)段”天然存在于其中的多核苷酸的全部或一部分不相關(guān)，(2)與天然情況下不與其連接的多核苷酸可操作地連接，或者(3)不會作為較大序列的一部分天然出現(xiàn)。
[0074]術(shù)語“分離的蛋白質(zhì)”在本文中意指基因組、cDNA、重組RNA或合成來源的蛋白質(zhì)或其一些組合，其中根據(jù)其來源或衍生來源，“分離的蛋白質(zhì)”(1)與天然發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)不相關(guān)聯(lián)，⑵不含來自相同來源的其他蛋白質(zhì)，例如不含鼠類蛋白質(zhì)，⑶由來自不同物種的細(xì)胞表達(dá)，或者(4)不會天然存在。
[0075]如本文中所使用，術(shù)語“多肽”是通用術(shù)語，是指天然蛋白、片段、或多肽序列的類似物。因此，天然蛋白、片段和類似物是多肽類的種類。
[0076]如本文中所使用，對于客體所應(yīng)用的術(shù)語“天然存在的”是指客體可以天然存在的事實。例如，生物體(包括病毒)中存在的、能夠從天然來源中分離以及未在實驗室中經(jīng)人為或其他故意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然發(fā)生的。
[0077]術(shù)語“抗體”以最廣義使用`，并且特別地覆蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段(例如Fab、F(ab’)2和Fv)，只要其顯示出期望的生物學(xué)活性?？贵w(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特性的糖蛋白?？贵w顯示出對特定抗原的結(jié)合特異性，而免疫球蛋白包括抗體和缺乏抗原特異性的其他類抗體分子。后一種類型的多肽由例如淋巴系統(tǒng)以低水平和由骨髓瘤以增加的水平產(chǎn)生。
[0078]“抗體”或“抗體肽”是指完整的抗體或者與完整抗體競爭特異性結(jié)合的其結(jié)合片段。結(jié)合片段通過重組DNA技術(shù)或者通過完整抗體的酶促或化學(xué)切割而產(chǎn)生。結(jié)合片段包括Fab、Fab’、F (ab’ )2, Fv和單鏈抗體。除了 “雙特異性”或“雙功能性”抗體之外，抗體理解為具有同一結(jié)合位點。抗體基本上抑制受體粘附到反受體(counterreceptor)上,其中過量的抗體使與反受體結(jié)合的受體的量減少至少大約或80%，并且通常多于大約85% (如體外競爭性結(jié)合試驗中所測量)。
[0079]如本文中所使用，術(shù)語“MHC”理解為主要組織相容性復(fù)合物，其被定義為特異于主要組織相容性抗原的一組基因座位。如本文中所使用，術(shù)語“HLA”理解為人白細(xì)胞抗原，其被定義為人中發(fā)現(xiàn)的主要組織相容性抗原。如本文中所使用，“HLA”是人形式的“MHC”。
[0080]如本文中所使用，術(shù)語“ I類MHC輕鏈”和“ I類MHC重鏈”理解為I類MHC分子的一部分。從結(jié)構(gòu)上來講，I類分子是由兩條非共價結(jié)合的多肽鏈組成的異源二聚體，一條較大的“重”鏈(α )和一條較小的“輕”鏈(β -2-微球蛋白或β 2m)。在第6號染色體上MHC內(nèi)編碼的多態(tài)性多基因重鏈(45kDa)被細(xì)分為3個胞外結(jié)構(gòu)域(命名為1、2和3)、1個胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和I個跨膜結(jié)構(gòu)域。兩個最外側(cè)的胞外結(jié)構(gòu)域I和2共同形成結(jié)合抗原性肽的槽。因此，與TCR的相互作用發(fā)生在蛋白的這一區(qū)域。分子的第3胞外結(jié)構(gòu)域含有CTL上⑶8蛋白的識別位點；這種相互作用用于穩(wěn)定T細(xì)胞和APC之間的接觸。在第15號染色體上MHC外部編碼的保守的輕鏈(12kDa)包括單獨的胞外多肽。術(shù)語“I類MHC輕鏈”、“β-2-微球蛋白”和“ β 2m”在本文中可以互換使用。I類重鏈和輕鏈的關(guān)聯(lián)對于I類分子在細(xì)胞膜上表達(dá)是必需的。
[0081]同I類MHC分子一樣，II類分子也是異源二聚體，但是其由兩條接近同源的α和β鏈組成，二者均編碼于MHC中。II類MHC分子是膜結(jié)合糖蛋白，α和β鏈均含有外部結(jié)構(gòu)域、跨膜錨定區(qū)段和胞質(zhì)區(qū)段。II類分子中的每條鏈含有2個外部結(jié)構(gòu)域:33kDa的α鏈含有α:和α 2外部結(jié)構(gòu)域，而28kDa的β鏈含有β i和β 2外部結(jié)構(gòu)域。同I類重鏈分子鄰近膜的第3胞外結(jié)構(gòu)域一樣，鄰近膜的％和@2結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白折疊結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)具有序列同源性。II類分子的遠(yuǎn)離膜的結(jié)構(gòu)域由\和P1結(jié)構(gòu)域組成，其形成經(jīng)加工的肽抗原的抗原結(jié)合縫(cleft)。由II類分子呈遞的肽衍生自胞外蛋白(不是如I類中細(xì)胞溶質(zhì)的胞內(nèi)肽抗原)；因此，II類MHC依賴性抗原呈遞途徑被稱為內(nèi)吞或外源途徑。II類分子的裝載仍然必須在細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生；胞外蛋白被內(nèi)吞，在溶酶體中消化，與II類MHC分子結(jié)合，隨后分子遷移至質(zhì)膜。由于II類MHC分子的肽結(jié)合槽是兩端開放的而I類分子上的相應(yīng)槽在每個末端是封閉的，由II類MHC分子呈遞的肽較長，一般長度在13和24個氨基酸殘基之間。同I類HLA—樣，與II類分子結(jié)合的肽通常具有內(nèi)部保守的“基序”，但是與I類結(jié)合肽不同，其在羧基末端缺少保守基序，因為末端開放的結(jié)合縫使所結(jié)合的肽可以從兩個末端延伸。
[0082]如本文中所使用，術(shù)語“三分子復(fù)合物”理解為與肽關(guān)聯(lián)的MHC異源二聚體。“I類MHC三分子復(fù)合物”或“I類HLA三分子復(fù)合物”理解為包括相關(guān)聯(lián)的I類重鏈和輕鏈并且具有其抗原結(jié)合槽中展示的肽 。術(shù)語“II類MHC三分子復(fù)合物”和“II類HLA三分子復(fù)合物”理解為包括相關(guān)聯(lián)的II類α和β鏈并且具有其抗原結(jié)合槽中展示的肽。
[0083]如本文中所使用，術(shù)語“MHC基序”理解為包括I類MHC三分子復(fù)合物、II類MHC三分子復(fù)合物和I類/ II類MHC分子的任何部分或亞基。
[0084]如本文中所使用，術(shù)語“生物學(xué)樣品”理解為包括但不限于血清、組織、血液、血漿、腦脊髓液、淚液、唾液、淋巴、透析液、器官或組織培養(yǎng)衍生液以及從生理組織中提取的液體。如本文中所使用，術(shù)語“生物學(xué)樣品”還理解為包括這類液體的衍生物和流分以及其組合。例如，術(shù)語“生物學(xué)樣品”還理解為包括復(fù)雜的混合物。
[0085]如本文中所使用，術(shù)語“HLA蛋白”將被理解為能夠在非人類細(xì)胞表面上表達(dá)的任何HLA分子、其復(fù)合物或其片段。可以根據(jù)本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思使用的HLA蛋白的示例包括但不限于I類HLA三分子復(fù)合物、II類HLA三分子復(fù)合物、II類HLA α鏈和II類HLAii鏈?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思使用的II類HLAa和/或β蛋白的特定示例包括但不限于以下基因座位處編碼的=HLA-DRA ；HLA-DRBI ;HLA_DRB3、
4、5 ；HLA-DQA ；HLA-DQB ；HLA-DPA 和 HLA-DPB。[0086]如本文中所使用，術(shù)語“哺乳動物細(xì)胞”理解為能夠表達(dá)重組HLA蛋白(如上文所定義)的任何細(xì)胞。因此，根據(jù)本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思使用的任何“哺乳動物細(xì)胞”必須含有在這種細(xì)胞表面上表達(dá)MHC / HLA蛋白和/或MHC / HLA三分子復(fù)合物所需的必需的機構(gòu)(machinery)和運輸?shù)鞍?。根?jù)本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思使用的“哺乳動物細(xì)胞”必須具有㈧伴隨和裝載MHC / HLA蛋白例如I類和II類蛋白的機構(gòu)；和(B)該機構(gòu)必須能夠與人HLA蛋白例如I類和II類蛋白相互作用且共同工作。并非所有細(xì)胞表達(dá)II類MHC蛋白；僅僅專職的免疫細(xì)胞例如但不限于樹突狀細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等表達(dá)II類蛋白。因此，要在非人類哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)HLA II類蛋白時，這種非人類細(xì)胞必須表達(dá)該物種的II類MHC并且含有用于與那個物種的II類MHC以及人II類HLA相互作用且共同工作的適宜的機構(gòu)。然而，本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思還包括已經(jīng)被誘導(dǎo)表達(dá)II類MHC(例如但不限于細(xì)胞因子)的其他品系細(xì)胞和已經(jīng)進(jìn)行突變的細(xì)胞等的用途、。
[0087]如本文中使用的術(shù)語“哺乳動物細(xì)胞”是指永生化的哺乳動物細(xì)胞系并且不包括動物或原代細(xì)胞。可以根據(jù)本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思使用的“哺乳動物細(xì)胞”的示例包括但不限于人和小鼠DC系、巨噬細(xì)胞系和B細(xì)胞系。
