泡沫控制方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及降低泡沫形成以及使生物表面活性劑在微生物中的表達(dá)最大化的方法。所述方法涵蓋從微生物沉淀生物表面活性劑，這導(dǎo)致泡沫形成減少。
【專利說明】泡沬控制方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)及引用并入本文
[0002]本申請(qǐng)要求2011年3月29日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/469，067和2012年3月28日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)13/433，036的優(yōu)先權(quán)。參考在2009年6月9日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)系列號(hào)PCT/US2009/046783，其在2009年12月17日公開為PCT公開第W02009/152176號(hào)，并參考在2010年8月10日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)系列號(hào)PCT/US2010/044964，其在 2011 年 2 月 17 日公開為 PCT 公開第 W02011/019686 號(hào)。
[0003] 前述申請(qǐng)案，及在其中或者在其審查期間所引證的所有文件(“申請(qǐng)案引證文件”)及在“申請(qǐng)案引證文件”中所引證或者參考的所有文件，及本文中所引證或者參考的所有文件(“本文中引證文件”)及在“本文中引證文件”中所引證或者參考的所有文件，連同用于任何本文中所提及的產(chǎn)品或者在任何以引用方式并入的文件中的任何生產(chǎn)商指示、說明、產(chǎn)品規(guī)格和產(chǎn)品介紹，都以引用方式并入本文，并可在本發(fā)明的實(shí)施中采用。更具體而言，所有參考文件被以引用方式并入至如同每一單獨(dú)文件被具體且單獨(dú)地指明以引用方式并入的程度。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明涉及一種控制生物表面活性劑發(fā)泡的方法，該生物表面活性劑在以下情況下發(fā)泡:在發(fā)酵培養(yǎng)基中通過宿主細(xì)胞生產(chǎn)該生物表面活性劑期間，當(dāng)宿主細(xì)胞胞外分泌該生物表面活性劑并且該生物表面活性劑可溶于發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)。該方法包括以下步驟或者基本上由以下步驟組成:在通過宿主細(xì)胞生產(chǎn)該生物表面活性劑的同時(shí)，使該生物表面活性劑不溶解化。以此方式，發(fā)泡受到控制，因?yàn)樵摬蝗芙饣纳锉砻婊钚詣┎粫?huì)發(fā)泡。通過這個(gè)方法，泡沫減少指數(shù)大于1，和/或泡沫減少指數(shù)大于2，和/或泡沫減少指數(shù)大于3。同樣，另外或者作為另一種選擇，通過這個(gè)方法，發(fā)酵培養(yǎng)基中的可溶性生物表面活性劑的濃度至多約lg/kg。另外或者作為另一種選擇；和/或至少25%的所生產(chǎn)的生物表面活性劑被不溶解化。另外或者作為另一種選擇，該方法在不添加消泡劑的情況下進(jìn)行；或者使得能夠減少在不使該生物表面活性劑不溶解化的情況下所要使用的消泡劑的量，如在不使該生物表面活性劑不溶解化的情況下所要使用的消泡劑的量減少25%或者30%或者40%50%或者60%或者65%或者70%或者75%或者80%或者85%或者90%或者95%或者更多。并且另外或者作為另一種選擇，雖然本發(fā)明可以以分批方式或者補(bǔ)料分批方式進(jìn)行，但本發(fā)明有利地涉及連續(xù)的方法。本發(fā)明還有利地涉及其中該生物表面活性劑為疏水蛋白如疏水蛋白II的方法。本發(fā)明還有利地涉及其中該生物表面活性劑為糖脂如鼠李糖脂和槐糖脂或者脂肽如表面活性肽的方法。甚至另外地，本發(fā)明涉及用于進(jìn)行本發(fā)明的方法特別是本發(fā)明的連續(xù)方法的裝置。還另外地，本發(fā)明涉及其中通過添加沉淀劑如鹽、醇、水混溶性有機(jī)溶劑、水溶性聚合物或者陽(yáng)離子聚合物，或者通過改變PH，或者通過改變溫度來引起該生物表面活性劑的不溶解化的本發(fā)明方法。
【背景技術(shù)】[0005]表面活性劑是廣泛用于各種工業(yè)的化學(xué)品，并且主要是化學(xué)合成的。通過多種微生物生產(chǎn)的表面活性劑因其獨(dú)特性質(zhì)而正受到關(guān)注，如與合成的對(duì)等物相比，生物可降解性更高且毒性譜更低。但是，這種生物法生產(chǎn)的表面活性劑的可供量(available)和成本有限，這部分地因?yàn)槿狈τ行У纳a(chǎn)方法。
[0006]一種用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)或者酶的有效系統(tǒng)是，進(jìn)行好氧深層發(fā)酵，然后進(jìn)行水基回收步驟以分離目的產(chǎn)物。但是，泡沫控制對(duì)于實(shí)現(xiàn)效率是關(guān)鍵的。
[0007]在化學(xué)工業(yè)中，發(fā)泡是一個(gè)嚴(yán)重問題，尤其是對(duì)于生化工藝而言。在多種物質(zhì)如表面活性劑和蛋白質(zhì)的制造中，特別是在靠近氣液界面處涉及明顯的剪切力的工藝中，如涉及通氣、泵送或者攪拌的那些工藝中，常常有泡沫產(chǎn)生，這是一種不想要的結(jié)果。好氧深層發(fā)酵依靠足夠的通氣來供應(yīng)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)生目的產(chǎn)物所需要的氧。向發(fā)酵液引入空氣以提供微生物所需要的氧會(huì)產(chǎn)生泡沫。發(fā)酵過程中泡沫的存在通常對(duì)發(fā)酵的性能有負(fù)面影響，包括發(fā)酵罐工作體積或者生產(chǎn)率降低，存在與“泡沫溢出”相關(guān)的污染風(fēng)險(xiǎn)，所述“泡沫溢出”例如是液態(tài)發(fā)酵液上方產(chǎn)生泡沫柱或者泡沫頭達(dá)到足夠的高度，以至于它通過通風(fēng)孔或者管道排出發(fā)酵容器。
[0008]常常使用添加劑如消泡劑或者除泡劑來減少發(fā)酵期間的泡沫形成。消泡劑按需在回收步驟期間進(jìn)行添加以控制泡沫。一些回收工藝因消泡劑的存在而受到負(fù)面影響，尤其是基于膜的分離工藝。取決于蛋白質(zhì)或者酶的最終應(yīng)用，在其生產(chǎn)過程中采用的消泡劑可能需要或者不需要移除。
[0009]但是，化學(xué)類的泡沫控制方法由于其可能引起的問題(即污染、傳質(zhì)下降)，并不總是合乎需要的，尤其是在產(chǎn)品質(zhì)量非常重要的食品、飼料和藥品行業(yè)中。因?yàn)橄輨┩ǔＪ鞘杷?，它們難以進(jìn)行滅菌，這在食品和藥品行業(yè)中會(huì)造成問題。此外，這些行業(yè)中的監(jiān)管要求限制了可容許用于消泡劑和除泡劑的化學(xué)品。
[0010]可惜的是，用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)或者酶的常規(guī)深層好氧發(fā)酵和回收工藝不能有效地應(yīng)用于該生物表面活性劑(即生物法生產(chǎn)的表面活性劑分子)的生產(chǎn)。在相同的培養(yǎng)條件下，這些分子的表面活性在發(fā)酵液中產(chǎn)生的泡沫將比不表達(dá)該生物表面活性劑分子的相同微生物會(huì)產(chǎn)生的泡沫多得多。
[0011]添加消泡劑并不總是這個(gè)問題的令人滿意的解決方案。不僅需要大量的消泡劑來防止過量的泡沫形成，而且通常也需要移除消泡劑以便該表面活性劑如所預(yù)期在目標(biāo)應(yīng)用中起作用。在一些情況中，即使添加大量的消泡劑并在相對(duì)較低工作百分比的發(fā)酵罐體積中操作，也不能有效控制發(fā)泡。與過量發(fā)泡和不受控制的發(fā)泡相關(guān)的、因消泡劑的使用所致的挑戰(zhàn)，在下游回收步驟中繼續(xù)存在。由于人們需求的是表面活性劑的去污力，因此在生產(chǎn)步驟中添加的消泡劑通常必須移除。
[0012]在本申請(qǐng)中引證或者確認(rèn)任何文件并不是承認(rèn)這種文件可作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明部分地基于 申請(qǐng)人:出乎意料的發(fā)現(xiàn)，即向發(fā)酵液添加沉淀劑能使生物表達(dá)的表面活性劑沉淀而且發(fā)泡減少，其中泡沫不會(huì)復(fù)發(fā)。
[0014]本發(fā)明描述與在含水溶液的生產(chǎn)中控制泡沫有關(guān)的方法和/或用途，所述含水溶液可包含一種或者多種由微生物表達(dá)的表面活性劑。這可通過對(duì)溶液進(jìn)行適當(dāng)調(diào)理(conditioning)而使能發(fā)泡的表面活性劑變得不可溶來實(shí)現(xiàn)。適當(dāng)?shù)恼{(diào)理可包括沉淀、結(jié)晶和/或任何其他能使表面活性劑不可溶或者減少臨界膠束濃度的操作。
[0015]本發(fā)明涵蓋一種控制生物表面活性劑的發(fā)泡的方法和/或用途，該生物表面活性劑在以下情況下發(fā)泡:在發(fā)酵培養(yǎng)基中通過宿主細(xì)胞生產(chǎn)該生物表面活性劑期間，當(dāng)宿主細(xì)胞胞外分泌該生物表面活性劑并且該生物表面活性劑可溶于發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，所述方法和/或用途可包括在通過宿主細(xì)胞生產(chǎn)該生物表面活性劑的同時(shí)使該生物表面活性劑不溶解化，由此發(fā)泡受到控制，因?yàn)樵摬蝗芙饣纳锉砻婊钚詣┎粫?huì)發(fā)泡。
