專利名稱：用于在體內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)的選擇性進(jìn)化的方法
用于在體內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)的 選擇性進(jìn)化的方法描述本發(fā)明涉及用于制備蛋白質(zhì)變體的方法，所述蛋白質(zhì)變體與起始 蛋白質(zhì)相比具有改善的特性，其中所述變體借助于體內(nèi)進(jìn)化方法而獲 得。發(fā)明背景生物技術(shù)在醫(yī)學(xué)、化學(xué)工業(yè)和農(nóng)業(yè)科學(xué)領(lǐng)域中的日益增加的重要 性日益需要對(duì)于其各自使用目的而經(jīng)最佳調(diào)整的蛋白質(zhì)。首先，這些 蛋白質(zhì)主要是從環(huán)境中分離的，大部分在所謂的環(huán)境基因組篩選(Metagenom-Screenings)的范圍內(nèi)。逐漸地，它們隨后通過(guò)各種方 法進(jìn)行改造以使它們適應(yīng)計(jì)劃的"人工"使用條件。因此，例如，需要與它們的天然變體相比更為熱穩(wěn)定、具有其他 底物特異性或者顯示更高活性的酶。例如藥物蛋白質(zhì)應(yīng)當(dāng)具有更長(zhǎng)的 半衰期以能夠使用更少的劑量，或者應(yīng)當(dāng)通過(guò)與靶分子的高親和力和 特異性結(jié)合來(lái)抑制疾病相關(guān)性代謝途徑或感染途徑?，F(xiàn)有技術(shù)部分地通過(guò)合理的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方法來(lái)達(dá)到該調(diào)整。然而，迄今從 蛋白質(zhì)的所希望的功能(表型)推斷出其結(jié)構(gòu)，或者從蛋白質(zhì)的三維 結(jié)構(gòu)推導(dǎo)出相應(yīng)的一級(jí)序列的可能性只是非常有限的。然而為了實(shí)現(xiàn) 蛋白質(zhì)功能的增加，目前使用部分進(jìn)化方法，其用術(shù)語(yǔ)"定向進(jìn)化" 概括(Buskirk等人，2003， "In vivo evolution of an RNA-based transcriptional activator".Chem.Biol.10:533—540; deCr厶cy-Lagard等人，2001， "Long term adaptation of a microbial population to a permanent metabolic constraint: overcoming thymineless death by experimental evolution of Escherichia coli"， BMC Biotechnology 1:10; Fields和Song, 1989， "A novel genetic system to detect protein—protein interactions", Nature 340: 245-246; Long-McGie等人，1999， "Rapid /力w>o evolution of a p-lactamase using phagemids"， Biotechnol. Bioeng. 68: 121-125j Rohde等人，1995， "The mutant distribution of an RNA species replicated by Q beta replicase"， J. Mol. Biol. 249: 754-762)。根據(jù)目前的現(xiàn)有技術(shù)，迄今的定向進(jìn)化方法基本上基于產(chǎn)生待改 善的蛋白質(zhì)的大量變體(后代)，并就改善的衍生物對(duì)其進(jìn)行選擇。在 該情況下，所研究的突變體的數(shù)目在一些情況下可以是非常巨大的， 但通常低于1011。如果考慮只有100個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，那么理論上 存在20，-10"。個(gè)不同的其變體。因此，大小為10n的文庫(kù)只涵蓋了可 能的變體的非常小的一部分。在這樣的文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)理論上最佳的變體 的概率幾乎為零。具有其三個(gè)先決條件(復(fù)制、突變和選擇)的進(jìn)化原理能夠在給 定的系統(tǒng)內(nèi)導(dǎo)致從簡(jiǎn)單至高度適應(yīng)的結(jié)構(gòu)的定向發(fā)展。所謂的"盲眼 鐘表匠(blindenUhrmacher)"的該模型使得能夠產(chǎn)生復(fù)雜性而無(wú)需 設(shè)計(jì)輸入(planerisches Zutun)和無(wú)需必要的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)知識(shí)。為了就與靶分子的最大親和力來(lái)篩選大量的變體，已開發(fā)了許多 方案(例如，酵母雙雜交、細(xì)菌展示、噬菌體展示、核糖體展示、mRNA 展示)。對(duì)于篩選其他特性例如酶活性，大部分需要允許研究只是相 對(duì)少量的變體(<106)的測(cè)定法形式。這些方法的共同點(diǎn)是它們被限制于產(chǎn)生文庫(kù)(-M)以及隨后對(duì) 其進(jìn)行選擇。盡管使用這些方案可能手工地來(lái)進(jìn)行皿(-最后進(jìn)行的 選擇的"勝者"的突變體的下一代)，但是其和前述步驟一樣費(fèi)時(shí)費(fèi) 力。因此，相應(yīng)的方法通常只涉及1至2代。因此，所提及的方案在真正的意義上不是進(jìn)化方法，而更確切地說(shuō)是現(xiàn)存的變體庫(kù)的排他性選擇(ausschliepiiche Selection)。因此，不能利用在許多代上的逐步適應(yīng)的潛能，但這是可能從天 文數(shù)目的可能性中鑒定出最具有活性的變體所必需的先決條件。W0 2004/108926公開了用于進(jìn)化核酸和蛋白質(zhì)的方法。該方法基 于利用RNA病毒特別是噬菌體Phi的高突變率和適應(yīng)能力。將&-內(nèi)酰 胺酶基因插入噬菌體Phi6的基因組中，從而形成重組噬菌體。在避免 裂解的條件下在細(xì)菌細(xì)胞中增殖該重組Phi6噬菌體，其中通過(guò)加入氨 爺青霉素和其他抗生素來(lái)施加選擇壓力。