[0088]MHC (主要組織相容性復(fù)合物)或II類HLA (人白細(xì)胞抗原)分子僅在少數(shù)幾種特化的細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)，包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞，所有這些均是專職的抗原呈遞細(xì)胞(APC)。由II類分子呈遞的肽衍生自胞外蛋白(不是如I類中細(xì)胞溶質(zhì)的)；因此II類MHC依賴性抗原呈遞途徑被稱為內(nèi)吞或外源途徑。II類分子的裝載仍然必須在細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生；胞外蛋白被內(nèi)吞，在溶酶體中消化，與II類MHC分子結(jié)合，隨后分子遷移至質(zhì)膜。
[0089]同I類MHC分子一樣，II類分子也是異源二聚體，但是其由兩條同源肽α和β鏈組成，二者均編碼于MHC中。II類分子由兩條多肽鏈組成，均由D區(qū)域編碼。這些多肽(α和β)長度分別大約為230和240個氨基酸并且是糖基化的，分子量大約為33kDa和28kDa。這些多肽折疊成兩個分離的結(jié)構(gòu)域，α多肽為α-l和α-2，β多肽為β-1和β_2。在α-l和β-1結(jié)構(gòu)域之間存在非?！ゎ愃朴谝娪贗類分子上的區(qū)域。該區(qū)域在底部與β折疊片并且在側(cè)面與2個α螺旋結(jié)合，其能夠結(jié)合(經(jīng)由非共價相互作用)小肽。由于II類MHC分子的抗原結(jié)合槽是兩端開放的而I類分子上的相應(yīng)槽在每個末端是封閉的，所以由II類MHC分子呈遞的抗原較長，一般長度在15和24個氨基酸殘基之間。這種小肽被“呈遞”給T細(xì)胞并且限定T細(xì)胞識別的抗原“表位”。
[0090]現(xiàn)在轉(zhuǎn)至本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思，本文中公開和要求保護抗MHC抗體去除裝置以及含有其的試劑盒和其生產(chǎn)方法及用途。如本文下面更詳細(xì)地描述，本文中描述的裝置/試劑盒可以用于多種臨床、診斷和治療方法?？筂HC抗體去除裝置包括與固相支持物共價偶聯(lián)的可溶性MHC部分(moiety)。與固相支持物連接的可溶性MHC部分是具有血清學(xué)活性的，這使得可溶性MHC部分保持天然MHC三分子復(fù)合物的物理的、功能的和抗原性的完整性。當(dāng)生物學(xué)樣品與抗MHC抗體去除裝置相接觸，MHC基序特異性抗MHC抗體附著到可溶性MHC部分上并且被檢測和/或從生物學(xué)樣品中去除。
[0091]可溶性MHC部分可以是通過本領(lǐng)域已知的任何方法或者本文中涉及的其他方法產(chǎn)生的I類或II類可溶性MHC部分。在某些實施方案中，可溶性MHC部分是I類或II類可溶性HLA部分?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思使用的I類可溶性HLA部分的非限定性示例(以及其生產(chǎn)和純化方法)公開于1999年12月17日提交的美國系列案第09/465，321號、2011年12月18日提交的美國系列案第10/022，066號(2003年9月4日公開的美國公開案第2003/0166057號)和2011年I月2日提交的美國系列案第10/337，161號(2033年10月9日公開的美國公開案第2003/0191286號)中。上面引用的專利申請的全部內(nèi)容在此通過引用明確地并入本文?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思使用的II類可溶性HLA部分的非限定性示例(以及生產(chǎn)方法和其純化)公開于2010年8月18日提交的專利申請美國系列案第12/859,002號中以及本文下面進(jìn)一步詳述中。
[0092]在某些實施方案中，MHC / HLA基本上從其他蛋白中純化出來，這樣單獨的MHC /HLA三分子復(fù)合物保持天然MHC / HLA三分子復(fù)合物的物理的、功能的和抗原性的完整性。具有功能活性的單獨的MHC / HLA三分子復(fù)合物可以如本文中所描述或者通過本領(lǐng)域已知的任何其他方法純化。連接到固相支持物上后，具有功能活性的單獨的MHC / HLA三分子復(fù)合物維持構(gòu)象。
[0093]可以使用能夠共價連接MHC / HLA部分并且能夠根據(jù)本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思另外發(fā)揮功能的任何固相支持物。在某些實施方案中，固相支持物可以選自由管(well)、珠(例如但不限于流式細(xì)胞術(shù)珠和/或磁珠)、膜(例如但不限于硝酸纖維素膜、PVDF膜、尼龍膜和乙酸酯衍生物)、微量滴定板、基質(zhì)(例如SEPHAROSE?基質(zhì))、孔、塑料、玻璃、聚合物、多糖、尼龍、硝酸纖維素、順磁性化合物及其組合組成的組中。能夠根據(jù)本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思發(fā)揮功能的固相支持物的非限定性示例包括具有入口、出口和置于其間的空腔的裝置?？涨缓蟹胖镁哂醒鍖W(xué)活性的可溶性MHC部分的內(nèi)表面，設(shè)置入口將生物學(xué)樣品導(dǎo)入室中。隨著生物學(xué)樣品流過裝置，具有血清學(xué)活性的MHC部分的特異性抗MHC抗體附著其上并從生物學(xué)樣品中清除。從出口收集到的流過物基本上不含具有血清學(xué)活性的MHC部分的特異性抗MHC抗體。該類型裝置的非限定性示例包括人用裝置(human use devices, HUD),例如體外血衆(zhòng)置換HUD。
[0094]在某些實施方案中，經(jīng)NHC活化的SEPHAROSE?基質(zhì)用作固相支持物。該基質(zhì)通過其伯胺基團共價連接到經(jīng)NHS (N-羥基琥珀酰亞`胺)活化的基團上以形成非常穩(wěn)定的酰胺鍵合而固定蛋白質(zhì)。這是本文中描述的裝置和方法用于治療用途的重要性質(zhì)，因為其防止治療過程中已固定的MHC / HLA復(fù)合物從基底/固相支持物上分離(例如但不限于裝置用作體外裝置的用途)，分離這些分子(以及其片段區(qū)段和/或亞基)會對患者造成有害影響。除了穩(wěn)定性增加之外，經(jīng)NHC活化的SEPHAROSE?:基質(zhì)還展現(xiàn)出結(jié)合能力增加，這是由于其中存在的14個原子的間隔臂而引起的，所述間隔臂使MHC / HLA在必要時可以重新定位，并且因而提供與抗體更好的接觸。
[0095]在某些其他實施方案中，使用其他偶聯(lián)連接。其他連接類型的非限定性示例包括糖化學(xué)、羧基連接、硫連接或本領(lǐng)域已知的任何其他連接化學(xué)類型或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可利用的可以使MHC基序偶聯(lián)到固相支持物上的其他類型。
[0096]在某些實施方案中，本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思利用通過本文中上面引用的美國專利/專利申請中所描述的方法產(chǎn)生的可溶性I類HLA三分子復(fù)合物。在一個非限定性示例中，提供了基本上從其他蛋白質(zhì)中純化出來的可溶性I類HLA三分子復(fù)合物，其保持天然I類MHC三分子復(fù)合物的物理的、功能的和抗原性的完整性。所述三分子復(fù)合物包含重組的單獨的可溶性I類MHC重鏈分子、β -2-微球蛋白非共價連接的單獨的可溶性I類MHC重鏈分子和單獨的可溶性I類MHC重鏈分子的抗原結(jié)合槽中內(nèi)源性裝載的肽。這些分子通過提供編碼所期望單獨的I類MHC重鏈的核苷酸區(qū)段而產(chǎn)生，所述核苷酸區(qū)段中去除了編碼所期望單獨的I類MHC重鏈等位基因的胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)，這樣所述核苷酸區(qū)段編碼截短的可溶形式的所期望單獨的I類MHC重鏈分子。該核苷酸區(qū)段可以合成產(chǎn)生，或者其可以通過截短的等位基因的座位特異性PCR擴增(或者從由分離自來源的mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA中，或者直接從gDNA中)而產(chǎn)生。接著將核苷酸區(qū)段克隆到哺乳動物表達(dá)載體中，從而形成編碼所期望單獨的可溶性I類MHC重鏈分子的構(gòu)建體。接著用構(gòu)建體轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞系，以提供表達(dá)編碼重組的單獨的可溶性I類MHC重鏈分子的構(gòu)建體的哺乳動物細(xì)胞系，其中所述哺乳動物細(xì)胞系能夠天然地將蛋白質(zhì)加工成肽配體以裝載到MHC分子的抗原結(jié)合槽中，并且其中所述哺乳動物細(xì)胞系表達(dá)β -2-微球蛋白。接著在允許表達(dá)來自所述構(gòu)建體的重組的單獨的可溶性I類MHC重鏈分子的條件下培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞系，這種條件還允許肽配體內(nèi)源性裝載到每個重組的單獨的可溶性I類MHC重鏈分子的抗原結(jié)合槽中并與天然的內(nèi)源性產(chǎn)生的β-2-微球蛋白的非共價連接，以形成單獨的可溶性I類MHC三分子復(fù)合物并隨后從細(xì)胞中分泌單獨的可溶性I類MHC三分子復(fù)合物。接著從培養(yǎng)基中收獲可溶性I類MHC三分子復(fù)合物，同時繼續(xù)培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞系以產(chǎn)生更多的可溶性I類MHC三分子復(fù)合物，并將單獨的可溶性I類MHC三分子復(fù)合物從其他蛋白質(zhì)中基本上純化出來，其中所述單獨的可溶性I類MHC三分子復(fù)合物保持天然I類MHC三分子復(fù)合物的物理的、功能的和抗原性的完整性，并且其中經(jīng)如此純化的每個三分子復(fù)合物包含相同的重組的單獨的可溶性I類MHC重鏈分子。