[0016]本發(fā)明還涵蓋一種控制生物表面活性劑的發(fā)泡的方法和/或用途，該生物表面活性劑在以下情況下發(fā)泡:在發(fā)酵培養(yǎng)基中通過宿主細(xì)胞生產(chǎn)該生物表面活性劑期間，當(dāng)宿主細(xì)胞胞外分泌該生物表面活性劑并且該生物表面活性劑可溶于發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，所述方法和/或用途可包括在通過宿主細(xì)胞生產(chǎn)該生物表面活性劑的同時(shí)使該生物表面活性劑不溶解化，由此發(fā)泡受到控制，因?yàn)樵摬蝗芙饣纳锉砻婊钚詣┎粫?huì)發(fā)泡，其中泡沫減少指數(shù)大于1，和/或泡沫減少指數(shù)大于2，和/或泡沫減少指數(shù)大于3 ;和/或發(fā)酵培養(yǎng)基中的可溶性生物表面活性劑的濃度至多約lg/kg ;和/或至少25%的所生產(chǎn)的生物表面活性劑被不溶解化；和/或所述方法在不添加消泡劑的情況下進(jìn)行；和/或與不使該生物表面活性劑不溶解化而進(jìn)行的方法相比，所述方法用數(shù)量減低的消泡劑來進(jìn)行。
[0017]本發(fā)明提供一種通過適當(dāng)選擇工藝條件而降低生物表面活性劑的可溶性濃度，從而減少或者消除該生物表面活性劑在處于溶液中時(shí)所引起的泡沫形成的方法和/或用途。導(dǎo)致該生物表面活性劑的溶解度降低的工藝條件取決于該生物表面活性劑的性質(zhì)。這種工藝條件可涵蓋物理?xiàng)l件如溫度和/或壓力的適當(dāng)選擇。這種工藝條件還可涵蓋其中存在該生物表面活性劑的液體介質(zhì)的化學(xué)組成。這種組成的可能選擇是眾多的，并且是生物加工領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。調(diào)節(jié)溶解度條件的化學(xué)方法涵蓋使用能使該生物表面活性劑不可溶的添加劑，包括pH緩沖化學(xué)品、無機(jī)或者有機(jī)酸或者堿的鹽、醇、有機(jī)溶劑、聚合物、多元醇、蛋白質(zhì)、吸附劑、核酸、脂質(zhì)。這個(gè)溶解度調(diào)節(jié)化學(xué)品名單不旨在是排他性的或者限制性的。
[0018]本發(fā)明還涵蓋制備生物表面活性劑的方法和/或用途，所述方法和/或用途包括本文所提供的泡沫控制或者其(某個(gè)或某些)方面。
[0019]本發(fā)明因此涉及例如由微生物表達(dá)的表面活性劑(或者說生物表面活性劑)的原位不溶解化或者在表達(dá)的同時(shí)原位不溶解化，包括制備生物表面活性劑的分批工藝或者連續(xù)工藝在內(nèi)，所述工藝包括該生物表面活性劑的原位不溶解化或者在表達(dá)的同時(shí)原位不溶解化。不溶解化可通過沉淀、結(jié)晶[因?yàn)镋P1320595Yoneda等人；Syldatk等人/1984 ；Desai等人/1993]和/或任何其他能使該表面活性劑不可溶或者降低臨界膠束濃度的操作。有利地，不溶解化包括添加沉淀劑或者基本上由添加沉淀劑組成，所述沉淀劑例如鹽、醇、水混溶性有機(jī)溶劑、水溶性聚合物或者陽(yáng)離子聚合物(如但不限于C581)，或者不溶解化包括PH調(diào)節(jié)或者基本上由pH調(diào)節(jié)組成，所述pH調(diào)節(jié)例如降低pH。不溶解化可包括調(diào)節(jié)溫度和/或壓力，或者由調(diào)節(jié)溫度和/或壓力組成，所述調(diào)節(jié)溫度例如提高溫度或者加熱。在特別有利的實(shí)施例中，消泡劑在生物表面活性劑制備中的使用得到減少或者完全避免。在有利的實(shí)施例中，生物表面活性劑例如疏水蛋白(如疏水蛋白II)以小于約0.lg/kg的濃度存在于溶液中。
[0020]本發(fā)明還涉及一種控制在生產(chǎn)過程中會(huì)發(fā)泡的生物表面活性劑在溶液中的發(fā)泡的方法和/或用途，所述方法和/或用途可包括在該生物表面活性劑的生產(chǎn)過程中在條件可能會(huì)引起泡沫形成的時(shí)候，與此同時(shí)將該生物表面活性劑進(jìn)行不溶解化，由此發(fā)泡受到控制，因?yàn)樵摬蝗芙饣纳锉砻婊钚詣┎粫?huì)發(fā)泡。
[0021]在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及一種控制在生產(chǎn)過程中會(huì)發(fā)泡的生物表面活性劑的發(fā)泡的方法和/或用途，所述方法和/或用途可包括在通過宿主細(xì)胞在溶液中生產(chǎn)生物表面活性劑的同時(shí)將該生物表面活性劑進(jìn)行不溶解化，控制發(fā)泡使得:泡沫減少指數(shù)大于1，和/或泡沫減少指數(shù)大于2，和/或泡沫減少指數(shù)大于3 ;和/或溶液中的可溶性生物表面活性劑的濃度至多約lg/kg ;和/或至少25%的所生產(chǎn)的生物表面活性劑被不溶解化；和/或所述方法在不添加消泡劑的情況下進(jìn)行；和/或與不加以不溶解化而進(jìn)行的方法相t匕，所述方法用數(shù)量減低的消泡劑來進(jìn)行。
[0022]在又另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種控制生物表面活性劑在生產(chǎn)過程中的發(fā)泡的方法和/或用途，所述方法和/或用途可包括在生物表面活性劑的生產(chǎn)過程中控制組合物的條件以減少泡沫，這可包括調(diào)節(jié)該組合物中的條件以減少發(fā)泡，使得泡沫減少指數(shù)大于1，和/或泡沫減少指數(shù)大于2，和/或泡沫減少指數(shù)大于3 ;和/或發(fā)酵培養(yǎng)基中的可溶性生物表面活性劑的濃度至多約lg/kg ;和/或至少25%的所生產(chǎn)的生物表面活性劑被不溶解化；和/或所述方法在不添加消泡劑的情況下進(jìn)行；和/或與不加以不溶解化而進(jìn)行的方法相比，所述方法用數(shù)量減低的消泡劑來進(jìn)行；和/或所述方法在約4.0的pH下進(jìn)行。
[0023]本發(fā)明的有益效果適用于生物表面活性劑處理的所有階段，包括發(fā)酵、回收、配制、保藏、裝卸和運(yùn)輸。 具體地講，有益效果尤其適用于涉及通氣的生物表面活性劑處理階段，如但不限于混合、泵送和排氣。
[0024]本發(fā)明還涵蓋本文所描述的裝置，包括在本文描述的方法或者工藝或者它們的(某個(gè)或者某些)方面的實(shí)施中采用在內(nèi)。
[0025]因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是不將任何之前知道的產(chǎn)品、制造該產(chǎn)品的工藝或者使用該產(chǎn)品的方法涵蓋在本發(fā)明內(nèi)，從而本 申請(qǐng)人:保留權(quán)利并據(jù)此公開對(duì)任何之前知道的產(chǎn)品、工藝或者方法的棄權(quán)。要進(jìn)一步指出的是，本發(fā)明不旨在將任何不符合美國(guó)專利商標(biāo)局(USPT0，35U.S.C.§ 112，第一段)和歐洲專利局(ΕΡ0，歐洲專利公約(EPC)的第83條)的書面說明和可實(shí)施性要求的產(chǎn)品、工藝或者該產(chǎn)品的制造或者使用該產(chǎn)品的方法涵蓋在本發(fā)明內(nèi)，從而本 申請(qǐng)人:保留權(quán)利并據(jù)此公開對(duì)任何之前描述的產(chǎn)品、制造該產(chǎn)品的工藝或者使用該產(chǎn)品的方法的棄權(quán)。
[0026]應(yīng)指出，在本公開說明書中特別是在權(quán)利要求書和/或段落中，術(shù)語(yǔ)“包含”(各種語(yǔ)法形式)可具有美國(guó)專利法中賦予它的含義；例如，它可以意指“包括”(各種語(yǔ)法形式);而術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上由…組成”(各種語(yǔ)法形式)具有美國(guó)專利法中賦予它的含義，例如它允許沒有明確敘及的要素，但排除在現(xiàn)有技術(shù)中存在的要素或者影響本發(fā)明的基本特征或者新特征的要素。
[0027]要特別一提的是，“基本上由……組成”的使用是為了在技術(shù)可達(dá)的任何程度上區(qū)分美國(guó)專利公開第20100151525號(hào)及與其等同的任何文件，例如在主題上和/或?qū)＠ㄉ?例如，通過作為EP08171868或者要求EP08171868的優(yōu)先權(quán)或者與EP08171868同族)區(qū)分。例如，在本發(fā)明中，卡拉膠的任何使用不需伴隨著降低pH (特別是例如低于3.0或者
3.5)和/或調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度；并且，pH的任何降低不需伴隨著使用卡拉膠和/或調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，并且離子強(qiáng)度的任何調(diào)節(jié)不需伴隨著降低PH和/或使用卡拉膠。因此，“基本上由……組成”排除現(xiàn)有技術(shù)的要素，如加入卡拉膠并使PH低于3.5或者3，或者加入卡拉膠、使pH低于3.5或者3并調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度。
[0028]還要一提的是，某些術(shù)語(yǔ)也特別意在排除在任何可能屬現(xiàn)有技術(shù)的文件中的要素。例如，術(shù)語(yǔ)“生物表面活性劑”特別意在排除PCT公開第W02009/152176號(hào)的酶主題。類似地，在沒有或者不存在添加的消泡劑的情況下實(shí)施，這種說法是為了區(qū)分允許消泡劑存在或者添加的文件，例如美國(guó)專利公開第20100291630號(hào)及其任何等同文件。
[0029]這些和其他的實(shí)施例被以下“【具體實(shí)施方式】”公開，或者由以下“【具體實(shí)施方式】”顯而易見并被其所涵蓋。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]以下“【具體實(shí)施方式】”是以舉例方式給出，并不旨在使本發(fā)明僅限于所描述的具體實(shí)施例；結(jié)合附圖可更好地理解以下“【具體實(shí)施方式】”。
[0031]圖1不出混合后的疏水蛋白溶液(左)和混合并熱處理后的疏水蛋白溶液(右)。
[0032]圖2示出用改進(jìn)的發(fā)酵法生產(chǎn)的疏水蛋白的MALD1-T0F譜圖。7180處的峰對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)疏水蛋白分子。