發(fā)現(xiàn)存活的細(xì)菌細(xì)胞包含噬菌體RNA分子，所述噬菌體RNA分子含有與原始導(dǎo)入的P -內(nèi)酰胺酶基 因相比在核酸水平上經(jīng)改變的p-內(nèi)酰胺酶基因。因此，該選擇壓力已 導(dǎo)致P -內(nèi)酰胺酶基因的進(jìn)化。同樣可提及例如調(diào)節(jié)蛋白或RNA或具有 特異性結(jié)合特性的分子的進(jìn)化的進(jìn)一步可能性。然而，沒(méi)有公開任意 蛋白質(zhì)的進(jìn)化的可能性，所述任意蛋白質(zhì)在其功能方面完全獨(dú)立于各 自區(qū)段基因(Sektionsgen)的表達(dá)。此外，W0 2004/108926涉及分 開的選擇/篩選步驟。特別地，關(guān)于具有特定結(jié)合特性的分子的進(jìn)化的 公開內(nèi)容要求在每個(gè)進(jìn)化世代后進(jìn)行篩選，從而使得公開的系統(tǒng)不能 完全自主地進(jìn)行。因而，本發(fā)明的目的是建立一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)提供不依賴于費(fèi)時(shí) 費(fèi)力的篩選方法的體內(nèi)進(jìn)化方法。通過(guò)用于制備蛋白質(zhì)Y的變體Y'的方法實(shí)現(xiàn)了該目的，其中蛋白 質(zhì)Y的變體Y'的特征在于改變的與靶分子X的結(jié)合特性，所述方法包括下列步驟(a)提供細(xì)胞，其包含(al)編碼待改變的蛋白質(zhì)Y的第一核酸， (a2)編碼乾分子X的第二核酸，和(a3)編碼在可調(diào)節(jié)的表達(dá)控制序列控制下的進(jìn)化標(biāo)記的第三 核酸，其中通過(guò)Y和/或Y'與X的結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)所述進(jìn)化標(biāo)記的 表達(dá)，(b) 在一定條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述條件(bl)使得能夠形成蛋白質(zhì)Y的變體Y、和(b2)允許選擇這樣的細(xì)胞，所述細(xì)胞相對(duì)于來(lái)自(a)的細(xì)胞而言具有經(jīng)調(diào)節(jié)的所述進(jìn)化標(biāo)記的表達(dá)，和(c) 鑒定和任選地分離這樣的細(xì)胞，所述細(xì)胞具有經(jīng)調(diào)節(jié)的所述 進(jìn)化標(biāo)記的表達(dá)，和(d) 任選地鑒定和/或表征在來(lái)自(c)的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)Y的變體Y'。本發(fā)明包括一方面允許在實(shí)驗(yàn)室中選擇給定的變體文庫(kù)而同時(shí)又 包含復(fù)制機(jī)制的自動(dòng)系統(tǒng)。在此，所述選擇單獨(dú)地進(jìn)行，和如在天然 進(jìn)化的情況下一樣，通過(guò)經(jīng)更好適應(yīng)的變體的優(yōu)選復(fù)制來(lái)進(jìn)行。此外， 如此構(gòu)建所使用的復(fù)制系統(tǒng)，從而其允許在復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生足夠的突 變率。通過(guò)以實(shí)驗(yàn)中世代的總數(shù)目作為一個(gè)世代中勝者的后代數(shù)目的 指數(shù)來(lái)計(jì)算理論上以這種方式檢測(cè)的初始構(gòu)建體的變體的數(shù)目(例如 每代10個(gè)后代，并具有40代=l(T種可能的變體)。盡管這104°° 種單個(gè)變體中的每一個(gè)變體不可能在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中明確地以物理形式存在，但系統(tǒng)本身在復(fù)雜的可能地域中尋找總是向上導(dǎo)致絕對(duì)最大值的 "路徑"。只有沿著該路徑的變體才在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在；所述地域的 所有點(diǎn)(變體)在理論上都是可能的。因此，本發(fā)明的方法基于這樣的原理，即待進(jìn)化的蛋白質(zhì)Y(為 了本發(fā)明的目的稱為"待改變的蛋白質(zhì)Y，，)由核酸編碼，所述核酸 在體內(nèi)表達(dá)時(shí)導(dǎo)致該蛋白質(zhì)的變體Y'，其中變體的形成在核酸水平上發(fā)生，例如通過(guò)使用具有特定錯(cuò)誤率的聚合酶(例如因?yàn)樗鼈儾痪哂?校正功能)復(fù)制編碼Y的核酸來(lái)進(jìn)行。然后，可就不同的特性，例如以更高的親和力與特定的其他蛋白 質(zhì)結(jié)合的特性，來(lái)對(duì)這些變體r進(jìn)行選擇。如果蛋白質(zhì)Y的變體Y' 的這些更高親和力結(jié)合特性適合用于激活和/或增強(qiáng)進(jìn)化標(biāo)記基因的 表達(dá)，那么在施加選擇壓力后，可能自動(dòng)發(fā)生進(jìn)化，因?yàn)橹挥斜磉_(dá)具 有所希望的經(jīng)改善的特性的蛋白質(zhì)Y變體的細(xì)胞才能存活或增殖或更快速增殖。原則上，任何類型的細(xì)胞均適合這種類型的系統(tǒng)，可以是原核細(xì) 胞或真核細(xì)胞。任選地，細(xì)胞的類型依賴于待挑選的選擇系統(tǒng)，其中 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠挑選出適合于各自的選擇系統(tǒng)的細(xì)胞?？赡苁褂?細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞和脊推動(dòng)物細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì) 胞，優(yōu)選人細(xì)胞。細(xì)胞的選擇依賴于各自的進(jìn)化系統(tǒng)，并且可由本領(lǐng) 域技術(shù)人員自己選擇。如上所述，本發(fā)明的方法包括兩組過(guò)程，即一方面為復(fù)制和突變， 和另一方面為選擇。在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)知道用于這兩組過(guò)程的方法和 系統(tǒng)。為了使待改變的蛋白質(zhì)Y進(jìn)化為具有改善的特性的變體Y'，首先 必需提供在體內(nèi)環(huán)境中即例如在細(xì)胞中形成此類變體的可能性。這可 例如在核酸水平上發(fā)生。