[0097]在其他實施方案中，本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思使用由本文中描述的方法產(chǎn)生的可溶性II類HLA三分子復(fù)合物，所述方法在純化、定量和應(yīng)用領(lǐng)域有超越現(xiàn)存方法的進(jìn)步，這些方法以使哺乳動物宿主細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的方式利用重組DNA方法改變蛋白質(zhì)。天然地，II類HLA以內(nèi)源性裝載肽配體并且結(jié)合到膜上的三分子復(fù)合物形式產(chǎn)生。目前主要通過聚集膜結(jié)合形式獲得這種經(jīng)天然加工和裝載的II類。膜結(jié)合II類的產(chǎn)生需要裂解細(xì)胞群以獲得復(fù)合物。該方法被稱為細(xì)胞裂解法，其代表了用于抗HLA抗體測定的天然哺乳細(xì)胞HLA產(chǎn)生的現(xiàn)有技術(shù)水平。II類的細(xì)胞裂解產(chǎn)物是大量細(xì)胞表面組分的混合物，包括膜錨定的II類HLA三·分子復(fù)合物以及散布于細(xì)胞膜中和與HLA共純化的其他非HLA蛋白。從其他細(xì)胞碎片和膜蛋白中分離HLA減少了 II類HLA的產(chǎn)量。當(dāng)從表面活性劑裂解物中產(chǎn)生II類HLA時，面臨著會污染細(xì)胞表面蛋白和/或II類蛋白產(chǎn)量低的問題。作為替代，II類HLA可以從果蜆(Drosophila) Schneider S_2 (昆蟲)細(xì)胞系(Novak等人，1999 ;和2006年8月22日頒給Kwok等人的美國專利第7，094, 555號)和畢赤酵母(P.pastoris)(酵母)(Kalandadze等人，1996)中獲得，由此產(chǎn)生了 II類HLA分子的可溶形式。然而，昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的II類缺少內(nèi)源性裝載的肽，其是天然II類HLA三分子復(fù)合物基本組分。昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的HLA分子還缺少哺乳動物細(xì)胞的天然糖基化。由于昆蟲細(xì)胞缺少哺乳動物蛋白質(zhì)糖基化機制并且缺少裝載天然肽配體所需的分子伴侶復(fù)合物，臨床應(yīng)用中使用來自昆蟲的II類蛋白有些勉強。
[0098]因此，本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思的某些實施方案使用從哺乳動物細(xì)胞中分泌產(chǎn)生的II類HLA的方法產(chǎn)生沒有被膜蛋白污染的天然三分子復(fù)合物。通過從哺乳動物細(xì)胞中分泌II類HLA，產(chǎn)生了其中主要類型是所期望II類HLA三分子復(fù)合物的純產(chǎn)物。純的分泌分子簡化下游純化并且使其能夠進(jìn)行?？扇苄訦LA復(fù)合物有利于中空纖維生物反應(yīng)器生產(chǎn)系統(tǒng)，例如但不限于CELL PHARM?系統(tǒng)(McMurtrey等人,2008 ;Hickman等人，2003和Prilliman等人，1999)以及設(shè)計用于從哺乳動物細(xì)胞中分泌重組天然蛋白質(zhì)的其他系統(tǒng)。高度濃縮的收獲物比細(xì)胞裂解物“干凈”得多，因而由于簡化了純化步驟而使產(chǎn)物損失最小化。
[0099]本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思的其他實施方案可以利用已通過細(xì)胞裂解方法產(chǎn)生和純化的天然形式的II類HLA三分子復(fù)合物；然而，由這些現(xiàn)有技術(shù)方法所生產(chǎn)的復(fù)合物會有不同量的細(xì)胞膜緊縛在純化的HLA產(chǎn)物上，從而會對產(chǎn)生同質(zhì)HLA產(chǎn)物帶來一些挑戰(zhàn)以及出現(xiàn)一些與其應(yīng)用相關(guān)的問題。
[0100]本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思包括可溶性II類HLA三分子復(fù)合物的用途，其通過以獨特和新穎的方式解決當(dāng)使用細(xì)胞裂解和昆蟲細(xì)胞技術(shù)時的局限性的方法在哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生(圖2闡述了生產(chǎn)方法，而圖1表示由所述方法產(chǎn)生的sHLA三分子復(fù)合物)。該生產(chǎn)方法通過使用以下要素的組合克服了現(xiàn)有技術(shù)的劣勢和缺陷:第一，II類HLA復(fù)合物的每條α和β鏈均被截短，通過重組DNA技術(shù)去除正常情況下將復(fù)合物錨定在細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)域。天然形式的II類HLA三分子復(fù)合物α和β鏈依賴跨膜結(jié)構(gòu)域保持天然構(gòu)象。盡管該跨膜結(jié)構(gòu)域的去除有利于分泌，然而這種去除妨礙三分子復(fù)合物的形成。該sHLA生產(chǎn)方法去除了跨膜結(jié)構(gòu)域，并用超二級結(jié)構(gòu)基序(例如但不限于亮氨酸拉鏈蛋白質(zhì)序列)將其替換，所述基序用作II類α和β鏈的系帶部分(tethering moiety)。該超二級結(jié)構(gòu)基序(例如但不限于亮氨酸拉鏈)由此在蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生粘附或融合力。
[0101]該SHLA生產(chǎn)方法可以進(jìn)一步包括在哺乳動物細(xì)胞系中重組生產(chǎn)所期望II類HLA的可溶性α和β鏈。重組哺乳動物細(xì)胞系的使用具有超越現(xiàn)有技術(shù)的兩個明顯的優(yōu)勢:第一，在哺乳動物細(xì)胞系中進(jìn)行生產(chǎn)使得II類HLA分子的α和β鏈以與天然II類HLAa和β鏈中所見的相同方式被糖基化。第二，哺乳動物細(xì)胞系含有用于天然內(nèi)吞作用和溶酶體消化的適當(dāng)?shù)臋C構(gòu)以產(chǎn)生與由天然細(xì)胞所產(chǎn)生的(在本文中被稱為“內(nèi)源性產(chǎn)生的肽配體”)相同的肽配體，以及用于將內(nèi)源性產(chǎn)生的肽配體運輸和裝載至II類HLA分子α和β鏈之間形成的抗原結(jié)合槽中 的適當(dāng)?shù)姆肿影閭H機構(gòu)。
[0102]因此，(a)經(jīng)糖基化的可溶性II類HLAa和β鏈、(b)在非人類哺乳動物細(xì)胞系中(或不表達(dá)內(nèi)源性II類分子的人類細(xì)胞系中)的生產(chǎn)以及(C)非共價連接的內(nèi)源性產(chǎn)生的肽配體的性質(zhì)帶來了明顯的進(jìn)步，這些進(jìn)步克服現(xiàn)有細(xì)胞裂解和非哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)方法中的劣勢和缺陷。
[0103]內(nèi)源性裝載的II類是區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的關(guān)鍵因素。內(nèi)源性肽使II類三分子復(fù)合物可以用于多種應(yīng)用中，此前，以現(xiàn)有技術(shù)的可溶形式(美國專利第7094555號，先前通過引用并入本文；Novak等人，1999以及Kalandadze等人，1996)是不可能的。對于本發(fā)明要求保護的應(yīng)用方法，只有以其天然三分子復(fù)合物形式存在的II類HLA能夠恰當(dāng)?shù)亟Y(jié)合II類HLA特異性抗體。類似地，當(dāng)用于HLA特異性抗體檢測或T細(xì)胞征集時，非糖基化HLA分子對II類抗體表位構(gòu)象的作用是未知的，但是有不恰當(dāng)?shù)奶腔蓴_抗原呈遞的一些證據(jù)(Guerra等人，1998)。因此，產(chǎn)生II類HLA的最有利形式是使所有組分保持天然形式。據(jù)顯示，屬于I類復(fù)合物一部分的肽會間接影響HLA特異性抗體的識別(Wilson，1981)。當(dāng)在HLA抗體血清篩查/移除測定中使用本文中所描述和要求保護的sHLA作為抗原時，HLA特異性抗體的天然結(jié)合是本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思的關(guān)鍵因素。
[0104]在某些實施方式中，本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思利用了由下文所述方法產(chǎn)生的sMHC / sHLA。在該方法中，提供了第一分離的核酸區(qū)段，其中所述第一分離的核酸區(qū)段編碼至少一個II類HLA分子的α鏈的可溶形式，并且提供了第二分離的核酸區(qū)段，其中所述第二分離的核酸區(qū)段編碼至少一個II類HLA分子的β鏈的可溶形式。分離的核酸區(qū)段可以存在于單獨的重組載體中，或者兩個獨立的重組載體中。編碼α鏈和β鏈的跨膜結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)域已經(jīng)去除，并用使α鏈和β鏈(先前是通過其跨膜結(jié)構(gòu)域相互作用)能夠相互作用的超二級結(jié)構(gòu)基序替換。
[0105]可以通過本領(lǐng)域已知的任意方法提供分離的核酸區(qū)段，包括商業(yè)生產(chǎn)合成的區(qū)段。在一個實施方式中，可以通過一種方法提供分離的核酸區(qū)段，該方法包括從基因組DNA或cDNA中對α鏈和β鏈等位基因進(jìn)行PCR擴增的步驟。獲取用于MHC PCR擴增的gDNA或cDNA的方法詳細(xì)描述于發(fā)明人早期的申請中:2001年12月18日提交的美國系列申請第10/022066號，并于2003年9月4日以US2003/0166057A1公開以及2009年4月21日發(fā)行的美國專利第7，521，202號，其全部內(nèi)容在此通過引用明確地并入本文。因此，盡管下面的非限制性實施例以gDNA起始并利用PCR擴增，本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思的范圍不應(yīng)當(dāng)被視為局限于任何特定的起始材料或生產(chǎn)方法，而是包括本領(lǐng)域中已知的提供分離的核酸區(qū)段的任何方法。