[0033]圖3A和3B示出代表性的生物反應(yīng)器。細(xì)胞、培養(yǎng)基和/或營(yíng)養(yǎng)物可通過輸入部件102提供到反應(yīng)器100。輸入部件102可包括閥門104，該閥門用來控制生物體和/或培養(yǎng)基向該容器的遞送。細(xì)胞和培養(yǎng)基可通過輸入部件102提供。多個(gè)傳感器106可設(shè)置在反應(yīng)器100當(dāng)中的各個(gè)位置。`傳感器106給控制器108，110提供數(shù)據(jù)?？刂破?08，110能夠控制細(xì)胞、培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)物、沉淀劑和/或其他組分的量。沉淀的組分可用傳感器106檢測(cè)。在一些實(shí)施例中，在反應(yīng)器100中可存在窗口 116以便使用者觀察反應(yīng)器中的狀況?？刂破?08與輸出閥門112連接?？刂破?10可指導(dǎo)閥門112打開以讓沉淀物通過輸出部件114離開該罐。在一些實(shí)施例中，使用者的輸入可讓控制器指導(dǎo)閥門112按需打開和/或關(guān)閉。營(yíng)養(yǎng)物可用輸入部件118提供到反應(yīng)器。輸入部件118可連接到遞送裝置120以給反應(yīng)器100提供營(yíng)養(yǎng)物。一些實(shí)施例包括混合器122以促進(jìn)反應(yīng)器中的各組分的混合。
[0034]圖4顯示如實(shí)例20中所描述在氯化鈣處理后測(cè)得，含有表面活性肽的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)發(fā)酵液中的泡沫形成減少。
【具體實(shí)施方式】
[0035]除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的含義。為了清楚起見，定義了以下縮寫和/或術(shù)語(yǔ)。
[0036]本文所用的“生物表面活性劑”或者“生物法產(chǎn)生的表面活性劑”屬于會(huì)引起發(fā)泡的物質(zhì)。生物表面活性劑或者生物法產(chǎn)生的表面活性劑可降低表面張力，如水和疏水液體或者水和空氣之間的界面張力，其可從生物系統(tǒng)產(chǎn)生或者獲得。生物表面活性劑或者生物法產(chǎn)生的表面活性劑可以是蛋白質(zhì)、糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂、中性脂質(zhì)或者脂肪酸。生物表面活性劑包括疏水蛋白。生物表面活性劑包括脂肽和脂蛋白，如表面活性肽、肽-脂質(zhì)、沙雷濕潤(rùn)素(serrawettin)、黏液菌素、枯草桿菌蛋白酶、短桿菌肽、多粘菌素。生物表面活性劑包括糖脂如鼠李糖脂、槐糖脂、海藻糖脂和纖維二糖脂。生物表面活性劑包括聚合物如乳化膠(emulsan)、biodispersan、甘露聚糖-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)、脂乳化劑(Iiposan)、碳水化合物-蛋白質(zhì)-脂質(zhì)、蛋白質(zhì)PA。生物表面活性劑包括顆粒物如泡囊、菌毛和全細(xì)胞。生物表面活性劑包括糖苷如皂苷類。生物表面活性劑包括纖維狀蛋白質(zhì)如絲心蛋白。生物表面活性劑可自然產(chǎn)生，或者它可以是自然界中不存在的經(jīng)誘變或者遺傳工程改造的變體。這包括為了降低溶解度已進(jìn)行了工程改造，以便有助于通過根據(jù)本發(fā)明降低生物表面活性劑溶解度而控制發(fā)泡的生物表面活性劑變體。生物表面活性劑包括但不限于本文所描述的相關(guān)生物表面活性劑、衍生生物表面活性劑、變體生物表面活性劑和同源生物表面活性劑。
[0037]本文所用的“生物系統(tǒng)”包含活生物或者衍生自活生物，所述活生物如微生物、植物、真菌、昆蟲、脊椎動(dòng)物或者通過合成生物學(xué)產(chǎn)生的生命形式?；钌锟梢允峭ㄟ^經(jīng)典育種、克隆選擇、誘變和類似的用以產(chǎn)生遺傳多樣性的方法所獲得的、自然界中不存在的變體，或者它可以是通過重組DNA技術(shù)獲得的遺傳工程生物體。活生物可以整體使用，或者它可以是諸如器官培養(yǎng)物、植物栽培種、混懸細(xì)胞培養(yǎng)物、貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物或者無細(xì)胞制劑的組分的來源。
[0038]生物系統(tǒng)當(dāng)隔離(sequester)生物表面活性劑時(shí)可含有或者不含有活細(xì)胞。生物系統(tǒng)可從自然來源找到并采集，它可進(jìn)行耕種、培養(yǎng)，或者它可在工業(yè)條件下栽培。生物系統(tǒng)可從所供應(yīng)的前體或者營(yíng)養(yǎng)物合成生物表面活性劑，或者它可從它的環(huán)境富集生物表面活性劑。
[0039]本文所用的“生產(chǎn)”涉及用于生產(chǎn)化學(xué)品和生物制品的制造方法，包括但不限于收獲、采集、壓縮、放血、浸潰、均質(zhì)、糖化、釀造、發(fā)酵、回收、固液分離、細(xì)胞分離、離心、過濾(如真空過濾)、配制、保藏或者運(yùn)輸`。
[0040]本文所用的“工藝條件”指涉及本發(fā)明方法的溶劑和/或物理參數(shù)選擇(如但不限于溫度、壓力、混合或者pH)。
[0041]本文所用的“溶劑”或者“溶液”涉及可含有不溶性生物表面活性劑之外的懸浮顆粒的液體，所述懸浮顆粒如但不限于身體部分、植物片段、活細(xì)胞或者死細(xì)胞[因?yàn)镋P1320595Yoneda 等人；Syldatk 等人 /1984 ；Desai 等人 /1993]。
[0042]本文所用的“可溶性”涉及溶解在溶劑或者溶液中的物質(zhì)。
[0043]本文所用的“泡沫”涉及通過將氣泡截留在液體中、凝膠中或者半固體中而形成的物質(zhì)。
[0044]本文所用的“膨脹度(overrun) ”是一種計(jì)算值,涉及發(fā)泡溶液的體積減去起始體積再除以起始體積，以分?jǐn)?shù)或者百分?jǐn)?shù)報(bào)告。膨脹度為零意味著溶液不含泡沫。數(shù)值接近于零意味著溶液具有極少的泡沫。在初始樣品已經(jīng)含有泡沫的情況中，在計(jì)算中用初始重量替代初始體積。
[0045]本文所用的“泡沫減少指數(shù)”或者“泡沫控制指數(shù)”或者“泡沫打破指數(shù)”是某種處理在控制泡沫方面的有效性的度量。它是未處理的溶液與經(jīng)處理的溶液的膨脹度之比。泡沫減少指數(shù)等于約I意味著未處理的和經(jīng)處理的生物表面活性劑溶液具有相同的膨脹度，換句話說，該處理沒有帶來改進(jìn)。任何大于I的數(shù)值意味著泡沫減少，該處理帶來改進(jìn)。
[0046]本文所用的“泡沫控制”、“泡沫減少”或者“泡沫打破”涉及通過防止或者阻礙或者摧毀或者破壞泡沫來減少溶液中的泡沫的行動(dòng)。
[0047]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，是指通過肽鍵連接的包含氨基酸殘基的任意長(zhǎng)度的聚合物。本文使用氨基酸殘基的常規(guī)單字母密碼或三字母密碼。聚合物可為直鏈或支鏈的，其可包含經(jīng)修飾的氨基酸，并且其可被非氨基酸隔斷。所述術(shù)語(yǔ)還涵蓋天然改性或通過干預(yù)改性的氨基酸聚合物；所述干預(yù)例如是二硫鍵形成、糖基化、脂質(zhì)化、乙?；?、磷酸化或任何其他操作或改性，如與標(biāo)記組分綴合。在所述定義中還包括(例如)包含氨基酸的一種或者多種類似物(包括，例如非天然氨基酸、D-氨基酸等)的多肽，以及本領(lǐng)域中已知的其他修改形式。
[0048]本文所用的“培養(yǎng)物溶液”是包含目的生物表面活性劑和其他可溶性或者不溶性組分的液體。這種組分包括其他蛋白質(zhì)、非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)如細(xì)胞和細(xì)胞碎片、核酸、多糖、月旨質(zhì)、化學(xué)品如消泡劑、絮凝劑、鹽、糖、維生素、生長(zhǎng)因子、沉淀劑等。“培養(yǎng)物溶液”還可以被稱為“蛋白質(zhì)溶液”、“液體培養(yǎng)基”、“滲濾培養(yǎng)液”、“澄清培養(yǎng)液”、“濃縮物”、“經(jīng)調(diào)理的培養(yǎng)基”、“發(fā)酵培養(yǎng)液”、“裂解培養(yǎng)液”、“裂解物”、“細(xì)胞培養(yǎng)液”或者簡(jiǎn)稱“培養(yǎng)液(broth)”。如果存在細(xì)胞的話，細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、人細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、合成細(xì)胞等。
[0049]本文所用的術(shù)語(yǔ)“回收”指這么一種過程，在該過程中使包含生物表面活性劑和一種或者多種不想要的組分的液體培養(yǎng)物經(jīng)歷一些工藝，以將生物表面活性劑與不想要的組分中的至少一些分離開來，所述不想要的組分例如水、細(xì)胞和細(xì)胞碎片、其他蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、糖、多元醇、無機(jī)或者有機(jī)鹽、酸和堿、以及顆粒材料。
[0050]本文所用的“生物表面活性劑產(chǎn)品”指適合提供給最終用戶如消費(fèi)者的生物表面活性劑制品。生物表面活性劑產(chǎn)品可包括細(xì)胞、細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基組分、配制賦形劑如緩沖齊?、鹽、防腐劑、還原劑、糖、多元醇、表面活性劑等，添加或者保留所述配制賦形劑是為了延長(zhǎng)生物表面活性劑的功能貨架期或者有利于生物表面活性劑的最終應(yīng)用。
[0051]本文所用的功能上和/或結(jié)構(gòu)上類似的生物表面活性劑被認(rèn)為是“相關(guān)生物表面活性劑”。這種生物表面活性劑可衍生自不同屬和/或種的生物，或者甚至不同類別的生物(例如細(xì)菌和真菌)。相關(guān)生物表面活性劑還涵蓋通過一級(jí)序列分析確定的、通過三級(jí)結(jié)構(gòu)分析確定的或者通過免疫交叉反應(yīng)性確定的同源物。