例如，可以使用具有一定錯(cuò)誤率的DNA聚合 酶或RNA聚合酶，從而使得能夠在編碼蛋白質(zhì)Y的核酸的復(fù)制和/或轉(zhuǎn) 錄過(guò)程中產(chǎn)生突變的核酸，該突變的核酸然后例如由于點(diǎn)突變、缺失 或添加而在蛋白質(zhì)水平上導(dǎo)致待改變的蛋白質(zhì)Y的變體Y'。依賴于所選擇的本發(fā)明方法的實(shí)施方案，負(fù)責(zé)復(fù)制和突變的聚合或者也可分開地提供它們，例如它們可由其他核酸例如質(zhì)粒編碼。根據(jù)本發(fā)明，編碼待改變的蛋白質(zhì)Y的第一核酸以可以在核酸水 平上通過(guò)細(xì)胞中的聚合酶進(jìn)行復(fù)制的形式存在。在優(yōu)選實(shí)施方案中， 第一核酸以RNA復(fù)制子的形式存在。為了本發(fā)明的目的，"復(fù)制子"特別地是指通過(guò)RM依賴性RNA 聚合酶(即所謂的復(fù)制酶之一)進(jìn)行復(fù)制的核酸。因此，復(fù)制子可以 是RNA或者復(fù)制子可以是在第 一個(gè)轉(zhuǎn)錄循環(huán)后編碼RNA復(fù)制子的DM 。 RNA復(fù)制子優(yōu)選地選自線性RNA序列、來(lái)自基于RNA的生物的基因組、 RNA質(zhì)粒、RNA病毒例如RNA噬菌體和RNA類似物。適合于本發(fā)明的復(fù) 制酶優(yōu)選地選自RNA依賴性RNA聚合酶，例如Q P 、 Phi6、 Phi8、 Phi9、 PhilO、 Phill、 Phil3和Phil4復(fù)制酶等(參見，例如，W0 2004/108926以及下面提到的Makaev等人的出版物)。復(fù)制酶遠(yuǎn)不如DNA聚合酶精確，因?yàn)樗鼈儾痪哂行Ｕδ?。它?的錯(cuò)誤率是每103至104個(gè)合成的堿基有一個(gè)突變。然而除了高錯(cuò)誤率 外，復(fù)制酶特別是QP復(fù)制酶具有高度的底物特異性，從而可就特定 的靶RNA進(jìn)行"校準(zhǔn)"?，F(xiàn)有技術(shù)中已知的復(fù)制酶是例如Q P復(fù)制酶 或Phi復(fù)制酶。Phi復(fù)制酶和它們的進(jìn)化潛能已在現(xiàn)有技術(shù)中進(jìn)行了 描述，特別是Makajev等人，Journal of Virology, 2004，第78巻， No. 4，第2114-2120頁(yè);EMB0 Journal, 2000，第19巻，No. 1，第 124-133頁(yè)；和Virus Research, 2004， 101 ， 45-55;以及國(guó)際專 利申請(qǐng)WO 2004/108926。所述專利申請(qǐng)描述了其中噬菌體Phi6的經(jīng) 修飾的基因組用作復(fù)制子和病毒Phi6復(fù)制酶用作復(fù)制酶的系統(tǒng)。該在 那里描述的系統(tǒng)在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)施。此類系統(tǒng)也適合用于本發(fā)明。第二核酸編碼靶分子。靶分子X優(yōu)選是蛋白質(zhì)，但也可以是通過(guò) 表達(dá)第二核酸而獲得的其他基因產(chǎn)物，例如mRNA或其核酸衍生物。為 了本發(fā)明的目的如此選擇靶分子X，即使得蛋白質(zhì)Y或其變體Y'結(jié)合 該把分子X，并且X和Y或X和Y'的結(jié)合可調(diào)節(jié)進(jìn)化標(biāo)記的表達(dá)?？?以以任何合適的形式，例如以適合于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化細(xì)胞的質(zhì)粒的形式， 提供編碼耙分子X的核酸。因而，該質(zhì)粒優(yōu)選地配備了選擇標(biāo)記。為 了本發(fā)明的目的可完全自由地選擇靶分子X，因此可以選擇用作所尋 求的、待改變的蛋白質(zhì)Y的結(jié)合伙伴的任何靶分子。為了進(jìn)行本發(fā)明的定向進(jìn)化，必須對(duì)所選擇的細(xì)胞系統(tǒng)施加一定 的選擇壓力。因此，第三核酸編碼在可調(diào)節(jié)的表達(dá)控制序列的控制之 下的進(jìn)化標(biāo)記，其中進(jìn)化標(biāo)記的表達(dá)受到蛋白質(zhì)Y或其變體Y'與靶分 子X的結(jié)合的調(diào)節(jié)。優(yōu)選以質(zhì)粒的形式提供第三核酸，但可以以適合 導(dǎo)入細(xì)胞的任何形式提供?？烧{(diào)節(jié)的表達(dá)控制序列優(yōu)選地包含至少一 個(gè)啟動(dòng)子，和特別優(yōu)選地其他序列，例如增強(qiáng)子等，特別是上游激活 序列，例如在允許轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑結(jié)合特別是轉(zhuǎn)錄激活物結(jié)合的DNA上的 激活序列，其中這些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑的結(jié)合對(duì)由可調(diào)節(jié)的表達(dá)控制序列操控的相應(yīng)基因的表達(dá)具有影響。為了本發(fā)明的目的，進(jìn)化標(biāo)記是編碼基因產(chǎn)物的基因，所述基因 產(chǎn)物使得能夠選擇出表達(dá)所述進(jìn)化標(biāo)記的細(xì)胞。在原核細(xì)胞中，原則 上每一種抗生素抗性基因都是合適的。
一些實(shí)例是例如氨爺青霉素抗性基因例如編碼P -內(nèi)酰胺酶的基因。其他此類抗性基因是例如編 碼介導(dǎo)針對(duì)卡那霉素和G418的抗性的氨基糖苷-3，-磷酸轉(zhuǎn)移酶的基 因(/7pfl1)，以及編碼氟霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因(cW)。對(duì)于原核系 統(tǒng)，caf優(yōu)選作為進(jìn)化標(biāo)記。在酵母系統(tǒng)中，下列基因可用作進(jìn)化標(biāo)記，例如力/W、 "W、 f/raJ 或/ew么在此，在原核和酵母系統(tǒng)中，合適的是例如選擇基因A/sJ， 其介導(dǎo)組氨酸原養(yǎng)型，并且可通過(guò)培養(yǎng)基中的3-氨基三唑的濃度來(lái)調(diào) 節(jié)其劑量效應(yīng)。還在其他情況下，例如優(yōu)選在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，類似 的抗性基因可用作進(jìn)化標(biāo)記。