[0106]在一個具體的實施方式中，從樣品中獲得gDNA，其中所述gDNA的部分編碼所期望單獨的II類HLA分子的α鏈和β鏈。然后產(chǎn)生兩種PCR產(chǎn)物:編碼所期望II類HLAa鏈的可溶形式的第一 PCR產(chǎn)物以及編碼所期望II類HLA`分子β鏈的可溶形式的第二 PCR產(chǎn)物。每種PCR產(chǎn)物均通過gDNA的PCR擴增產(chǎn)生，其中所述擴增利用至少一條基因座特異性引物，該引物具有摻入3’引物中的亮氨酸序列，從而產(chǎn)生不編碼所期望II類HLAa鏈或β鏈的胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域的PCR產(chǎn)物，這樣產(chǎn)生編碼可溶性II類HLA α鏈或β鏈的PCR產(chǎn)物。用于II類HLA α鏈的PCR擴增的3’引物可以摻入與亮氨酸拉鏈二聚體的酸性序列一致的亮氨酸序列，而用于II類HLAP鏈的PCR擴增的3’引物可以摻入與亮氨酸拉鏈二聚體的堿性序列一致的亮氨酸序列。然而，對于亮氨酸拉鏈基團的描述僅出于示例的目的，本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思包括使用能夠使α鏈和β鏈(先前通過其跨膜結(jié)構(gòu)域相互作用)相互作用的任何超二級結(jié)構(gòu)基序。
[0107]提供了分離的核酸區(qū)段后，接著將其插入到至少一種哺乳動物表達(dá)載體中以形成至少一種含有編碼可溶性II類HLA α鏈和可溶性II類HLA β鏈的PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒。兩個核酸區(qū)段可以插入到相同的載體或不同的載體中。
[0108]接著將含有兩種PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒插入到至少一種合適的永生化的哺乳動物宿主細(xì)胞系中，其中所述細(xì)胞系含有HLA蛋白表達(dá)所需的必要機構(gòu)和轉(zhuǎn)運蛋白，和/或能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)天然地加工成能夠裝載到II類HLA分子的抗原結(jié)合槽中的肽配體。
[0109]隨后，在允許單獨的可溶性II類HLA分子α鏈和β鏈表達(dá)以及具有功能學(xué)活性的單獨的可溶性II類HLA三分子復(fù)合物產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞系，其中所述可溶性II類HLA三分子復(fù)合物包含可溶性α鏈、可溶性β鏈和在由α和β鏈形成的抗原結(jié)合槽中展示的內(nèi)源性裝載的肽。具有功能學(xué)活性的單獨的可溶性II類HLA三分子復(fù)合物保持天然HLA三分子復(fù)合物的物理的、功能的和抗原性的完整性。[0110]本文中描述的分泌的II類產(chǎn)物的主要應(yīng)用是對等待移植的患者進(jìn)行抗HLA抗體篩查?？笻LA抗體篩查試驗的需要是基于觀察到特定事件(例如但不限于輸血、細(xì)菌感染以及懷孕)引發(fā)一個個體產(chǎn)生定向針對于他人HLA的抗體(Bohmig等人,2000 ;Emonds等人，2000以及Howden等人，2000)。在患者接受移植前，必須對此類抗HLA抗體進(jìn)行檢測，否則所移植的器官最終將被排斥。因此，對抗II類HLA抗體的篩查是器官移植的先決條件。
[0111]所有移植患者(在美國每年約20000人)以及所有等待移植的患者(在美國每年約60000人)必須定期(優(yōu)選每月)對靶向他人HLA的抗體進(jìn)行篩查。因此，這些分泌的或可溶的II類HLA(sHLA)產(chǎn)物提供天然的蛋白質(zhì)以快速和準(zhǔn)確地鑒定那些等待移植的患者中的抗HLA抗體。這種移植前的診斷測試將防止器官迅速衰竭。
[0112]本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思進(jìn)一步涉及生產(chǎn)如上文所述的或本文另外涉及的抗MHC去除裝置的方法。在該方法中，具有血清學(xué)活性的可溶性MHC部分(如上文所述)共價偶聯(lián)到固相支持物(如上文所述)上?？扇苄訫HC部分以保持天然MHC三分子復(fù)合物的物理的、功能的和抗原性的完整性的方式附著到固相支持物上。此外，構(gòu)建抗MHC去除裝置，使生物學(xué)樣品與所述裝置接觸，同時使該生物學(xué)樣品可以與其可溶性MHC部分相互作用，由此MHC部分特異性抗MHC抗體附著到可溶性MHC部分上并被檢測和/或從生物學(xué)樣品中去除。生產(chǎn)抗MHC去除裝置的方法可以包括本文涉及或另外描述的或者其他本領(lǐng)域已知的任何步驟。
[0113]本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思進(jìn)一步涉及從生物學(xué)樣品中去除抗MHC抗體的方法。這種抗體去除是有用的，例如，當(dāng)患者的抗HLA抗體對其移植器官進(jìn)行攻擊時。抗HLA抗體還可以在移植之前去除，以達(dá)到更好的效果。去除特定HLA特異性抗體緩解了對于免疫抑制藥物的需求。在從生物學(xué)樣品中去除抗MHC抗體的方法中，提供了如上文所述的抗MHC去除裝置。隨后使生物學(xué)樣品與抗MHC去除裝置接觸，由此從生物學(xué)樣品中去除至少一部分存在于生物學(xué)樣品中具有血清學(xué)活性的可溶性MHC部分(其暴露在抗MHC去除裝置的表面)的特異性抗體。該方法·可以進(jìn)一步包括在與抗MHC去除裝置接觸之后回收生物學(xué)樣品的步驟，這樣，回收的生物學(xué)樣品中MHC基序的特異性抗體大大減少。該方法可以進(jìn)一步包括重復(fù)使生物學(xué)樣品與抗MHC去除裝置接觸以及在所述接觸之后回收生物學(xué)樣品的步驟。使用多輪次處理使得抗體滴度充分減少。在某些實施方式中，回收的生物學(xué)樣品可以基本上不含抗MHC抗體，該抗體對抗MHC去除裝置中具有血清學(xué)活性的可溶性MHC部分的有特異性。
[0114]當(dāng)抗MHC去除裝置包括具有入口、出口和置于其間的空腔(其內(nèi)表面上置有血清學(xué)活性的可溶性MHC部分)的裝置時，生物學(xué)樣品經(jīng)由入口導(dǎo)入到空腔中。隨后生物學(xué)樣品流過該裝置，至少一部分具有血清學(xué)活性的可溶性MHC部分特異性抗MHC抗體與其吸附，并從生物學(xué)樣品中去除。從出口收集流過物，這樣具有血清學(xué)活性的MHC基序特異性抗MHC抗體大大減少。
[0115]當(dāng)抗MHC去除裝置包括人用裝置時，該方法可進(jìn)一步包括將回收的生物學(xué)樣品放回入患者中的步驟，該生物學(xué)樣品最初取自該患者。
[0116]在某些另外的實施方式中，該方法可進(jìn)一步包括從抗MHC去除裝置中洗脫抗MHC抗體的步驟?？梢詫嵤┐瞬襟E以使抗MHC去除裝置可以再生和再次使用?；蛘?，可以回收洗脫下的抗MHC抗體并將其用作臨床試劑。例如但不是以限制的方式，經(jīng)洗脫、回收的抗MHC抗體可以用于診斷和/或臨床效力測試的質(zhì)量控制試劑。因此，包含經(jīng)洗脫、回收的抗MHC抗體的組合物也屬于本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思的范圍。
[0117]本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思進(jìn)一步包括用于從生物學(xué)樣品中去除抗MHC抗體的試劑盒。所述試劑盒可以含有本文中所述的任意裝置，還可以進(jìn)一步含有用于進(jìn)行本文中所述或另外涉及的任意特定方法的其他試劑。這些額外試劑的種類將取決于具體的測定方式，并且確定這些試劑在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。此外，試劑盒中也可包括陽性和/或陰性對照，并且試劑盒可以進(jìn)一步包括一套解釋如何使用試劑盒的書面說明。試劑盒可以進(jìn)一步包括用于從裝置中洗脫抗MHC抗體的試劑(例如競爭性結(jié)合試劑)，從而使其可以再生和再次使用。這種類型的試劑盒可以用于本文中所述的或另外涉及的任意方法中。
[0118]下文提供了實施例。然而，不應(yīng)將本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思理解為其應(yīng)用限制于特定的實驗、結(jié)果和實驗室方法。相反，實施例僅僅是作為多種實施方式之一，其意在進(jìn)行示例而非窮舉。
[0119]實施例1:用于抗MHC去除裝置中的II類sHLA三分子復(fù)合物的產(chǎn)生
[0120]本實施例涉及人單獨的可溶性II類HLA三分子復(fù)合物在哺乳動物永生細(xì)胞系中的表達(dá)。該方法包括使用以改變內(nèi)源性膜結(jié)合復(fù)合物的方式來破壞膜結(jié)合錨定的修飾，從而使細(xì)胞可以分泌II類HLA三分子復(fù)合物。在本實施例中，截短編碼II類HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP的α和β鏈的基因，刪除跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在截短位點處，用亮氨酸拉鏈(一種系帶部分)替換將HLA內(nèi)源性錨定到膜上的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。亮氨酸拉鏈?zhǔn)笻LA可以從細(xì)胞中分泌出來，同時維持II類三分子復(fù)合物的天然構(gòu)象(圖1和2)。亮氨酸拉鏈由位于II類α鏈尾部的酸性區(qū)段和位于II類β鏈尾部的互補性堿性結(jié)構(gòu)域組成。酸性和堿性區(qū)段通過位于每7個氨基酸七肽重復(fù)區(qū)的d位點的氨基酸亮氨酸而融合。Chang于1994年利用該策略將可溶性T細(xì)胞受體的α和β鏈以相同的方式結(jié)合在一起。