[0052]本文所用的術(shù)語(yǔ)“衍生生物表面活性劑”可指這樣的蛋白質(zhì)基生物表面活性劑，其是通過將一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加到C端和/或N端、在氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)不同位點(diǎn)處置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸、和/或在該蛋白質(zhì)的一端或兩端或氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸、和/或在該氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生自某種生物表面活性劑。生物表面活性劑衍生物的制備可通過修飾編碼天然蛋白的DNA序列、將該DNA序列轉(zhuǎn)化到合適的宿主中以及表達(dá)該經(jīng)修飾的DNA序列以形成該衍生蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)?！把苌锉砻婊钚詣边€可涵蓋其中脂質(zhì)部分或者碳水化合物部分已在合成過程中或者合成之后連接到蛋白質(zhì)主鏈的生物表面活性劑衍生物。
[0053]本文所用的術(shù)語(yǔ)“衍生生物表面活性劑”或者“變體生物表面活性劑”可指這樣的脂質(zhì)基和/或糖基生物表面活性劑，其是通過添加一個(gè)或者多個(gè)脂質(zhì)和/或糖、在一個(gè)或者多個(gè)不同的位點(diǎn)處置換一個(gè)或者多個(gè)脂質(zhì)和/或糖、和/或在分子的一端或者兩端或者在結(jié)構(gòu)內(nèi)的一個(gè)或者多個(gè)位點(diǎn)處缺失一個(gè)或者多個(gè)脂質(zhì)和/或糖、和/或在結(jié)構(gòu)的一個(gè)或者多個(gè)位點(diǎn)處插入一個(gè)或者多個(gè)脂質(zhì)和/或糖而衍生自某種生物表面活性劑。
[0054]相關(guān)(和衍生)生物表面活性劑包括“變體生物表面活性劑”。變體蛋白質(zhì)基生物表面活性劑與參考/親本生物表面活性劑(例如野生型生物表面活性劑)差別在于少數(shù)氨基酸殘基處的置換、缺失和/或插入。不同的氨基酸殘基的數(shù)量可以為一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多個(gè)氨基酸殘基。變體生物表面活性劑與野生型生物表面活性劑共有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或者甚至至少約99%或者更高的氨基酸序列同一性。變體生物表面活性劑與參考生物表面活性劑的差異還可在于選定的模體、結(jié)構(gòu)域、表位、保守區(qū)等。
[0055]本文所用的術(shù)語(yǔ)“類似序列”是指蛋白質(zhì)基生物表面活性劑內(nèi)的提供與生物表面活性劑相似的功能、三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或保守殘基的序列。例如，在包含α-螺旋或β-片層結(jié)構(gòu)的表位區(qū)域中，類似序列中的置換氨基酸優(yōu)選地保持相同的特定結(jié)構(gòu)。所述術(shù)語(yǔ)還指核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，開發(fā)了類似序列，使得置換氨基酸導(dǎo)致變體酶顯示相似或改進(jìn)的功能。在一些實(shí)施例中，生物表面活性劑中的氨基酸三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或保守殘基位于目的區(qū)段或者片段之處或者附近。因此，在目的區(qū)段或片段包含(例如)α-螺旋或β -片層結(jié)構(gòu)的情況下，置換氨基酸優(yōu)選地保持該特定結(jié)構(gòu)。
[0056]本文所用的術(shù)語(yǔ)“同源生物表面活性劑”指具有與參考生物表面活性劑相似的活性和/或結(jié)構(gòu)的生物表面活性劑。這并不意味著各同源物一定在進(jìn)化上相關(guān)。因此，意圖的是該術(shù)語(yǔ)涵蓋從不同生物體獲得相同、相似或者相應(yīng)的生物表面活性劑(即，就結(jié)構(gòu)和功能而言)。在一些實(shí)施例中，希望鑒定具有與參考生物表面活性劑相似的四級(jí)、三級(jí)和/或一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源物。
[0057]序列之間同源性的程度可使用本領(lǐng)域中已知的任何合適的方法確定(參見如Smith 和 Waterman, (198 1)，《應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展》(Adv.Appl.Math.) ,2:482 ；Needleman 和ffunsch, (1970),《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.), 48:443 ;Pearson 和 Lipman, (1988),《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，85:2444 ;程序，諸如在威斯康星遺傳學(xué)軟件包(Wisconsin Genetics Software Package,得自威斯康星州麥迪遜市遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組(Genetics Computer Group, Madison, WI))中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA ;以及 Devereux 等人,(1984),《核酸研究》(NucleicAcids Res.), 12:387-395。
[0058]例如，PILEUP是可用于測(cè)定序列同源程度的程序。PILEUP使用漸進(jìn)式逐對(duì)比對(duì)從一組相關(guān)序列產(chǎn)生多個(gè)序列對(duì)比。其還能夠繪制顯示聚類關(guān)系(用于產(chǎn)生比對(duì))的樹形圖。PILEUP使用Feng和Doolittle的漸進(jìn)式比對(duì)方法(Feng和Doolittle, (1987)，《分子進(jìn)化雜志》(J.Mol.Evol.) ,35:351-360)。所述方法與Higgins和Sharp描述的方法類似(Higgins和Sharp，(1989)，《計(jì)算機(jī)在生物科學(xué)中的應(yīng)用》(CABIOS)，5:151-153)?？捎玫腜ILEUP參數(shù)包括:默認(rèn)間隙權(quán)重3.00、默認(rèn)間隙長(zhǎng)度權(quán)重0.10，以及加權(quán)末端間隙?？捎玫乃惴ǖ牧硪粋€(gè)例子為Altschul等人描述的BLAST算法(Altschul等人，(1990)，《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.),215:403-410 ;以及Karlin等人，(1993)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，90:5873-5787)。一種特別有用的 BLAST 程序?yàn)?WU-BLAST-2 程序(參見 Altschul 等人，(1996)，《酶學(xué)方法》(Meth.Enzymol.),266:460-480)。參數(shù) “W”、“T”和“X”確定比對(duì)的靈敏度和速度。BLAST程序使用默認(rèn)值:字長(zhǎng)(W) 1UBL0SUM62記分矩陣(參見Henikoff和Henikoff，(1989)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，89:10915)比對(duì)⑶50次、預(yù)期(E) 10、if 5、N' _4，對(duì)兩條鏈進(jìn)行比較。[0059]如本文所用，在至少兩條核酸或多肽的情況下，短語(yǔ)“基本上類似”和“基本上相同”通常意味著多核苷酸或多肽包含的序列與參考(即，野生型)序列相比具有至少約70%的同一性、至少約75%的同一性、至少約80%的同一性、至少約85%的同一性、至少約90%的同一性、至少約91%的同一性、至少約92%的同一性、至少約93%的同一性、至少約94%的同一性、至少約95%的同一性、至少約96%的同一性、至少約97%的同一性、至少約98%的同一性、或甚至至少約99%的同一性或更高的同一性。序列同一性可使用諸如BLAST、ALIGN和CLUSTAL之類的已知程序，使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)測(cè)定。(參見例如Altschul等人，(1990)，《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.),215:403-410 ;Henikoff等人，(1989)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，89:10915 ；Karin 等人，(1993)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci USA)，90:5873 ;以及 Higgins 等人，(1988)，《基因》(Gene)，73:237-244)。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center forBiotechnology Information)公開獲得。另外，可使用FASTA對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索(Pearson等人，(1988)，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，85:2444-2448)。兩條多肽實(shí)質(zhì)上相同的一個(gè)指示是第一多肽與第二多肽是免疫交叉反應(yīng)性的。通常，因保守氨基酸置換而不同的多肽是免疫交叉反應(yīng)性的。因此，一種多肽與第二多肽實(shí)質(zhì)上一致，例如，在此情況下兩個(gè)多肽僅因保守置換而不同。兩種核酸序列實(shí)質(zhì)上一致的另一個(gè)指示是兩種分子在嚴(yán)格的條件(如，在中至高嚴(yán)格度的范圍內(nèi))下彼此雜交。