進(jìn)化標(biāo)記的表達(dá)允許例如以如下的方式進(jìn)行選擇，即只選擇出比 不表達(dá)或較差地表達(dá)進(jìn)化標(biāo)記的細(xì)胞更快地增殖的細(xì)胞(如果進(jìn)化標(biāo) 記是抗性基因)，或者較不好地表達(dá)或根本不表達(dá)表達(dá)標(biāo)記(如果進(jìn) 化標(biāo)記是對(duì)細(xì)胞不利的基因)的細(xì)胞。因此，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率與選擇基因的表達(dá)直接相關(guān)。還可以使用常規(guī)的選擇標(biāo)記作為進(jìn)化標(biāo)記。這些進(jìn)化標(biāo)記可以例 如編碼抗生素抗性基因等。選擇系統(tǒng)的其他修飾在于，使用編碼在細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì) 的基因作為進(jìn)化標(biāo)記。因而，由于所表達(dá)的蛋白質(zhì)與偶聯(lián)至固體基質(zhì) 的相應(yīng)結(jié)合伙伴的結(jié)合，表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞可能結(jié)合至該固體基質(zhì)。 從而，這使得能夠從不能結(jié)合至固體基質(zhì)的其他細(xì)胞中選擇出表達(dá)進(jìn) 4匕標(biāo)記的細(xì)胞。進(jìn)化標(biāo)記在可調(diào)節(jié)的表達(dá)控制序列的控制之下。對(duì)此合適的是所 有類型的可反式和/或順式激活的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和類似的激活物序 列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)控制序列是這樣的序列，其包含需要蛋 白質(zhì)結(jié)合以進(jìn)行激活的序列。 一個(gè)實(shí)例是上游激活序列(UAS)。優(yōu)選地，對(duì)于進(jìn)化標(biāo)記的這樣的調(diào)節(jié)，采用雙雜交系統(tǒng)的原理。該系統(tǒng)在現(xiàn)有技術(shù)中是熟知的并且用于檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。 雙雜交系統(tǒng)基于由兩種融合蛋白組成的復(fù)合物，其中一種融合蛋白具有融合至或偶聯(lián)至蛋白質(zhì)X的、對(duì)于在表達(dá)控制序列中存在的激活序 列(UAS)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。第二蛋白質(zhì)復(fù)合物包含待研究的蛋白質(zhì)Y 和與負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的聚合酶相互作用的激活物結(jié)構(gòu)域。只有當(dāng)在X和Y之 間發(fā)生結(jié)合時(shí)，表達(dá)控制序列才能被激活，并且受其控制的基因即選 擇基因才被表達(dá)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)清楚的是，兩個(gè)結(jié)合伙伴X和Y或Y'的 該系統(tǒng)可以非常適合用于本發(fā)明的方法。然而酵母雙雜交系統(tǒng)的巨大 不利方面是，其只適合于檢測(cè)兩種已知蛋白質(zhì)之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相 互作用或用于篩選已經(jīng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)變體。現(xiàn)有技術(shù)中已知的雙雜交 系統(tǒng)不具有蛋白質(zhì)進(jìn)化步驟。與此相反，本發(fā)明的方法允許在所提供的系統(tǒng)中，即在細(xì)胞內(nèi)， 自主地產(chǎn)生蛋白質(zhì)Y的變體Y'。因此，可以允許待改變的蛋白質(zhì)Y按 照特定方向自我發(fā)展，該方向可通過(guò)變體Y'與靶分子X的結(jié)合能力進(jìn) 行操控。如果在系統(tǒng)中產(chǎn)生Y的變體，其具有對(duì)于X的更高的親和力或與 Y相反完全首次具有對(duì)于X的親和力，那么選擇基因的表達(dá)允許這樣 的細(xì)胞存活或更快地增殖從而允許選擇其，所述細(xì)胞具有待改變的蛋 白質(zhì)的、有著改善的特性的變體Y'。在已知的酵母雙雜交系統(tǒng)中，使用蛋白質(zhì)Gal4來(lái)激活表達(dá)控制序 列，所述蛋白質(zhì)Gal4具有對(duì)于上游激活序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及與聚合 酶相互作用的激活結(jié)構(gòu)域?？梢詫al4蛋白的這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分開，并 將每個(gè)結(jié)構(gòu)域各自與其他分子一起以融合蛋白的形式提供或者以其他 類型和方式進(jìn)行偶聯(lián)，其中那么其他分子例如X和Y或Y'之間的相互 作用使得能夠?qū)蓚€(gè)Ga14結(jié)構(gòu)域相互再次在空間上接近，從而使得能 夠調(diào)節(jié)表達(dá)控制序列。第二和第三核酸可作為分開的核酸例如以質(zhì)粒的形式存在，或者它們也可存在于同一個(gè)質(zhì)粒上。第一核酸，如上所述，應(yīng)當(dāng)是可復(fù)制的核酸，優(yōu)選可由RNA復(fù)制酶復(fù)制的RNA復(fù)制子。然而，也可以以質(zhì) 粒形式或者可轉(zhuǎn)染或可轉(zhuǎn)化的核酸(其中該核酸那么應(yīng)當(dāng)編碼相應(yīng)的 可復(fù)制的第一核酸)的其他形式提供第一核酸。為了本發(fā)明的目的，可以使用已知的酵母雙雜交系統(tǒng)或相應(yīng)的系 統(tǒng)，其中相互作用即蛋白質(zhì)Y和/或蛋白質(zhì)Y的變體Y'與靶分子X的 結(jié)合使得能夠調(diào)節(jié)可調(diào)節(jié)的表達(dá)控制序列，從而調(diào)節(jié)進(jìn)化標(biāo)記的表達(dá)。