[0121]II類HLA復(fù)合物·由命名為α和β的兩條不同的多肽鏈構(gòu)成。在一種方法中，α和β構(gòu)建體是商業(yè)購買的，其直接連接到哺乳動物表達(dá)載體中。在另一種方法中，通過如下面段落所描述PCR擴增，再進(jìn)行純化并連接到哺乳動物表達(dá)載體中而產(chǎn)生構(gòu)建體。
[0122]使用位于HLA-DBa (HLA-DRA)，DRP (HLA-DRB) ; DQa (DQA)，DQP (DQB)或DPa (DPA)和DPP (DPB)基因座上的等位基因的PCR寡核苷酸引物，從基因組DNA或cDNA中擴增特異性II類HLA基因。β鏈3’ PCR引物摻入與亮氨酸拉鏈二聚體的堿性序列一致的亮氨酸序列。α鏈3’PCR引物摻入與亮氨酸拉鏈二聚體的酸性序列一致的亮氨酸序列。通過布置PCR引物而截短II類基因，消除了胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域，從而產(chǎn)生具有亮氨酸拉鏈基團的II類HLA三分子復(fù)合物的可溶形式。
[0123]圖15-17表示在本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思的sHLA生產(chǎn)方法中所使用的構(gòu)建體。圖15圖解了 DRAl*0101a鏈-亮氨酸拉鏈構(gòu)建體的核酸和氨基酸序列(分別為SEQ ID NO:1和2)。圖16圖解了 DRA1*0401 β鏈-亮氨酸拉鏈構(gòu)建體的核酸和氨基酸序列(分別為SEQ ID NO:3和4)。圖17圖解了 DRB1*0103 β鏈-亮氨酸拉鏈構(gòu)建體的核酸和氨基酸序列(分別為SEQ ID NO: 5和6)。
[0124]隨后將該構(gòu)建體插入到哺乳動物表達(dá)載體中。在一個例子中，用一組限制性酶切割α鏈，而用另外一組限制性酶切割β鏈。將經(jīng)純化和切割的α鏈擴增產(chǎn)物連接到哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3.1中。接著，將含有II類sHLAa基因的該連接后的載體轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌(E.coli)菌株JM109中。細(xì)菌在含有抗生素的固體培養(yǎng)基生長以挑選陽性克隆。從該平板上挑取菌落，使其生長并檢驗是否含有插入?yún)^(qū)段。從經(jīng)鑒定為陽性的克隆中分離質(zhì)粒DNA，隨后進(jìn)行DNA測序以確保經(jīng)克隆的α基因的保真性。
[0125]用第二組限制性酶再次切割α載體，所述限制性酶輔助經(jīng)純化的PPCR產(chǎn)物的定向克隆。最終的連接產(chǎn)物由α克隆和β克隆二者組成。然后從陽性克隆中分離質(zhì)粒DNA，對這些克隆中的β基因進(jìn)行DNA測序。
[0126]制備II類α和β等位基因的質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行DNA測序以確認(rèn)所擴增II類基因的保真性。在塑料電穿孔杯(electrocuvette)中將處于對數(shù)生長期的哺乳動物細(xì)胞與質(zhì)粒DNA混合。對該混合物進(jìn)行電穿孔，置于冰上，并重懸于培養(yǎng)基中。需要對于電穿孔步驟進(jìn)行特殊優(yōu)化，以使得本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思能夠成功實現(xiàn)。在發(fā)明人進(jìn)行的大量實驗中以及如其他實驗室在出版物中所報道，標(biāo)準(zhǔn)的電穿孔方法均不成功。
[0127]在CO2孵育器中于37°C孵育2天之后，用抗生素對細(xì)胞進(jìn)行選擇。首先進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并確定活力。然后在條件完全培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。接著，將細(xì)胞置于24孔板的每個孔中并進(jìn)行選擇。從每個孔中采集上清液，并進(jìn)行ELISA測定以確定II類sHLA的產(chǎn)生。擴增和凍存產(chǎn)量高的細(xì)胞以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。
[0128]在CELL PHARM?生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)之前，優(yōu)化每種細(xì)胞系的細(xì)胞生長參數(shù)(pH、葡萄糖和血清供應(yīng))以在生物反應(yīng)器中生長。用補充了青霉素/鏈霉素和血清或ITS (胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒)添加物的培養(yǎng)基在轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)大約8升天然的或被病原體感染的sHLA-分泌型II類轉(zhuǎn)染子。調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)物的總體積，從而獲得約5 X IO9個細(xì)胞。離心沉淀細(xì)胞，并在CELL PHARM?進(jìn)料瓶中將細(xì)胞重懸于300ml條件培養(yǎng)基中。通過UnisynCP2500CELL PHARM?的ECS進(jìn)料泵將細(xì)胞和條件培養(yǎng)基接種至預(yù)先用補充了青霉素/鏈霉素和血清或ITS的培養(yǎng)基填裝的30kDa分子量截斷值的中空纖維生物反應(yīng)器中。繼續(xù)在CELL PHARM?中培養(yǎng)細(xì)胞，持續(xù)監(jiān)測葡萄糖、PH和感染。監(jiān)測并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基進(jìn)料速率，以維持70-110mg/dL的葡萄糖 水平。圖3提供了 CELL PHARM?生物反應(yīng)器系統(tǒng)的概述；sHLA分泌型細(xì)胞及其sHLA產(chǎn)物包含在中空纖維生物反應(yīng)器的毛細(xì)管外空間(ECS)之中。細(xì)胞所需的養(yǎng)分和空氣由再循環(huán)培養(yǎng)基提供。
[0129]圖4A闡述了當(dāng)擴大規(guī)模至生物反應(yīng)器生產(chǎn)時，由轉(zhuǎn)染細(xì)胞所產(chǎn)生的II類sHLADRB1*0103的產(chǎn)量增加。利用偶聯(lián)到經(jīng)CNBr-活化的SEPHAROSE? 4B上的特異性抗II類HLA抗體L243從細(xì)胞上清液中純化出sHLA，并通過micro-BCA蛋白質(zhì)分析、UV吸收和ELISA確定蛋白質(zhì)濃度。II類sHLA典型的生產(chǎn)運行效價為約4_5mg/升生長培養(yǎng)基。圖4B闡述了利用單克隆抗體L243，這些三分子復(fù)合物在多種緩沖液和寬范圍的pH濃度中是非常穩(wěn)定的，所述單克隆抗體L243可與幾乎所有的DR HLA蛋白反應(yīng)。L243是先前由Lampson&Levy (1980)所描述的鼠源IgG2a抗HLA-DR單克隆抗體,所述單克隆抗體已保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection), Rockville, Md,保藏號為 ATCC HB55。
[0130]在圖5中，經(jīng)純化的II類sHLA三分子復(fù)合物的血清學(xué)完整性是通過直接將復(fù)合物涂覆在平板上并將涂覆的復(fù)合物暴露于限定的市售HlAbs和患者血清證實的。此外，將sHLA與全長分子進(jìn)行比較，顯示其在抗原性上沒有差別。
[0131]圖6闡述了利用本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思的方法生產(chǎn)多種不同的II類sHLA 三分子復(fù)合物的能力。而 DRB1*0101、DRB1*0103、DRB1*1101、DRB1*1301 和 DRB1*1501僅出于示例目的而展示，根據(jù)本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思還生產(chǎn)了毫克量的多種其他II類sHLA三分子復(fù)合物。利用L243ELISA測定檢測和定量了每種sHLA DR蛋白質(zhì)的三分子復(fù)合物。
[0132]圖7-9闡述了根據(jù)本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思的II類sHLA生產(chǎn)的另一個示例。在該示例中，用可溶性HLA-DRB*0103 / DRA*0101構(gòu)建體(具有亮氨酸拉鏈的DRB1*0101可溶性α鏈和具有亮氨酸拉鏈的DRB1*0103可溶性β鏈)轉(zhuǎn)染的永生化細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶中生長直至獲得總共11°個細(xì)胞。然后將細(xì)胞接種到2個中空纖維生物反應(yīng)器單元的ECS部分中。細(xì)胞在ECS內(nèi)的DMEM+10% FBS中生長，而在ICS中則沒有FBS。每天收集ECS收獲物直至細(xì)胞死亡并不再產(chǎn)生可溶性HLA。利用捕獲ELISA對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。對于此ELISA，用亮氨酸拉鏈的特異性抗體(2H11)作為捕獲抗體，II類HLA的特異性抗體(L243)用作檢測抗體。將約8mg可溶性HLA裝載到親和抗體(L243)柱中，并在堿性緩沖液(0.1M甘氨酸，pHll)中洗脫。收集含有可溶性HLA的流分并將其凍干。將凍干物重懸于水/ 20%乙腈中，并裝載到C18RP-HPLC柱中。然后使用20%至80%乙腈梯度洗脫可溶性HLA，并利用電噴霧離子化TOF質(zhì)譜進(jìn)行檢測。