[0060]本文所用的“野生型”和“天然”生物表面活性劑是自然界中存在的那些生物表面活性劑。術(shù)語(yǔ)“野生型序列”和“野生型基因”在本文中互換使用，是指天然的或天然存在于宿主細(xì)胞內(nèi)的序列。在一些實(shí)施例中，野生型序列是指為蛋白質(zhì)工程項(xiàng)目的起始點(diǎn)的目的序列。編碼天然形成的蛋白質(zhì)的基因可依據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知的一般方法獲得。所述方法一般包括合成出具有編碼生物表面活性劑的區(qū)域的推定序列的標(biāo)記探針，從表達(dá)該蛋白質(zhì)的生物體制備基因組文庫(kù)，并通過與探針的雜交對(duì)文庫(kù)篩選目的基因。然后對(duì)陽(yáng)性雜交克隆進(jìn)行定位和測(cè)序。
[0061 ] 本文所用的“不溶性”或者“不溶解化的”涉及難溶或者極其難溶的化合物?？赏ㄟ^對(duì)Iml樣品在14，000 X g下進(jìn)行高速離心10分鐘，使化合物的不溶性級(jí)分與可溶性級(jí)分分離。作為另一種選擇，可通過濾過0.45 μ m膜過濾器(例如Millipore DuraporelL瓶頂過濾器)，使不溶性級(jí)分與可溶性級(jí)分分離。不溶性級(jí)分在離心后會(huì)在沉淀中，或者在過濾后保留在過濾器上。作為另一種選擇，可通過濁度或者混濁的出現(xiàn)檢測(cè)之前澄清的溶液的不溶解化。作為另一種選擇，可通過光學(xué)顯微鏡術(shù)檢測(cè)不溶性顆粒如晶體或者沉淀物。
[0062]本文所用的“沉淀”涉及通過化學(xué)反應(yīng)或者通過物理?xiàng)l件的改變?cè)斐蓮幕衔锏娜芤褐行纬稍摶衔锏牟豢扇苄问?。本文所用的“沉淀劑”涉及造成沉淀的物質(zhì)。
[0063]本文所用的“CMC”涉及臨界膠束濃度，其可指表面活性劑的這么一個(gè)濃度，在該濃度以上會(huì)形成膠束，幾乎所有加到該系統(tǒng)的額外表面活性劑都進(jìn)入膠束。CMC是表面活性劑的重要特征。在達(dá)到CMC之前，表面張力隨著表面活性劑濃度的變化而劇烈變化。在達(dá)到CMC之后，表面張力保持相對(duì)恒定或者以較小的斜率變化。特定分散劑在特定介質(zhì)中的CMC的數(shù)值取決于溫度、壓力，并且(有時(shí)強(qiáng)烈地)取決于其他表面活性物質(zhì)和電解質(zhì)的存在和濃度。膠束僅在臨界膠束溫度以上才形成。本文所用的“減低CMC”具有與降低生物表面活性劑的溶解度相同的作用，因?yàn)樗档捅砻婊钚詣┰谌芤褐械臐舛?，從而減少泡沫形成。[0064] 本文所用的“宿主細(xì)胞”可以是任何在其中產(chǎn)生生物表面活性劑的細(xì)胞，無論是天然產(chǎn)生還是通過重組方法產(chǎn)生。宿主細(xì)胞可包括但不限于傘菌屬(Agaricus spp.)(例如雙孢蘑燕(Agaricus bisporus))、田頭燕屬(Agrocybe spp.)(例如楊樹燕(Agrocybeaegerita))、阿耶羅菌屬(Ajellomyces spp.)(例如莢膜阿耶羅菌(Ajellomycescapsulatus)、皮炎阿耶羅菌(Ajellomyces dermatitidis))、曲霉屬(Aspergillus spp.)(例如 Aspergillus arvi1、短柄曲霉(Aspergillus brevipes)、棒曲霉(Aspergillusclavatus)、硬柄曲霉(Aspergillus duricaulis)、捕圓曲霉(Aspergillus ellipticus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、煙束曲霉(Aspergillusfumisynnematus)、遲緩曲霉(Aspergillus lentulus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、單側(cè)曲霉(Aspergillus unilateralis)、綠垂曲霉(Aspergillus viridinutans))、芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)(例如地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)或者枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、白僵菌屬(Beauveria spp.)(例如球抱白僵菌(Beauveria bassiana))、假絲酵母屬(Candidaspp.)(例如 Candida bogoriensis、Candida bombicola)、麥角菌屬(Claviceps spp.)(例如紡錘麥角菌(Claviceps fusiformis))、球抱子菌屬(Coccidioides spp.)(例如 Coccidioides posadasii)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus spp.)(例如異旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus))、毛皮傘屬(Crinipellis spp.)(例如 Crinipellisperniciosa)、隱叢赤殼屬(Cryphonectria spp.)(例如寄生隱叢赤殼菌(Cryphonectriaparasitica) )、Davidiella 屬(Davidiella spp.)(例如 Davidiella tassiana)、網(wǎng)筆石屬(Dictyonema spp.)(例如光葉網(wǎng)筆石(Dictyonema glabratum))、裸胞殼屬(Emericella spp.)(例 如構(gòu)巢裸抱殼(Emericella nidulans)、埃希氏菌屬(Escherichiaspp.)(例如大腸桿菌(Escher ichia coli))、小火焰菌屬(Flammulina spp.)(例如金針燕(Flammulina velutipes))、德刀菌屬(Fusarium spp.)(例如黃色德刀菌(Fusariumcu Imorum))、赤霉屬(Gib berella spp.)(例如串珠狀赤霉(Gibberella moniliformis))、小叢殼屬(Glomerella spp.)(例如禾生小叢殼(Glomerella graminicola))、樹花菌屬(Grifola spp.)(例如灰樹花(Grifola frondosa))、漢遜酵母屬(Hansenula spp.)(例如多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha))、異擔(dān)子屬(Heterobasidionspp.)(例如松根異擔(dān)子(Heterobasidion annosum))、肉座菌屬(Hypocreaspp.)(例如紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina) )、Hypocrea lixi1、綠色肉座菌(Hypocrea virens))、克魯維酵母屬(Kluyveromyces spp.)(例如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis))、錯(cuò)蘑屬(Laccaria spp.)(例如雙色錯(cuò)蘑(Laccaria bicolor))、香燕屬(Lentinulaspp.)(例如香燕(Lentinula edodes))、巨座殼屬(Magnaporthe spp.)(例如稻痕病菌(Magnaporthe oryzae))、小皮傘屬(Marasmius spp.)(例如 Marasmius cladophyllus)、Moniliophthora 屬(Moniliophthora spp.)(例如 Moniliophthora perniciosa)、新薩托菌屬(Neosartorya spp.)(例如淺黃新薩托菌(Neosartorya aureola)、芬尼新薩托菌(Neosartorya fennelliae)、費(fèi)希新薩托菌(Neosartorya fischeri)、光滑新薩托菌(Neosartorya glabra)、平土冢新薩托菌(Neosartoryahiratsukae)、NeosartoryanishimuraeλNeosartorya otani1、假費(fèi)希新薩托菌(Neosartorya pseudof ischeri)、四繞新薩托菌(Neosartorya quadricincta)、匙囊新薩托菌(Neosartorya spathulata)、剌抱新薩托菌(Neosartorya spinosa)、寬脊新薩托菌(Neosartorya stramenia)、Neosartoryaudagawae)、脈抱菌屬(Neurospora spp.)(例如粗糖脈胞菌(Neurospora crassa)、陷脈抱菌(Neurospora discreta)、間型脈抱菌(Neurospora intermedia)、好食脈抱菌(Neurospora sitophila)、四抱脈抱菌(Neurospora tetrasperma))、里予村菌屬(Nomuraeaspp.)(例如萊氏野村菌(Nomuraea rileyi))、長(zhǎng)_殼屬(Ophiostoma spp.)(例如新榆枯萎病菌(Ophiostoma novo-ulmi)、Ophiostomaquercus)、副球抱子菌屬(Paracoccidioidesspp.)(例如巴西副球抱子菌(Paracoccidioides brasiliensis))、釘抱屬(Passaloraspp.)(例如 Passalora fulva)、粧燕菌屬(Paxillus spp.)(例如長(zhǎng)絲粧燕(Paxillusfilamentosus)、卷邊粧燕(Paxillus involutus))、青霉屬(Penicillium spp.)(例如沙門桕干酪青霉(Penicillium camemberti)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)、馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei) )、Phlebiopsis 屬(Phlebiopsis spp.)(例如大伏革菌(Phlebiopsis gigantea))、畢赤酵母屬(Pichia spp.)