因此，優(yōu)選地使用兩種表達(dá)調(diào)節(jié)劑，其中所述兩種表達(dá)調(diào)節(jié)劑通 過(guò)X和Y或Y'的相互之間的相互作用(直接或間接的)是調(diào)節(jié)進(jìn)化標(biāo) 記的表達(dá)控制序列所必需的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將由第一核酸特別是RNA復(fù)制子編碼的待改 變的蛋白質(zhì)Y偶聯(lián)至第一或第二表達(dá)調(diào)節(jié)劑。在此，涉及Y和第一表 達(dá)調(diào)節(jié)劑之間的融合蛋白或Y和第二表達(dá)調(diào)節(jié)劑之間的融合蛋白，或 者以其他類型和方式例如通過(guò)生物素-鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合而將蛋 白質(zhì)Y偶聯(lián)至兩種表達(dá)調(diào)節(jié)劑中的一種。靶分子X可以是蛋白質(zhì)或其他分子例如核酸。重要的是，將X偶 聯(lián)至表達(dá)調(diào)節(jié)劑，或者與后者形成融合蛋白，或者其本身是相應(yīng)的表 達(dá)調(diào)節(jié)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如第一 (或備選地第二)表達(dá)調(diào)節(jié)劑是結(jié) 合上游激活序列(UAS)的分子。第二 (或備選地第一)表達(dá)調(diào)節(jié)劑通 過(guò)結(jié)合相應(yīng)的聚合酶來(lái)調(diào)節(jié)表達(dá)，其中只有當(dāng)?shù)谝?(或備選地第二) 表達(dá)激活物與UAS的相互作用和第二 (或備選地第一)表達(dá)激活物與 聚合酶的相互作用同時(shí)存在時(shí)表達(dá)的調(diào)節(jié)才發(fā)生。在各情況下，將分 子X和Y或Y'偶聯(lián)或融合至該表達(dá)調(diào)節(jié)劑，其中X和Y之間或X和Y' 之間的相互作用因而允許兩種表達(dá)調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)表達(dá)。優(yōu)選地，在本發(fā)明中，激活可調(diào)節(jié)的表達(dá)控制序列，由此表達(dá)進(jìn) 化標(biāo)記，并因而使這些細(xì)胞獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。然而，也可以使用這樣的 系統(tǒng)，其中所述調(diào)節(jié)是抑制。在使用雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)選實(shí)施方案中，各自以具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu) 域的融合蛋白(優(yōu)選作為X/結(jié)合結(jié)構(gòu)域)和具有激活物結(jié)構(gòu)域的融合蛋白(優(yōu)選Y/激活物結(jié)構(gòu)域)的形式提供蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y。然而， 也可以不用融合蛋白，而是將所希望的單元通過(guò)其他分子例如通過(guò)連 接體或鏈霉抗生物素蛋白/生物素結(jié)合等偶聯(lián)在一起。不用常規(guī)的雙雜交系統(tǒng)，也可以使用三雜交系統(tǒng)或者可以使用具 有多個(gè)亞基的蛋白質(zhì)復(fù)合物。此外，通過(guò)單雜交系統(tǒng)可以使結(jié)合給定的DNA序列的蛋白質(zhì)Y進(jìn) 行進(jìn)化。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中的實(shí)驗(yàn)方法首先通過(guò)將第 一核酸轉(zhuǎn)化入 已包含兩種其他核酸的酵母或大腸桿菌(A co7/)林系中來(lái)進(jìn)行。然 后在液體培養(yǎng)中在進(jìn)化標(biāo)記選擇條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化混合物，其中持續(xù) 監(jiān)控培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速率。在培養(yǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期之前，將其等分試樣轉(zhuǎn)接 入新鮮的培養(yǎng)基中，并觀察進(jìn)一步的生長(zhǎng)。在此，轉(zhuǎn)接也可自主地發(fā) 生，或者通過(guò)連續(xù)地加入培養(yǎng)基和取出培養(yǎng)物來(lái)進(jìn)行。當(dāng)盡管選擇壓力升高但沒(méi)有觀察到生長(zhǎng)速率的進(jìn)一步增加時(shí)，就 達(dá)到了進(jìn)化過(guò)程的終點(diǎn)。單個(gè)菌落的復(fù)制子序列的分離和測(cè)序鑒定了 潛在的候選者，隨后就其基因產(chǎn)物的親和力單獨(dú)地研究所述候選者。 同樣可以作為基因庫(kù)來(lái)處理在終點(diǎn)時(shí)存在于系統(tǒng)內(nèi)的所有變體的全 體，并通過(guò)選擇測(cè)定法(例如噬菌體展示)來(lái)鑒定其中最好的變體。圖l顯示了體內(nèi)自主進(jìn)化的系統(tǒng)的優(yōu)選實(shí)施方案的示意性圖解描 述，其將在下面詳細(xì)描述。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是細(xì)胞，其包含(i) 編碼待改變的蛋白質(zhì)Y的第一核酸，(ii) 編碼靶分子X的第二核酸，其中Y能夠結(jié)合靶分子X，(iii) 編碼在可調(diào)節(jié)的表達(dá)控制序列的控制下的進(jìn)化標(biāo)記的第三 核酸，和其中所述細(xì)胞能夠允許形成蛋白質(zhì)Y的變體Y'，其中蛋白質(zhì)Y的變體Y'的特征在于改變的與靶分子X的結(jié)合特性?？梢杂孟鄳?yīng)的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，其中可以使用常規(guī)的和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的用于轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的方法。