[0133]如在圖7中所見，以生物反應(yīng)器方式產(chǎn)生了毫克量的可溶形式的單一 II類HLA異源二聚體。此外，純化出了無其他污染性蛋白質(zhì)的如LCMS所確定的完整異源二聚體(圖9)。與天然II類HLA —致，該可溶性II類含有單糖基化的β鏈和二糖基化的α鏈(圖8)。此外，各種糖型(glycoform)與蛋白質(zhì)運送至細(xì)胞表面時所發(fā)生的糖類中天然變化相一致。對于II類分子的一個亞群，胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解事件將亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域中除兩個氨基酸之外的全部氨基酸從α和β鏈兩者中去除。然而，同全長構(gòu)建體一樣，無亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的II類分子由于α和β鏈兩者的共洗脫而保持為異源二聚體。這些可溶性I類和II類HLA蛋白可以利用質(zhì)譜進(jìn)行分析，而這些`蛋白質(zhì)的純度和鑒定可以通過分子量TOF分析確認(rèn)(圖9)。
[0134]實施例2:11類sHLA用于抗體去除的用途
[0135]本文還顯示了本發(fā)明公開和要求保護保護的發(fā)明構(gòu)思的可溶性II類HLA三分子復(fù)合物能夠成功地用于抗體去除技術(shù)之中，如圖10-14所示。
[0136]圖10圖示了將II類可溶性DRB1*1101ZP HLA三分子復(fù)合物偶聯(lián)到固相支持物上及其以ELISA方式輔助去除II類HLA特異性抗體的用途。A圖包含為了特異性抗體去除所實施的連續(xù)吸收基質(zhì)ELISA的圖表。簡言之，將可溶性II類HLA DRB1*1101 /DRA1*0101ZP(標(biāo)記為DRB1*1101)涂覆在標(biāo)準(zhǔn)ELISA平板上，并用BSA封閉。然后制備生物素標(biāo)記的II類HLA特異性抗體，根據(jù)預(yù)先確定的最佳結(jié)合效價進(jìn)行稀釋，并加入到10個孔中作為SI。保留該原始稀釋液的一小部分(200μ I)作為S(O)。使抗體在室溫下結(jié)合30分鐘，此后將各個孔中的全部內(nèi)容物(<200μ I)移至相應(yīng)的新孔中(S2)，并將BSA緩沖液加至SI孔中。重復(fù)此整個過程總計9個樣品輪次(S1-S9)。對于每個輪次，保留一個孔中的樣品，置于離心管中，以用于評估殘留在滯留物溶液中的抗體量。這些被標(biāo)記為S(n)。在吸收過程完成之后，用HRP / (PD過氧化物酶底物使平板顯影，并以“吸光度”繪制曲線。也可以以同樣的方式在一塊單獨的ELISA板上讀取保留物樣品。將這些以“保留物”繪制曲線。B圖描述了來自于3個不同的II類HLA特異性mAb抗體的吸光度和保留物數(shù)值:使L243、OL(One Lambda)和以及2H11經(jīng)過連續(xù)吸收基質(zhì)。重組地添加到可溶性II類HLA分子中的II類HLA分子特異性的L243和OL mAb和拉鏈尾部區(qū)段特異性的2HllmAb顯示，通過每個輪次的ELISA II類HLA抗體的吸光度和保留物降低。包括了一種對照mAb抗體，W6 / 32，其具有I類HLA分子特異性，未吸附在平板上，僅在保留物中找到。
[0137]圖11圖示了 ELISA方式中，DRB1*1101特異性人血清被可溶性DRB1*1101所識別。利用可溶性 II 類 HLADRB1*1101 / DRA1*0101ZP (標(biāo)記為 DRB1*1101)，用可溶性 II 類 HLA等位基因直接涂覆ELISA平板。將來自于先前已知具有DRB1*1101反應(yīng)性的兩名人類供者的血清樣品以1X(未稀釋)至5000X范圍的稀釋度加入到平板中。洗滌平板，加入生物素化的山羊抗人IgG第二抗體。用HRP / OPD過氧化物酶底物使平板顯影并讀取490nm處的吸光度?？梢钥吹絻擅┱叩难蹇贵w反應(yīng)性稀釋曲線，其相當(dāng)于DRB1*1101的特異性親和力。
[0138]圖12圖示了可溶性DRB1*1101可被偶聯(lián)到SEPHAROSE?上并用于吸附II類HLA特異性抗體9.3F10。在A圖中，將4mg可溶性DRB1*1101偶聯(lián)到Iml SEPHAROSE?Fast Flow上并包裝進(jìn)重力柱中。使具有DR反應(yīng)性的100 μ g / ml mAb9.3F10 (在I XPBS中)的已知混合物流經(jīng)柱,并用IXPBS洗滌。收集共計23種200μ I流過物流分，稱重并測量其0D280nm。將數(shù)值轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)總量。為了洗脫柱，將大約4ml DEA(二乙醇胺，pHll.3)緩沖液加入到柱子中，以200 μ I的量收集流分。也對洗脫液進(jìn)行稱重，測量280nm的光密度，并將其轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)總量。
[0139]在圖12的B圖中，還對流過物和洗脫物實施對于小鼠總IgG和人HLA的兩個獨立的ELISA，以檢測可能已經(jīng)從柱中洗脫下來的特異性抗體(針對HLA蛋白)。由于ELISA敏感性的增加，在流過物中所看到的微量蛋白質(zhì)在抗體ELISA中顯示出小峰。然而，重要的是，在流過物中并沒有看到HL·A，但是當(dāng)加入DEA時HLA確實從柱中洗脫了下來。
[0140]圖13圖示了人血清中含有的DRB1*1101特異性抗體可以被DRB1*1101特異性柱去除。使供者#1的血清流過DRB1*1101 SEPHAROSE?柱，并收集兩份2ml流過物流分。為了進(jìn)行洗脫，將DEA(pHl1.3)緩沖液加入柱中，并收集兩份2ml流分。在A圖中，實施直接的DRB1*1101ELISA以檢測流過物和洗脫物中殘留的DRB1*1101特異性抗體的量。流過物和洗脫物組分以1X(沒有稀釋)至5000X進(jìn)行稀釋，并使用生物素化的山羊抗人第二抗體以及隨后的HRP / OPD過氧化物酶底物進(jìn)行顯影。讀取平板的490nm光密度。在B圖中，還實施了人總IgG夾心ELISA,以評估總?cè)薎gG的流過?？梢钥吹娇?cè)薎gG的流過；然而，僅DRB1*1101抗體被柱保留，并且只有當(dāng)柱被洗脫時才能看到。
[0141]圖14圖示了偶聯(lián)可溶性DRB1*1101的SEPHAROSE?具有DRB1*1101而非其他DR等位基因的特異性。使供者#2的血清以與圖13相同的方式流過相同的DR1*1101柱，對兩份流過物流分和一份洗脫物組分進(jìn)行多等位基因DR反應(yīng)性的評估。簡言之，將經(jīng)膜去污劑純化的多個DR等位基因以及可溶性產(chǎn)生的兩個DR等位基因以先前所確定的最佳反應(yīng)性的量涂覆在96孔ELISA平板上。將兩份流過物流分和一份洗脫物流分與原血清樣品進(jìn)行反應(yīng)性的比較?？紤]到大部分特異性反應(yīng)性包含在洗脫物#1(圖14)中，因此沒有對第二份洗脫物流分進(jìn)行評估。除可溶性DRB1*1101(DRB1*1101ZP)等位基因外，普遍看到了低反應(yīng)性，其僅對血清樣品而且僅對洗脫物而非流過物顯示出高反應(yīng)性(第一個帶框區(qū)域)。血清中還包含針對第二個等位基因DRB1*1601具有強反應(yīng)性的抗體(第二個帶框區(qū)域)，其通過流過物而非洗脫物。
[0142]因此，本實施例顯示，基于與已結(jié)合的II類HLA蛋白的親和力，以柱方式固定的II類sHLA三分子復(fù)合物能夠在單次流過中選擇性地并且有效地去除絕大多數(shù)抗HLA特異性抗體，而不會去除與抗原性不相似的HLA分子相結(jié)合的抗體。這些數(shù)據(jù)顯示，可以使用根據(jù)本發(fā)明公開和要求保護的發(fā)明構(gòu)思所產(chǎn)生的II類sHLA蛋白構(gòu)建高特異性和高效的抗體去
除裝置。
[0143]實施例3:從敏化的人血清中分離HLA-DRll抗體
[0144]為了檢驗以下假設(shè)，即基于抗原對天然存在的多克隆抗HLA抗體進(jìn)行分離將有助于表征同種異體的抗HLA抗體應(yīng)答，以其天然構(gòu)象形式產(chǎn)生了數(shù)量可觀的可溶性II類HLA分子。接著，用這一 HLA試劑構(gòu)建首次報道的HLA免疫親和柱。然后使含有抗HLA抗體復(fù)雜混合物的供者血清流過該柱。特定II類HLA的特異性抗體保留在柱上，隨后通過洗脫回收這些免疫球蛋白并進(jìn)行表征。抗原特異性抗體的表型和功能譜使得理解抗HLA抗體如何促進(jìn)器官排斥的能力而言大大提高。這項技術(shù)的有力的應(yīng)用將能夠區(qū)分補體固定化抗體(complement-fixing antibodies),所述補體固定化抗體代表較少關(guān)注的來自頑固體液應(yīng)答的移植禁忌癥。這些用天然可溶性HLA構(gòu)建的免疫親和柱還為對同種異源HLA具有強抗體反應(yīng)性的患者提供了新一代的治療手段。
[0145]實施例3的材料和方法
[0146]患者血清樣本:購買供者I的血清作為HLA-DRll抗血清(Gen-Probe, Inc., SanDiego, CA)。從DRll敏化的腎臟受者中收集供者2血清，此過程依照德克薩斯州大學(xué)西南倫理評審委員會批準(zhǔn)的方法，并使用知情同意書。供者2是一名50歲的男性，曾接受6 /6不匹配(移植HLA:A2、A3、B62、B51、DR4、DR11)的腎臟移植。在移植之后，供者2排斥移植物并產(chǎn)生抗HLA抗體。收集約5ml全血`并使其凝固。然后將血液離心，將血清與沉淀分離。將血清儲存于4°C直至檢測。