(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))、豆馬勃屬(Pisolithus)(例如彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius))、側(cè)耳屬(Pleurotus spp.)(例如平燕(Pleurotus ostreatus))、足抱蟲屬(Podospora spp.)(例如 柄孢殼菌(Podospora anserina))、泊氏孔菌屬(Postiaspp.)(例如臥孔菌(Postia placenta))、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)(例如銅綠假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosam)、焚光假單胞菌(Pseudomonas f Iuorescens)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas pyocyanea)、核腔菌屬(Pyrenophora spp.)(例如偃麥草核腔菌(Pyrenophora tritic1-repentis))、酵母菌屬(Saccharomyces spp.)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces spp.)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、裂糟菌屬(Schizophyllum spp.)(例如裂糟菌(Schizophyllum commune)、鏈霉菌屬(Streptomyces spp.)(例如變鉛青鏈霉菌(Streptomyces Iividans))、籃狀菌屬(Talaromyces spp.)(例如柄籃狀菌(Talaromyces stipitatus))、球擬酵母屬(Torulopsis spp.)、木霉屬(Trichodermaspp.)(例如棘抱木霉(Trichoderma asperellum)、深綠木霉(Trichoderma atroviride)、綠色木霉(Trichoderma viride)、里`氏木霉(Trichoderma reesii)[以前稱紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)])、口蘑屬(Tricholoma spp.)(例如掠灰口蘑(Tricholomaterreum) )、Uncinocarpus 屬(Uncinocarpus spp.)(例如 Uncinocarpus reesii)、輪枝抱屬(Verticillium spp.)(例如大_輪枝抱(Verticillium dahliae) )、Xanthodactylon 屬(Xanthodactylon spp.)(例如(Xanthodactylon flammeum)、石黃衣屬(Xanthoria spp.)(例如 Xanthoria calcicola、Xanthoria capensis、Xanthoria ectaneoides、XanthoriaflammeaλXanthoria karrooensis、Xanthoria ligulata、石黃衣(Xanthoria parietina)、Xanthoria turbinata)或者亞羅酵母屬(Yarrowia spp.)(例如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica))。
[0065] 本發(fā)明的方法可應(yīng)用于任何生物表面活性劑從培養(yǎng)液的分離。有利地，生物表面活性劑是由微生物分泌的可溶性胞外生物表面活性劑。一組示例性的生物表面活性劑是疏水蛋白，其是由絲狀真菌表達(dá)和/或衍生自絲狀真菌的一類富含半胱氨酸的多肽。疏水蛋白是小的(約100個(gè)氨基酸)多肽，因其在物體(包括細(xì)胞和人造材料)的表面上形成疏水覆層的能力而知名。疏水蛋白最初于1991年在裂糟菌(Schizophyllum commune)中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已在多種絲狀真菌中確認(rèn)?；谟H水性(hydropathy)和其他生物物理性質(zhì)的差異，疏水蛋白被歸類為I類和II類。基于保守胱氨酸殘基的特征性間距和疏水性模式，疏水蛋白被分為兩個(gè)不同的類別(I類和II類)(Kershaw和Talbot，1998，《真菌遺傳生物學(xué)》(Fungal Genet Biol)，23:18 - 23 ;以及，2001，《微生物學(xué)年度評(píng)論》(Annu
RevMicrobiol)，55:625 - 646)。II類疏水蛋白的例子參見例如Linder等人，(2005)，《歐洲微生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)微生物學(xué)評(píng)論》(FEMS Microbiologyreviews)，29:877-96 ；以及Kubicek等人，(2008)，《BMC 進(jìn)化生物學(xué)》(BMC Evolutionary Biology)，8: 4。
[0066]疏水蛋白的表達(dá)通常需要在發(fā)酵過程中添加大量的一種或者多種消泡劑。否則，疏水蛋白多肽所產(chǎn)生的泡沫會(huì)使通氣裝置過濾器飽和，污染放氣孔，造成壓力積聚和降低蛋白質(zhì)產(chǎn)率。結(jié)果，疏水蛋白的粗濃縮物常常含有殘余量的消泡劑以及宿主細(xì)胞污染物，這在疏水蛋白制品中是不合需要的，尤其是當(dāng)疏水蛋白要作為食品添加劑時(shí)。
[0067]疏水蛋白可以可逆地以具有比其實(shí)際分子量大的表觀分子量的形式存在，這使得疏水蛋白很適合用本發(fā)明方法進(jìn)行回收。含有疏水蛋白的液體或者泡沫可如所描述連續(xù)地或者定期地從發(fā)酵罐收獲以進(jìn)行蛋白質(zhì)回收，或者在發(fā)酵操作結(jié)束時(shí)批式收獲。
[0068]疏水蛋白可以是本領(lǐng)域知道的任何I類和II類疏水蛋白，例如來自以下生物的疏水蛋白:傘菌屬(Agaricus spp.)(例如雙孢蘑燕(Agaricus bisporus))、田頭燕屬(Agrocybe spp.)(例如楊樹燕(Agrocybe aegerita))、阿耶羅菌屬(Ajellomycesspp.)(例如莢膜阿耶羅菌(Ajellomyces capsulatus)、皮炎阿耶羅菌(Ajellomycesdermatitidis))、曲霉屬(Aspergillus spp.)(例如 Aspergillus arvi1、短柄曲霉(Aspergillus brevipes)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、硬柄曲霉(Aspergillusduricaulis)、捕圓曲霉(Aspergillus ellipticus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、煙曲霉(Aspergillus fu`migatus)、煙束曲霉(Aspergillus fumisynnematus)、遲緩曲霉(Aspergillus lentulus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、單側(cè)曲霉(Aspergillusunilateralis)、綠垂曲霉(Aspergillus viridinutans))、白僵菌屬(Beauveria spp.)(例如球孢白僵菌(Beauveria bassiana))、麥角菌屬(Claviceps spp.)(例如紡錘麥角菌(Claviceps fusiformis))、球抱子菌屬(Coccidioides spp.)(例如 Coccidioidesposadasii)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus spp.)(例如異旋孢腔菌(Cochliobolusheterostrophus))、毛皮傘屬(Crinipellis spp.)(例如 Crinipellis perniciosa)、隱叢赤殼屬(Cryphonectria spp.)(例如寄生隱叢赤殼菌(Cryphonectria parasitica))、Davidiella 屬(Davidiella spp.)(例如 Davidiella tassiana)、網(wǎng)筆石屬(Dictyonemaspp.)(例如光葉網(wǎng)筆石(Dictyonema glabratum))、裸胞殼屬(Emericella spp.)(例如構(gòu)巢裸胞殼構(gòu)巢裸孢殼(Emericella nidulans))、小火焰菌屬(Flammulina spp.)(例如金針燕(Flammulina velutipes))、鐮刀菌屬(Fusarium spp.)(例如黃色鐮刀菌(Fusariumcu Imorum))、赤霉屬(Gibberella spp.)(例如串珠狀赤霉(Gibberella moniliformis))、小叢殼屬(Glomerella spp.)(例如禾生小叢殼(Glomerella graminicola))、樹花菌屬(Grifola spp.)(例如灰樹花(Grifola frondosa))、異擔(dān)子屬(Heterobasidionspp.)(例如松根異擔(dān)子(Heterobasidion annosum))、肉座菌屬(Hypocrea spp.)(例如紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)、Hypocrea lixi1、綠色肉座菌(Hypocrea virens))、錯(cuò)蘑屬(Laccaria spp.)(例如雙色錯(cuò)蘑(Laccaria bicolor))、香燕屬(Lentinulaspp.)(例如香燕(Lentinula edodes))、巨座殼屬(Magnaporthe spp.)(例如稻痕病菌(Magnaporthe oryzae))、小皮傘屬(Marasmius spp.)(例如 Marasmius cladophyllus)、Moniliophthora 屬(Moniliophthora spp.)(例如 Moniliophthora perniciosa)、新薩托菌屬(Neosartorya spp.)