本發(fā)明的更進(jìn)一步的目的為用于實(shí)施本發(fā)明方法即用于形成任意蛋白質(zhì)Y的變體Y'的試劑盒，其中蛋白質(zhì)Y的變體Y'的特征在于改變的與靶分子x的結(jié)合特性，所述試劑盒包括(i) 任選地，細(xì)胞，(ii) 編碼待改變的蛋白質(zhì)Y的第一核酸，(iii) 編碼靶分子X的第二核酸，其中Y能夠結(jié)合靶分子X，(iv) 編碼在可調(diào)節(jié)的表達(dá)控制序列的控制下的進(jìn)化標(biāo)記的笫三 核酸，和其中所述細(xì)胞能夠允許形成蛋白質(zhì)Y的變體Y'，其中蛋白質(zhì)Y的 變體Y'的特征在于改變的與靶分子X的結(jié)合特性，以及(v) 任選地，合適的選擇培養(yǎng)基。此處公開的方法具有這樣的優(yōu)點(diǎn)，即其在很大程度上避免了費(fèi)時(shí) 費(fèi)力的篩選方法，和可以進(jìn)化任意蛋白質(zhì)。特別地，可以通過(guò)定向進(jìn)化與基于酵母雙雜交系統(tǒng)的系統(tǒng)的組合 而自發(fā)地獲得具有改善的與靶分子X的結(jié)合特性的蛋白質(zhì)的進(jìn)化。在 此，不再需要在每個(gè)世代后對(duì)形成的變體進(jìn)行分離和表征；相反地， 系統(tǒng)可自主地經(jīng)過(guò)多個(gè)世代，直至自發(fā)形成蛋白質(zhì)Y的變體r,所述 變體Y'具有最佳的與相應(yīng)地選擇出的靶分子X的結(jié)合特性。為了使得也能夠通過(guò)由RNA復(fù)制子所支持的體內(nèi)進(jìn)化來(lái)改善細(xì)胞 外蛋白質(zhì)(例如免疫球蛋白質(zhì)、Anticalin等)、受體等，可以如此 在細(xì)胞中表達(dá)靶分子X，從而將其外運(yùn)至細(xì)胞表面或外運(yùn)入周質(zhì)中， 并且保持錨定在該區(qū)室中。同樣地，將由復(fù)制子編碼的相互作用變體 錨定在細(xì)胞表面上，和任選地可將其通過(guò)易曲的連接體結(jié)構(gòu)域與靶分 子X相互作用。增加的相互作用反過(guò)來(lái)導(dǎo)致(可能通過(guò)被該相互作用 排斥的第三分子)相關(guān)細(xì)胞的選擇優(yōu)勢(shì)?？衫缤ㄟ^(guò)錨定在膜上的結(jié) 構(gòu)域的構(gòu)象改變來(lái)產(chǎn)生信號(hào)，隨后為進(jìn)入細(xì)胞核中的信號(hào)級(jí)聯(lián)(例如 胰島素對(duì)胰島素受體的親和力的優(yōu)化)。還考慮了將必需分子運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)部或?qū)撛诘募?xì)胞毒素運(yùn)出細(xì)胞的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控。還考慮了以二聚體、三聚體或多聚體蛋白質(zhì)的形式表達(dá)靶分子x， 由此，由此隨著分子之間的親和力增加，其進(jìn)行交聯(lián)并在表面上形成 簇。這可對(duì)細(xì)胞與表面的粘附具有影響，由此反過(guò)來(lái)可能選擇出強(qiáng)粘 附性細(xì)胞，而附著力較弱的細(xì)胞隨著嚴(yán)緊度增加而被去除。同樣地，通過(guò)粘附來(lái)進(jìn)行由復(fù)制子編碼的相互作用變體Y'的選 擇，所述變體Y'在細(xì)胞中以下列方式在細(xì)胞表面上表達(dá)。在此，將靶 分子X (蛋白質(zhì)、肽、核酸、其他聚合物、小的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子(例 如，酶催化反應(yīng)的中間體))結(jié)合至固體或液體基質(zhì)(或微團(tuán))，并 使之與細(xì)胞懸浮液接觸。表達(dá)更高親和力的變體的細(xì)胞具有更大的對(duì) 固體基質(zhì)的親和力。隨著嚴(yán)緊度(例如鹽、pH、結(jié)合竟?fàn)巹┑?增加， 弱粘附性細(xì)胞被洗去，將剩下的細(xì)胞暴露于新鮮的培養(yǎng)基中，并提供 新的基質(zhì)，而同時(shí)除去部分老的基質(zhì)。該過(guò)程可容易地進(jìn)行自動(dòng)化。表達(dá)非常好的結(jié)合劑的細(xì)胞將不再?gòu)谋砻嫔辖怆x。然而，任選地 它們?nèi)匀荒軌蜻M(jìn)行細(xì)胞分裂。在占據(jù)了鄰近環(huán)境的情況下，子代細(xì)胞 具有到達(dá)有著新鮮基質(zhì)的遠(yuǎn)處區(qū)域的機(jī)會(huì)。在此，可以逐步(其中"步 驟"定義為從新培養(yǎng)基的接種至使用一部分基質(zhì)的下一次接種)改變 基質(zhì)的類型，例如磁珠和聚乙烯表面(Eliza板)。這樣，總是只是 "新占據(jù)的基質(zhì)"從一個(gè)步驟轉(zhuǎn)移至下一步驟。在各情況(細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外)下，可以不僅增加對(duì)蛋白質(zhì)的親和 力而且還增加對(duì)小的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子的親和力。為此可以將分子例如 共價(jià)地偶聯(lián)至生物素。將該分子導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)中或?qū)爰?xì)胞外介質(zhì)(其 可以是透膜的)中。在該情況下表達(dá)鏈霉抗生物素蛋白(在雙雜交的 情況下作為融合蛋白)而不是靶分子X。靶分子/生物素嵌合體結(jié)合鏈 霉抗生物素蛋白，從而提供靶分子以用作親和靶。附圖描述

圖1:用于體內(nèi)自主進(jìn)化的系統(tǒng)的示意性圖解描述質(zhì)粒1編碼在上游激活序列(UAS )控制下的進(jìn)化標(biāo)記，其介導(dǎo)更快速的生長(zhǎng)。由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和組分X組成的融合蛋白(結(jié)合/X) 由質(zhì)粒2編碼，并且結(jié)合UAS。依賴于組分X和蛋白質(zhì)Y或Y'之間的 相互作用的強(qiáng)度，所述融合的激活結(jié)構(gòu)域(激活物)能夠募集細(xì)胞自 已的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而發(fā)生進(jìn)化標(biāo)記的依賴性表達(dá)。融合蛋白Y/激活 物由復(fù)制子編碼，所述復(fù)制子自主和易錯(cuò)地通過(guò)RNA依賴性RNA聚合 酶(Phi)進(jìn)行復(fù)制。