[0147]sHLA-DRll蛋白的產(chǎn)生。為了產(chǎn)生分泌性HLA-DRB11 (sHLA)分子，通過PCR突變對HLA-DRA1*01:01和HLA_DRB1*11:01的α鏈cDNA進(jìn)行修飾，以刪除編碼跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的密碼子并加入亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。對于DRA*01:01，加入7氨基酸的接頭(DVGGGGG ；SEQ ID NO:7)，隨后是亮氨酸拉鏈ACIDpl。對于DRB*11:01，使用相同的接頭，隨后是亮氨酸拉鏈 BASEpl 序列(Busch 等人，2002)。分別將 sHLA_DRAl*01:01 和 sHLA_DRBl*ll:01克隆到哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3.1(-)遺傳霉素和博來霉素中(Invitrogen，LifeTechnologies, Grand Island, NY)。通過電穿孔將 sHLA_DRAl*ll:01 和 sHLA_DRBl*01:01轉(zhuǎn)染II類HLA缺陷型B-LCL細(xì)胞系NS1(ATCC#TIB-18)中。在電穿孔后兩天，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有G418(0.8mg / ml)和博來霉素(lmg/ml)的選擇性培養(yǎng)基中。通過夾心ELISA，用作為捕獲抗體的L243 (Leinco Technologies I nc.，St.Louis, MO)和II類特異性商業(yè)檢測抗體(One Lambda Class II, One Lambda Inc.，Canoga Park, CA),對耐藥性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子進(jìn)行II類sHLA分子產(chǎn)生的測定。通過ELISA對具有克隆細(xì)胞群的各個孔進(jìn)行II類sHLA產(chǎn)生的測定，并將具有最高產(chǎn)量的克隆在ACUSYST-MAXIMIZER?中空纖維生物反應(yīng)器(Biovest International, Inc.,Minneapolis,MN)中擴大培養(yǎng)。從每個生物反應(yīng)器中收集約25mg sHLA-DRll0將含有sHLA-DRll的上清液裝載到L243免疫親和柱上，并用40倍柱體積的20mM磷酸緩沖液(pH為7.4)洗滌。用50mMDEA(pHll.3)將sHLA-DRll分子從親和柱上洗脫下來，用IM TRIS(pH7.0)中和，于無菌PBS中進(jìn)行緩沖液替換并以lmg/ml儲存。
[0148]質(zhì)譜:用二硫蘇糖醇(Sigma-Aldrich D0632)使10 μ g經(jīng)純化的sHLA-DRll還原和變性，并于95°C C孵育5分鐘。然后用碘乙酰胺(Thermo Scientific89671F)使樣品烷基化，于室溫下I小時。利用標(biāo)準(zhǔn)的兩步消化方法(Thermo Scientific90055)用胰蛋白酶對變性的蛋白質(zhì)進(jìn)行消化。將胰蛋白酶肽于30%乙酸/ 70%超純水中復(fù)原，并裝載到帶有PEPMAP?100C1875 μ mX 15cm, 3 μ mlOOA 反相柱的ULTIMATE? 3000HPLC系統(tǒng)上(Dionex，Thermo Fisher Scientific, Inc., Sunnyvale, CA)。將妝洗脫下來，并用 Mascot 軟件在QTOF QSTAR? Elite 質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析(ABI, Thermo Fisher Scientific, MDS Sciex)。
[0149]用DRB1*11:01偶聯(lián)的SEPHAROSE?親和柱去除抗體。對于Iml的sHLA-DRll親和柱，使 SEPHAROSE ? 4Fast Flow (GE Healthcare)膨脹并用冰冷的 ImM 的HCl (pH3.0)洗滌4次。將膨脹的基質(zhì)與sHLA-DRll (4mg)以1.6mg / ml的終反應(yīng)濃度在碳酸氫鹽偶聯(lián)溶液中混合。反應(yīng)之后，在偶聯(lián)溶液中洗滌基質(zhì)3次，并用0.1M的TRIS (pH8.0)封閉。然后將經(jīng)偶聯(lián)的基質(zhì)裝載進(jìn)小的2ml柱中。
[0150]將lml200 μ g / ml的L243抗體溶液或Iml的人總血清施加到基質(zhì)上，并使其在重力作用下被吸附。加樣后，加入4ml PBS(pH7.4)。在該裝載步驟期間，人工收集25份流分，每個流分包含~200μ I。最后，用5ml50mM的DEA(pHll.3)對柱進(jìn)行洗脫。在洗脫過程中收集20份流分，并立即用35 μ IlM的TRIS中和。對于L243，通過OD28tl測量所收集流分中的抗體含量。每個上述過程后，用DEA (pHl1.3)，隨后再用50ml洗滌緩沖液(PBS pH7.4)對柱子進(jìn)行模擬洗脫。
[0151]II類HLA單個抗原微珠測定和Ig分型。利用基于:Luminex?的II類HLA單個抗原測定(Gen-Probe GTI Diagnostics),根據(jù)制造商的操作手冊確定上柱前的血清、流過物和洗脫物中抗HLA抗體的特異性。簡言之，將40 μ I微珠懸浮液與10 μ I待測樣品在室溫下孵育30分鐘。洗滌微珠，并將其與檢測抗體在室溫下孵育30分鐘，然后洗滌并在LUMINEX? 100 分析儀上進(jìn)行分析。使用MATCHIT? (Gen-Probe GTI Diagnostics,San Diego, CA)和EXCEL? (Microsoft)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?；诠舅x的背景水平，將起始血清和流過物的數(shù)據(jù)顯示為經(jīng)背景校正的中間熒光強度(BCMFI)數(shù)值，所述背景水平是批次特異性的并通過標(biāo)準(zhǔn)陰性血清而確定。洗脫物的背景要小得多，因此其背景被定義為最小微珠MFI。對于流過物，用起始血清中的平均DQ BCMFI對其BCMFI數(shù)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(表1和表2)。用起始血清中的DRB1*11:01BCMFI對洗脫物BCMFI數(shù)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(表1和2)。
[0152]對于抗體分型和定量，根據(jù)制造商的操作說明使用BIO-PLEX PRO?免疫球蛋白分型試劑盒(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)。簡言之,制備10倍系列稀釋的樣品，將50μ I樣品與50μ I微珠懸浮液在室溫下孵育30分鐘。洗滌微珠，將其與檢測抗體在室溫下孵育30分鐘。最后，洗滌微珠并在LUMINEX? 100 (One Lambda, Inc.)上進(jìn)行分析。使用Ig特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線將樣品MFI值轉(zhuǎn)換為Ig濃度。
[0153]補體依賴性細(xì)胞溶解。使用Lambda Cell Tray確定補體依賴性細(xì)胞溶解(OTC):所分析的30B細(xì)胞板(One Lambda, Inc.)細(xì)胞系是DRll陽性的。細(xì)胞系II類HLA單倍型如下。C433:DR4、DR11、DR52、DR53、DQ7。C418:DR4、DR11、DR52、DR53、DQ7。C423:DR11、DR13、DR52、DQ6、DQ7。C428:DR11、DR17、DR52、DQ2、DQ7 (One Lambda，Inc.)。根據(jù)制造商的操作手冊對所示樣品進(jìn)行裂解。使用兔的補體作為補體來源。裂解之后，使用FL0R0QUENCH?染料(One Lambda, Inc.)區(qū)分活細(xì)胞和裂解細(xì)胞。然后使用Nikon TE200-E熒光顯微鏡對活細(xì)胞和裂解細(xì)胞進(jìn)行分析。對于綠色濾光片(激發(fā):490nm bp20，發(fā)射:520nm bp38)和紅色濾光片(激發(fā):555nm bp28，發(fā)射:617nm bp73)都使用4X物鏡生成每個孔的全孔圖像。利用MetaMorph v7.5.5.0來確定兩個通道中的總熒光，并以紅色熒光/紅色熒光+綠色熒光計算細(xì)胞死亡的百分比。
[0154]實施例3的結(jié)果
[0155]可溶性II類HLA的產(chǎn)生和純化。抗II類HLA抗體的特異性分離需要有豐富的天然II類HLA的來源。盡管存在多種用于獲得HLA蛋白的技術(shù)，但是在本實施例中，在哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生可溶性分子，因為這些HLA是糖基化的、天然裝載的配體，并且具有與抗體的完全反應(yīng)性。II類HLA以α/β異源二聚體形式存在而這些蛋白質(zhì)必須特異性配對以行使功能是一個挑戰(zhàn)。先前的研究通過用互補的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域同時替換α和β鏈上的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已經(jīng)使得II類可溶性HLA異二聚體穩(wěn)定(Busch等人，2002和Kalandadze等人，1996)，但是這些研究僅僅使用非哺乳動物細(xì)胞獲得成功。在此，使用該方法生成HLA-DRA1*01:01和HLA_DRB1*11:01構(gòu)建體，其中跨膜結(jié)構(gòu)域被7氨基酸的接頭，隨后分別是ACIDpl或BASEpl亮氨酸結(jié)構(gòu)域所替換(圖18A)。
[0156]選擇鼠類細(xì)胞系進(jìn)行產(chǎn)生sHLA-DRll，因為發(fā)明人假定，內(nèi)源性小鼠II類MHCa和β蛋白(H2-Ad，H2-Ed)不會與可溶性人類II類HLA的α和β蛋白配對，也不會干擾可溶性α和β HLA蛋白的預(yù)期配對。為了證實經(jīng)純化的sHLA-DRll不含小鼠的α和β鏈，用胰蛋白酶對經(jīng)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行消化，將對得到的肽進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜(LCMS)分析。在BLAST分析中，肽的序列顯示與內(nèi)源性小鼠II類MHC(H2-Ad，H2_Ed)不匹配，盡管檢測到了來自染到細(xì)胞中的sHLA-DRll·構(gòu)建體α和β鏈中的肽序列(圖18Β)。因此，可以得出結(jié)論，產(chǎn)生并純化出了所期望sDRll的α和β鏈而沒有受到其他II類MHC亞基的污染。