(例如淺黃新薩托菌(Neosartorya aureola)、芬尼新薩托菌(Neosartorya fennelliae)、費(fèi)希新薩托菌(Neosartorya fischeri)、光滑新薩托菌(Neosartorya glabra)、平土冢新薩托菌(Neosartorya hiratsukae)、Neosartoryanishimurae、Neosartoryaotani1、假費(fèi)希新薩托菌(Neosartorya pseudof ischeri)、四繞新薩托菌(Neosartorya quadricincta)、匙囊新薩托菌(Neosartorya spathulata)、剌抱新薩托菌(Neosartorya spinosa)、寬脊新薩托菌(Neosartorya stramenia)、Neosartoryaudagawae)、脈抱菌屬(Neurospora spp.)(例如粗糖脈胞菌(Neurospora crassa)、陷脈抱菌(Neurospora discreta)、間型脈抱菌(Neurospora intermedia)、好食脈抱菌(Neurospora sitophila)、四抱脈抱菌(Neurospora tetrasperma))、里予村菌屬(Nomuraeaspp.)(例如萊氏野村菌(Nomuraea rileyi))、長(zhǎng)_殼屬(Ophiostoma spp.)(例如新榆枯萎病菌(Ophiostoma novo-ulmi) Λ Ophiostoma quercus)、副球抱子菌屬(Paracoccidioidesspp.)(例如巴西副球抱子菌(Paracoccidioides brasiliensis))、釘抱屬(Passaloraspp.)(例如 Passalora fulva)、粧燕菌屬(Paxillus spp.)(例如長(zhǎng)絲粧燕(Paxillusfilamentosus)、卷邊粧燕(Paxillus involutus))、青霉屬(Penicillium spp.)(例如沙門桕干酪青霉(Penicillium camemberti)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)、馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei) )、Phlebiopsis 屬(Phlebiopsis spp.)(例如大伏革菌(Phlebiopsis gigantea))、豆馬勃屬(Pisolithus)(例如彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius))、側(cè)耳屬(Pleurotus spp.)(例如平燕(Pleurotus ostreatus))、足抱蟲屬(Podospora spp.)(例如柄孢殼菌(Podospora anserina))、泊氏孔菌屬(Postiaspp.)(例如鮭色泊氏孔菌(Postia placenta))、核腔菌屬(Pyrenophora spp.)(例如偃麥草核腔菌(Pyrenophora tritic1-repentis))、裂糟菌屬(Schizophyllum spp.)(例如裂糟菌(Schizophyllum commune))、籃狀菌屬(Talaromyces spp.)(例如柄籃狀菌(Talaromyces stipitatus))、木霉屬(Trichoderma spp.)(例如棘抱木霉(Trichodermaasperellum)、深綠木霉(Trichoderma atroviride)、綠色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesii)[以前稱紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)])、口蘑屬(Tricholoma spp.)(例如掠灰口蘑(Tricholoma terreum) )、Uncinocarpus 屬 (Uncinocarpus spp.)(例如 Uncinocarpus reesii)、輪枝抱屬(Verticillium spp.)(例如大 I? 花輪枝抱(Verticillium dahliae) )、Xanthodactylon 屬(Xanthodactylonspp.)(例如 Xanthodactylon f lammeum)、石黃衣屬(Xanthoria spp.)(例如 Xanthoriacalcicola、 Xanthoria capensis、 Xanthoria ectaneoides、 Xanthoria flammea、Xanthoria karrooensisΛXanthoria ligulata、石黃衣(Xanthoria parietina)'Xanthoriaturbinata)等。在例如以下文獻(xiàn)中對(duì)疏水蛋白進(jìn)行了綜述:Sunde，M等人，(2008) ,Micron,39:773-84 ；Linder, Μ.等人，(2005)，《歐洲微生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)微生物學(xué)評(píng)論》(FEMSMicrobiol Rev.),29:877-96 ；以及 WdsteHi H.等人，(2001)，《微生物學(xué)年鑒》(Ann.Rev.Microbiol.55:625-46。
[0069]在一個(gè)特別有利的實(shí)施例中，疏水蛋白來自木霉屬(Trichoderma spp.)(例如棘抱木霉(Trichoderma asperellum)、深綠木霉(Trichoderma atroviride)、綠色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesii)[以前稱紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)]，有利地，里氏木霉(Trichodermareseei)。
[0070]I類和II類疏水蛋白都已在真菌中被鑒定為分泌蛋白，這種分泌蛋白在疏水界面處自組裝成兩性膜。I類疏水蛋白的聚集體一般相對(duì)不可溶，而II類疏水蛋白的聚集體容易溶解于多種溶劑中。有利地，疏水蛋白可溶于水，所謂可溶于水是指至少0.1%可溶于水，優(yōu)選至少0.5%。所謂至少0.1%可溶是指當(dāng)將99.9mL水中的0.1g疏水蛋白在20°C下進(jìn)行30，OOOg離心30分鐘時(shí)，沒有疏水蛋白沉淀出來。
[0071]本 申請(qǐng)人:已觀察到，通過其他方法產(chǎn)生的疏水蛋白II會(huì)導(dǎo)致C末端的一個(gè)或者多個(gè)氨基酸切除。從本發(fā)明的方法，特別是如果使疏水蛋白沉淀或者不可溶的話，沒有觀察到切除。
[0072]還在絲狀細(xì)菌如放線菌(Actinomycete)和鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)中鑒定了疏水蛋白樣蛋白質(zhì)(例如“chaplins”)(W001/74864 ;Talbot，2003，《當(dāng)代生物學(xué)》(Curr.Biol)，13:R696-R698)。與真菌疏水蛋白形成對(duì)比的是，這些細(xì)菌蛋白質(zhì)僅可形成最多一個(gè)二硫鍵，因?yàn)樗鼈兛赡軆H具有兩個(gè)半胱氨酸殘基。這種蛋白質(zhì)是疏水蛋白的功能等同物的一個(gè)例子，并且是落入本文方法的生物表面活性劑范圍內(nèi)的另一類分子。
[0073]鼠李糖脂是由銅綠假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa)產(chǎn)生和/或衍生的一類糖脂，常常被引證為細(xì)菌表面活性劑當(dāng)中得到最好地表征的細(xì)菌表面活性劑。主要有兩類鼠李糖脂即單鼠李糖脂和雙鼠李糖脂；它們分別由一個(gè)或者兩個(gè)鼠李糖基團(tuán)組成。鼠李糖脂已在化妝品行業(yè)中廣泛用于諸如保濕劑、牙膏、避孕套潤(rùn)滑劑和香波的產(chǎn)品，并且在有機(jī)物和重金屬污染場(chǎng)所的生物修復(fù)中有效。它們還能促進(jìn)銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa )對(duì)廢烴如原油和植物油的降解。
[0074]槐糖脂存在于假絲酵母屬(Candida)或者相關(guān)酵母種并由這些微生物分泌到培養(yǎng)基中，并且已知是表面活性劑。羥基脂肪酸的性質(zhì)是特征性的，羥基基團(tuán)位于η或η-1碳原子上；碳鏈長(zhǎng)為16、17或者18,因生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成而變。已在Candida bogoriensis中確認(rèn)了具有不飽和C18脂肪酸的槐糖苷。從球擬酵母屬(Torulopsis spp)分離了獨(dú)特的槐糖脂，其與已經(jīng)提到的那些槐糖脂不同之處在于它是一種大環(huán)內(nèi)酯，其中羥基脂肪酸的羧基基團(tuán)被槐糖中的末端葡萄糖的4’羥基基團(tuán)酯化。在該脂質(zhì)中還存在兩個(gè)乙酸基團(tuán)?；碧侵蚱鋬捎H結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出表面活性劑活性。在槐糖脂生產(chǎn)菌中，Candida bombicola是研究得最多的一個(gè)種，因?yàn)樗艽罅慨a(chǎn)生槐糖脂物質(zhì)。已證實(shí)槐糖脂可用于硬質(zhì)表面清潔和自動(dòng)盤碟洗滌漂洗助劑配方。