實(shí)施例從合成的基因開始，產(chǎn)生包含下列元件的PCR產(chǎn)物T7啟動(dòng)子+ 與30個(gè)隨機(jī)氨基酸的肽相融合的酵母蛋白質(zhì)Gal4 (Fields和 Sternglanz，1994 )的激活結(jié)構(gòu)域的閱讀框(- Act/30X)。通過(guò)所述 30個(gè)C-末端氨基酸的隨機(jī)性，產(chǎn)生包含大約109種不同變體的基因庫(kù)。 在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，在IOO pl反應(yīng)體系中用T7聚合酶轉(zhuǎn)錄出5 pmol的 PCR產(chǎn)物(- Act/30X復(fù)制子)。將用于RNA依賴性RM聚合酶QP (Acc. No. AAM33128 )的酵母 表達(dá)盒克隆入質(zhì)粒pAS (Fields和Sternglanz, 1994 )中(=pAS-Q P )。該質(zhì)粒允許就色氨酸原養(yǎng)型在酵母中進(jìn)行選擇。將HIV-整合酶(Acc. No. AAC61700. 1 )的閱讀框與Gal-DNA結(jié) 合結(jié)構(gòu)域相融合地克隆入質(zhì)粒pAS-Q P中(=pAS-Q P -Int)，轉(zhuǎn)化入 酵母林系Y190中，并就色氨酸原養(yǎng)型進(jìn)行選擇。用10 ng Act/30X復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)化用pAS-Q P-Int轉(zhuǎn)化的酵母 培養(yǎng)物(轉(zhuǎn)化率為大約500, 000 )，并將其直接在50ml加入了 12 mM 3-氨基三唑(3-AT )的撤除色氨酸/組氨酸的液體培養(yǎng)基 (Tryptophan/Histidin-dropout Fliissigkultur )中于30"C在搖動(dòng)下溫育。在達(dá)到3. 0的0D ( 600 nm)后，用200 ji 1培養(yǎng)物接種50 ml新 鮮培養(yǎng)基，并再次搖動(dòng)直至OD達(dá)到3. O(這相應(yīng)于8個(gè)世代的加倍)。 達(dá)到該OD的時(shí)間除以8相應(yīng)于酵母群體的世代時(shí)間。如果世代時(shí)間接近60分鐘，首先將3-AT的濃度增加至25mM(在第5次轉(zhuǎn)接后)，然后增加至50 mM (在第8次轉(zhuǎn)接后)。在第10次 轉(zhuǎn)接后達(dá)到85分鐘的世代時(shí)間，該時(shí)間在進(jìn)一步轉(zhuǎn)接后也不再下降。將20 pl第10次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的酵母培養(yǎng)物在撤除色氨酸/組氨酸的 平板上進(jìn)行涂板，并在30t:下溫育3天。將最大的菌落轉(zhuǎn)接入30 ml 撤除色氨酸/組氨酸的培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)至OD為3.0,然后離心。用玻 璃珠將細(xì)胞沉淀在STET緩沖液、苯酚和氯仿中粉碎瓦解，用2x氯仿 振搖提取水性上清液，并用乙醇沉淀所含有的核酸。將干燥的沉淀(DNA 和RNA)重懸浮于lOOjn 1 10 mM Tris中。將其中的5 p 1用逆轉(zhuǎn)錄 酶和對(duì)于該復(fù)制子特異的寡核苷酸轉(zhuǎn)錄成DNA，并通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。 將PCR產(chǎn)物亞克隆入合適的載體中，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中。384個(gè)大腸桿菌克隆的序列分析顯示了編碼經(jīng)進(jìn)化的Act/30X變 體的各種不同序列的統(tǒng)計(jì)學(xué)分布，所述變體具有增加的對(duì)于HIV整合 酶的親和力。更詳細(xì)的研究顯示，在可變肽(30X)內(nèi)存在重復(fù)的氨基 酸基元，其是造成增加的親和力的原因。
權(quán)利要求
1.用于制備蛋白質(zhì)Y的變體Y′的方法，其中蛋白質(zhì)Y的變體Y′的特征在于改變的與靶分子X的結(jié)合特性，所述方法包括下列步驟(a)提供細(xì)胞，其包含(a1)編碼待改變的蛋白質(zhì)Y的第一核酸，(a2)編碼靶分子X的第二核酸，和(a3)編碼在可調(diào)節(jié)的表達(dá)控制序列控制下的進(jìn)化標(biāo)記的第三核酸，其中通過(guò)Y和/或Y′與X的結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)所述進(jìn)化標(biāo)記的表達(dá)，(b)在一定條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述條件(b1)使得能夠形成蛋白質(zhì)Y的變體Y′，和(b2)允許選擇這樣的細(xì)胞，所述細(xì)胞相對(duì)于來(lái)自(a)的細(xì)胞而言具有經(jīng)調(diào)節(jié)的所述進(jìn)化標(biāo)記的表達(dá)，和(c)鑒定和任選地分離這樣的細(xì)胞，所述細(xì)胞具有經(jīng)調(diào)節(jié)的所述進(jìn)化標(biāo)記的表達(dá)，和(d)任選地鑒定和/或表征在來(lái)自(c)的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)Y的變體Y′。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述細(xì)胞選自大腸桿菌、酵母細(xì)胞、 植物細(xì)胞和脊推動(dòng)物細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
4. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一核酸以相對(duì)于天 然變異率而言提高的變異率進(jìn)行復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄。
5. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一核酸以RNA復(fù)制 子的形式存在，并且所述來(lái)自(a)的細(xì)胞額外地還包含能夠復(fù)制所述 RNA復(fù)制子從而形成變體的復(fù)制酶。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中所述RNA復(fù)制子選自線性RM序列、 來(lái)自基于RNA的生物的基因組、RNA質(zhì)粒、RM噬菌體和RNA類似物。