[0157]抗II類HLA抗體的柱去除。為了以免疫親和柱方式測試II類sHLA，純化sHLA-DRll并將其偶聯(lián)到經(jīng)CNBr活化的S印harose_4Fast Flow固相支持基質(zhì)上。使抗HLA-DR單克隆抗體L243流過親和柱，以測試在偶聯(lián)過程中sHLA-DRll復(fù)合物是否保持完整以及測量柱的結(jié)合能力。在裝載過程中收集200 μ I—份的流分(流過物)，所結(jié)合的L243被完整地洗脫下來。在流過物和洗脫物之間，裝載到柱上的抗體回收了 78% (170.6 yg),其中28% (47.8 μ g)在流過物中，72% (122.9 μ g)在洗脫物中(圖19A)。此外，被捕獲并洗脫的L243抗體保持其HLA-DR結(jié)合活性和特異性(圖19B)。這些結(jié)果表明，當(dāng)偶聯(lián)到親和柱基質(zhì)上時，HLA-DRlI保持其天然構(gòu)象，sHLA-DRll柱能夠用于去除和回收完整的抗HLA抗體。
[0158]清除和回收來自患者血清的抗HLA-DRlI抗體。接著，測試柱子能否用于從患者血清中清除抗HLA-DRl I抗體。對來自于兩名DRll敏化的患者的血清進(jìn)行分析，分析其對于起始血清(裝載到柱中之前)、流過物和洗脫物中的多種II類HLA類型的反應(yīng)性。兩者的起始血清均含有與多種DR和DQ特性均具有反應(yīng)性的多克隆抗HLA抗體復(fù)雜混合物(圖20A和B)。在流過DRll柱之后，來自于每名供者的流過物和洗脫物的HLA反應(yīng)性模式差異很大(圖20C和D)。在供者I的血清中，HLA-DQ (紅色)和DP (綠色)特異性抗體流過柱，而DR11、13、8和4的大部分抗體從血清中清除出去，并隨后回收于洗脫物中。同樣，在供者2的血清中，HLA-DQ和-DP特異性抗體流過柱。然而，和供者I的血清不同的是，來自于供者2血清中的大部分DR9和DR7特異性抗體流過柱，而DRll和DR13的抗體被保留并隨后被洗脫。在洗脫物中僅回收到少量的DR9和DR7特異性抗體。起始血清、收集的流過物(流分2-11)以及收集的洗脫物(流分2-6)中所有II類HLA反應(yīng)性概括于圖23中。
[0159]在流過柱之前，這些血清識別大量的DR特異性(供者I中11種HLA-DR，供者2中17種HLA-DR)。顯著的是，DRll柱清除了供者I中100% (11 / 11)以及供者2中的88%(15 / 17)的DR反應(yīng)性抗體(圖23，表1和2)，而沒有回收到HLA-DQ或DP反應(yīng)性抗體。因此，DRll柱去除了針對多種血清學(xué)相關(guān)HLA-DR特異性的抗體，而與HLA-DQ和-DP具有反應(yīng)性的抗體卻沒有結(jié)合。這些結(jié)果顯示，DRll特異性抗體可從患者血清中清除和回收，而與其他抗原具有反應(yīng)性的抗體并不會被保留。
[0160]表1
【權(quán)利要求】
1.抗MHC去除裝置，其包括: 固相支持物； 共價偶聯(lián)到固相支持物上并且置于抗MHC去除裝置表面的具有血清學(xué)活性的可溶性MHC部分，所述MHC部分能夠與接觸到所述裝置表面的樣品相互作用，所述裝置表面具有置于其上的具有血清學(xué)活性的可溶性MHC部分，其中樣品中存在的MHC部分特異性抗體將與其結(jié)合，使得所述抗體從樣品中去除。
2.權(quán)利要求1的抗MHC去除裝置，其中進(jìn)一步限定所述MHC部分為可溶性I類HLA三分子復(fù)合物。
3.權(quán)利要求2的抗MHC去除裝置，其中可溶性I類HLA三分子復(fù)合物由包括以下步驟的方法產(chǎn)生: 提供編碼所期望的單獨的I類MHC重鏈的核苷酸區(qū)段，所述核苷酸區(qū)段中去除了編碼所期望的單獨的I類MHC重鏈等位基因的胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)，這樣所述核苷酸區(qū)段編碼截短的可溶形式的所期望的單獨的I類MHC重鏈分子； 將所述核苷酸區(qū)段克隆到哺乳動物表達(dá)載體中，從而形成編碼所期望的單獨的可溶性I類MHC重鏈分子的構(gòu)建體； 用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞系，以提供表達(dá)編碼重組的單獨的可溶性I類MHC重鏈分子的構(gòu)建體的哺乳動物細(xì)胞系，其中所述哺乳動物細(xì)胞系能夠天然地將蛋白質(zhì)加工成裝載到MHC分子的抗原結(jié)合槽中的肽配體，并且其中所述哺乳動物細(xì)胞系表達(dá)β -2-微球蛋白； 在允許重組的單獨的可溶性I類MHC重鏈分子從構(gòu)建體中表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述哺乳動物細(xì)胞系，此類條件還 允許肽配體內(nèi)源性裝載到每個重組的單獨的可溶性I類MHC重鏈分子的抗原結(jié)合槽中并與天然的內(nèi)源性產(chǎn)生的β-2-微球蛋白的非共價關(guān)聯(lián)，以形成單獨的可溶性I類MHC三分子復(fù)合物，隨后從細(xì)胞中分泌單獨的可溶性I類MHC三分子復(fù)合物；從培養(yǎng)物中收集可溶性I類MHC三分子復(fù)合物，同時將哺乳動物細(xì)胞系保留在培養(yǎng)物中以生產(chǎn)更多的可溶性I類MHC三分子復(fù)合物；和 將單獨的可溶I類MHC三分子復(fù)合物從其他蛋白中基本上純化出來，其中所述單獨的可溶I類MHC三分子復(fù)合物保持天然I類MHC三分子復(fù)合物的物理的、功能的和抗原性的完整性,并且其中如此純化的每個三分子復(fù)合物包含一致的重組的單獨的可溶性I類MHC重鏈分子。
4.權(quán)利要求1的抗MHC去除裝置，其中進(jìn)一步限定所述MHC部分為可溶性II類HLA三分子復(fù)合物。
5.權(quán)利要求4的抗MHC去除裝置，其中所述可溶性II類HLA三分子復(fù)合物由包括以下步驟的方法產(chǎn)生: 提供編碼可溶形式的II類HLA分子α鏈的第一分離的核酸區(qū)段，所述α鏈具有連接于其上的超二級結(jié)構(gòu)基序的第一結(jié)構(gòu)域； 提供編碼可溶形式的II類HLA分子β鏈的第二分離的核酸區(qū)段，所述β鏈具有連接于其上的所述超二級結(jié)構(gòu)基序的第二結(jié)構(gòu)域； 將第一和第二分離的核酸區(qū)段插入到哺乳動物細(xì)胞系中，其中所述哺乳動物細(xì)胞系不表達(dá)內(nèi)源性II類HLA，并且其中所述哺乳動物細(xì)胞系包含其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化所需的糖基化機制和肽配體裝載到II類HLA分子中所需的分子伴侶復(fù)合物； 在這樣的條件下培養(yǎng)所述重組的哺乳動物細(xì)胞系，所述條件允許可溶性II類α和β鏈表達(dá)、可溶性II類α和β鏈通過所述超二級結(jié)構(gòu)基序的第一和第二結(jié)構(gòu)域關(guān)聯(lián)、可溶性II類α和β鏈糖基化以及將內(nèi)源性產(chǎn)生的非共價關(guān)聯(lián)的肽配體裝載到由可溶性II類α和β鏈形成的抗原結(jié)合槽中，從而產(chǎn)生可溶性II類三分子復(fù)合物； 分離從所述重組的哺乳動物細(xì)胞系中分泌的可溶性II類三分子復(fù)合物；和 將可溶性II類三分子復(fù)合物從其他蛋白質(zhì)中基本上純化出來。
6.權(quán)利要求1-5任一項的抗MHC去除裝置，其中所述固相支持物選自由管(well)、珠、膜、微量滴定板、基質(zhì)、孔、塑料、玻璃、聚合物、多糖、尼龍、硝酸纖維素、順磁性化合物及其組合組成的組。
7.權(quán)利要求6的抗MHC去除裝置，其中所述固相支持物被進(jìn)一步限定為固相基質(zhì)。
8.權(quán)利要求7的抗MHC去除裝置，其中所述固相支持物被進(jìn)一步限定為經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化的SEPHAROSE?基質(zhì)。
9.權(quán)利要求1-8任一項的抗MHC去除裝置，其中所述可溶性MHC部分通過HLA部分內(nèi)所含伯胺基與固相支持物中所含酯基之間形成的共價酰胺鍵偶聯(lián)到固相支持物上。
10.權(quán)利要求1-9任一項的抗MHC去除裝置，其中所述固相支持物進(jìn)一步包含間隔臂。
11.權(quán)利要求1-10任一項的抗MHC去除裝置，其被進(jìn)一步限定為人用裝置。
12.權(quán)利要求11的抗MHC·去除裝置，其被進(jìn)一步限定為體外血漿置換人用裝置。
13.含有權(quán)利要求1-12任一項的抗MHC去除裝置的試劑盒。
14.權(quán)利要求13的試劑盒，其進(jìn)一步包括至少一種用于從抗MHC去除裝置中洗脫抗體的試劑。
15.從生物學(xué)樣品去除抗HLA抗體的方法，所述方法包括步驟: (a)使生物學(xué)樣品與權(quán)利要求1-12任一項的抗MHC去除裝置接觸，將抗MHC去除裝置表面上存在的MHC部分特異性抗體從生物學(xué)樣品中去除；和 (b)回收生物學(xué)樣品，其中回收的生物學(xué)樣品中MHC部分特異性抗體顯著減少。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述生物學(xué)樣品選自由血清、組織、血液、血漿、腦脊液、淚液、唾液、淋巴、透析液、器官或組織培養(yǎng)物衍生液、從生理組織中提取的液體及其組合組成的組。
17.權(quán)利要求15或16的方法，其進(jìn)一步包括重復(fù)步驟(a)和(b)的步驟。
18.權(quán)利要求15-17任一項的方法，其進(jìn)一步包括從抗MHC去除裝置中洗脫抗體的步驟。
19.權(quán)利要求15-18任一項的方法，其進(jìn)一步包括將回收的生物學(xué)樣品輸回患者的步驟。
【文檔編號】C12N15/13GK103857691SQ201280032403
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月29日
【發(fā)明者】W·H·希爾德布蘭德, R·布克利, C·麥克默特里, S·凱特 申請人:俄克拉何馬大學(xué)董事會