7. 權(quán)利要求5或6的方法，其中所述復(fù)制酶選自RNA依賴性RNA聚合酶，例如Q P 、 Phi6、 Phi8、 Phi9、 PhilO、 Phill、 Phil3和Phil4 復(fù)制酶。
8. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述進(jìn)化標(biāo)記選自其表達(dá) 使得細(xì)胞能夠更快速增殖的基因。
9. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述進(jìn)化標(biāo)記選自編碼表 面固定蛋白的基因，所述表面固定蛋白使得細(xì)胞能夠結(jié)合至固體基質(zhì)。
10. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。
11. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中將蛋白質(zhì)Y和其變體Y' 各自偶聯(lián)至第一表達(dá)調(diào)節(jié)劑，和將X偶聯(lián)至第二表達(dá)調(diào)節(jié)劑，其中所 述第一表達(dá)調(diào)節(jié)劑和所述第二表達(dá)調(diào)節(jié)劑與編碼進(jìn)化標(biāo)記的核酸的相 互作用是調(diào)節(jié)所述進(jìn)化標(biāo)記的表達(dá)所必需的。
12. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中X是蛋白質(zhì)。
13. 權(quán)利要求11或12的方法，其中所述第一核酸編碼由Y和第 一表達(dá)調(diào)節(jié)劑組成的融合蛋白，和所述第二核酸編碼由X和第二表達(dá) 調(diào)節(jié)劑組成的融合蛋白，或者其中所述第一核酸編碼由Y和第二表達(dá) 調(diào)節(jié)劑組成的融合蛋白，和所述第二核酸編碼由X和第一表達(dá)調(diào)節(jié)劑 組成的融合蛋白。
14. 權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一表達(dá)調(diào)節(jié)劑是聚合酶的調(diào)節(jié)劑。
15. 權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二表達(dá)調(diào)節(jié)劑是聚合酶的調(diào)節(jié)劑。
16. 權(quán)利要求14的方法，其中在第三核酸上的所述可調(diào)節(jié)的表達(dá) 控制序列包括上游激活序列(UAS)，并且所述第二表達(dá)調(diào)節(jié)劑是能夠 特異性地結(jié)合該UAS的結(jié)合蛋白。
17. 權(quán)利要求15的方法，其中在第三核酸上的所述可調(diào)節(jié)的表達(dá) 控制序列包括上游激活序列(UAS)，并且所述笫一表達(dá)調(diào)節(jié)劑是能夠 特異性地結(jié)合該UAS的結(jié)合蛋白。
18. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述可調(diào)節(jié)的表達(dá)控制 序列包括允許蛋白質(zhì)Gal4結(jié)合的上游激活序列(UAS)。
19. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中Y和/或Y'與X的結(jié)合 使得能夠激活在第三核酸上的可調(diào)節(jié)的表達(dá)控制序列。
20. 細(xì)胞，其包含(0編碼待改變的蛋白質(zhì)Y的第一核酸，(ii) 編碼靶分子X的第二核酸，其中Y能夠結(jié)合靶分子X，(iii) 編碼在可調(diào)節(jié)的表達(dá)控制序列的控制下的進(jìn)化標(biāo)記的笫三 核酸，和其中所述細(xì)胞能夠允許形成蛋白質(zhì)Y的變體Y'，其中蛋白質(zhì)Y的變體Y'的特征在于改變的與靶分子X的結(jié)合特性。
21. 權(quán)利要求20的細(xì)胞，其中所述第一核酸以RNA復(fù)制子的形式 存在，并且所述細(xì)胞額外地還包含能夠復(fù)制所述RNA復(fù)制子從而形成 變體的復(fù)制酶。
22. 權(quán)利要求20或21的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核 細(xì)胞。
23. 用于制備蛋白質(zhì)Y的變體Y'的試劑盒，其中蛋白質(zhì)Y的變體 Y'的特征在于改變的與乾分子X的結(jié)合特性，所述試劑盒包括(i) 任選地，細(xì)胞，(ii) 編碼待改變的蛋白質(zhì)Y的第一核酸，(iii) 編碼乾分子X的第二核酸，其中Y能夠結(jié)合靶分子X，(iv) 編碼在可調(diào)節(jié)的表達(dá)控制序列的控制下的進(jìn)化標(biāo)記的第三 核酸，和其中所述細(xì)胞能夠允許形成蛋白質(zhì)Y的變體Y'，其中蛋白質(zhì)Y的 變體W的特征在于改變的與靶分子X的結(jié)合特性，以及(v) 任選地，合適的選擇培養(yǎng)基。
24. 用于制備蛋白質(zhì)Y的變體Y'的試劑盒，其包括 (i)前述權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)之中定義的細(xì)胞，(i i)選擇培養(yǎng)基，通過(guò)使用所述選擇培養(yǎng)基能夠基于選擇基因的 經(jīng)調(diào)節(jié)的表達(dá)來(lái)對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行選擇。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于制備蛋白質(zhì)變體的方法，所述蛋白質(zhì)變體與起始蛋白質(zhì)相比具有改善的特性，其中所述變體借助于體內(nèi)進(jìn)化方法而獲得。
文檔編號(hào)C40B10/00GK101238212SQ200680028628
公開日2008年8月6日 申請(qǐng)日期2006年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月8日
發(fā)明者M·里斯 申請(qǐng)人:基因技術(shù)股份公司