[0075]表面活性肽是一種細(xì)菌環(huán)狀脂肽，是一種非常強(qiáng)效的表面活性劑，常用作抗生素。它是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(產(chǎn)內(nèi)生孢子的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)所產(chǎn)生的24類抗生素之一。表面活性肽的結(jié)構(gòu)由七個(gè)氨基酸的肽環(huán)(L-天冬酰胺、L-亮氨酸、谷氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸和兩個(gè)D-亮氨酸)和長(zhǎng)13-15個(gè)碳的疏水脂肪酸鏈組成，所述疏水脂肪酸鏈?zhǔn)蛊淠軌虼┩讣?xì)胞膜。表面活性肽與其他表面活性劑一樣，能影響它被溶解于其中的液體的表面張力。它在低至20 μ M的濃度下，能將水的表面張力從72mN/m降低到27mN/m。[0076]美國(guó)專利案7，906，315 ;7，893，015 ;7，887，906 ;7，858，334 ;7，749，203 ;7，581，594 ;7，556，654 ;7，541，321 ;7，540，926 ;7，473，363 ;7，413，643 ;7，325，603 ；7，226，897 ;7，198，680 ;6，956，122 ;6，921，390 ;6，727，223 ;6，582，730 ;6，475，968 ；6，389，820 ;6，369，014 ;6，346，281 ;6，319，898 ;6，262，038 ;6，063，602 ;6，060，287 ；6，051，552 ;5，866，376 ;5，767，090 ;5，635，392 ;5，551，987 ;5，417，879 ;5，128，262 ；4，943，390 和 4，640，767 ;以及美國(guó)專利公開案 20110065167 ；20110027844 ；20100323928 ；20100168405 ；20100144643 ；20100143316 ；20100004472 ；20100000795 ；20090288825 ；20090269833 ；20090203565 ；20090170700 ；20090148881 ；20090098028 ；20080296222 ；20080293570 ；20080193730 ；20080085251 ；20080023044 ；20080023030 ；20080020947 ；20070249035 ；20070249034 ；20070215347 ；20070134288 ；20060106120 ；20050271698 ；20050266036 ；20050227338 ；20050176117 ；20050106702 ；20040251197 ；20040244969 ；20040231982 ；20040156816 ；20040152613 ；20040022775 ；20030096988 ；20030018306 ；20020176895 ；20020123077和20020120101中所描述的生物表面活性劑，也可通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)；另參見《表面活性劑科學(xué)系列第48卷，生物表面活性劑，生產(chǎn)性質(zhì)應(yīng)用》(Surfactant Science SeriesVolume48, BIOSURFACTANTS, Production PropertiesApplications)，NaimKosaric 編輯，CRC Press 出版社，1993。
[0077]發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性劑是通過將宿主細(xì)胞或者微生物在生物反應(yīng)器或者發(fā)酵罐內(nèi)的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)來進(jìn)行。選擇培養(yǎng)基的組成(例如營(yíng)養(yǎng)物、碳源等)、溫度和pH,以給培養(yǎng)物的生長(zhǎng)和/或生物表面活性劑的產(chǎn)生提供適當(dāng)?shù)臈l件。通常將空氣或者富氧空氣噴射到培養(yǎng)基中，以給培養(yǎng)物的呼吸供氧。
[0078]本發(fā)明涉及向培養(yǎng)液添加任何造成生物表面活性劑沉淀的物質(zhì)或者處理，從而使生物表面活性劑不可溶。具體地講，任何造成生物表面活性劑沉淀的物質(zhì)或者處理都可被本發(fā)明的方法采用。造成生物表面活性劑沉淀的物質(zhì)包括但不限于鹽、聚合物、酸、溶劑或者醇。造成生物表面活性劑沉淀的物理?xiàng)l件包括但不限于熱量的變化和PH的變化。技術(shù)人員會(huì)理解，造成生物表面活性劑沉淀的條件可包括沉淀劑、物理?xiàng)l件的改變或者這兩者的組合。
[0079]具體地講，本發(fā)明還涉及可通過本文描述的工藝生產(chǎn)的生物表面活性劑。例如，本文給出了通過改變發(fā)酵培養(yǎng)基和條件對(duì)常規(guī)的發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，以使所表達(dá)的疏水蛋白在發(fā)酵仍在進(jìn)行的同時(shí)在發(fā)酵液中變得不可溶，從而防止發(fā)酵過程中泡沫溢出。使用該改進(jìn)的發(fā)酵法生產(chǎn)的疏水蛋白的組成在圖2中給出，質(zhì)量7180處的峰對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)疏水蛋白分子。有趣的是，由本文給出的方法生產(chǎn)的疏水蛋白導(dǎo)致均勻的產(chǎn)品，這與通常為兩種變體的混合物的天然疏水蛋白不同。因此，本發(fā)明還涵蓋任何具有圖2中示出的圖譜的疏水蛋白。
[0080]有利地，沉淀劑是或者包括可由酸和堿的中和反應(yīng)產(chǎn)生的、由陽(yáng)離子和陰離子構(gòu)成的鹽一離子化合物，例如包含任何合適陰離子和任何合適陽(yáng)離子的離子化合物，所述陰離子例如鹵離子(例如氯離子、氟離子、溴離子或者碘離子)；檸檬酸根；乙酸根；硝酸根(或者硝酸鹽)、亞硝酸鹽、碳酸根；硫酸根；磷酸根；氨基磺酸根；膦酸根；或者氨基磺酸根；所述陽(yáng)離子例如銨、鈣、金屬或者過渡金屬如鋁、鐵、鎂、鋰、鉀或者鈉。鹽有利地包含多原子離子，更優(yōu)選包含硫酸鹽。鹽可以是或者包含硫酸銨、硫酸鈣、硫酸鐵、硫酸鎂、硫酸鉀或者硫酸鈉。在一個(gè)特別有利的實(shí)施例中，鹽是或者包含硫酸鈉。在另一個(gè)特別有利的實(shí)施例中，鹽是或者包含硫酸銨。在其他實(shí)施例中，鹽可以是乙酸鹽、碳酸鹽、氯鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、硝酸鹽或者磷酸鹽。
[0081]在另一個(gè)實(shí)施例中，沉淀劑是醇。醇可以是一元醇或者多元醇,如一元或者多元C1-C6醇，如甲醇、乙醇或者異丙醇。
[0082]在另一個(gè)實(shí)施例中，沉淀劑是水混溶性有機(jī)溶劑。溶劑可以是丙酮或者酮。
[0083]在另一個(gè)實(shí)施例中，沉淀劑是水溶性聚合物。聚合物可以是聚乙二醇或者多糖如葡聚糖。在另一個(gè)實(shí)施例中，沉淀劑是陽(yáng)離子聚合物，如但不限于C581(Cytec Industries公司，美國(guó)新澤西州伍德蘭帕克(Woodland Park, NJ07424))。
[0084]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，根據(jù)生物表面活性劑對(duì)培養(yǎng)液的pH進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，如果生物表面活性劑為疏水蛋白，則pH有利地為約4.0 ± 0.5。pH可在以下范圍:約 3.9±0.5 至約 4.1±0.5、約 3.8±0.5 至約 4.2±0.5、約 3.7±0.5 至約 4.3±0.5、約 3.6±0.5 至約 4.4±0.5、約 3.5±0.5 至約 4.5±0.5、約 3.4±0.5 至約 4.6±0.5、約 3.3±0.5 至約 4.7±0.5、約 3.2±0.5 至約 4.8±0.5、約 3.1±0.5 至約 4.9±0.5、約 3.0±0.5 至約 5.0±0.5、約 2.9±0.5 至約 5.1±0.5、約 2.8±0.5 至約 5.2±0.5、約 2.7±0.5 至約 5.3±0.5、約 2.6±0.5 至約 5.4±0.5、約 2.5±0.5 至約 5.5±0.5、約 2.4±0.5 至約 5.6±0.5、約 2.3±0.5 至約 5.7±0.5、約 2.2±0.5 至約 5.8±0.5、約2.1±0.5 至約 5.9±0.5 或者約 1.0±0.5 至約 6.0±0.5。
[0085]如果生物表面活性劑為鼠李糖脂或者槐糖脂，則pH有利地為約2.5±0.5。pH可在以下范圍:約2.4±0.5至約2.6±0.5、約2.3±0.5至約2.7±0.5、約2.2±0.5至約 2.8±0.5、約 2.1±0.5 至約 2.9±0.5、約 2.0±0.5 至約 3.0±0.5、約 1.9±0.5 至約 3.1±0.5、約 1.8±0.5 至約 3.2±0.5、約 1.7±0.5 至約 3.3±0.5、約 1.6±0.5 至約 3.4±0.5、約 1.5±0.5 至約 3.5±0.5、約 1.4±0.5 至約 3.6±0.5、約 1.3±0.5 至約 3.7±0.5、約 1.2±0.5 至約 3.8±0.5、約 1.1±0.5 至約 3.9±0.5、約 1.0±0.5 至約 4.0±0.5、約 0.9±0.5 至約 4.1±0.5、約 0.8±0.5 至約 4.2±0.5、約 0.7±0.5 至約4.3±0.5、約 0.6±0.5 至約 4.4±0.5 或者約 0.5±0.5 至約 4.5±0.5。
[0086]在另一個(gè)實(shí)施例中，其他表面活性劑的有利pH可為約pH7.0±0.5、約ρΗ7.1±0.5、約ρΗ7.2±0.5、約ρΗ7.3±0.5、約ρΗ7.4±0.5、約ρΗ7.5±0.5、約ρΗ7.6±0.5、約 ρΗ7.7±0.5、約 ρΗ7.8±0.5、約 ρΗ7.9±0.5、約 ρΗ8.0±0.5、約 ρΗ8.1±0.5、約ρΗ8.2±0.5、約ρΗ8.3±0.5、約ρΗ8.4±0.5、約ρΗ8.5±0.5、約ρΗ8.6±0.5、約ρΗ8.7±0.5、約 ρΗ8.8±0.5、約 ρΗ8.9±0.5、約 ρΗ9.0±0.5、約 ρΗ9.1±0.5、約 ρΗ9.2±0.5、約ρΗ9.3±0.5、約ρΗ9.4±0.5、約ρΗ9.5±0.5、約ρΗ9.6±0.5、約ρΗ9.7±0.5、約ρΗ9.8±0.5、約 ρΗ9.9±0.5、約 ρΗ10.0±0.5、約 ρΗ10.1±0.5、約 ρΗ10.2±0.5、約 ρΗ10.3±0.5、約 ρΗ10.4±0.5、約 ρΗ10.5±0.5、約 ρΗ10.6±0.5、約 ρΗ10.7±0.5、約 ρΗ10.8±0.5、約 ρΗΙΟ.9±0.5、約 ρΗ11.0±0.5、約 ρΗΙΙ.1±0.5、約 ρΗ11.2±0.5、約 ρΗ11.3±0.5、約 ρΗ11.4±0.5、約 ρΗ11.5±0.5、約 ρΗ11.6±0.5、約 ρΗΙΙ.7±0.5、約 ρΗ11.8±0.5、約 pHIL 9±0.5、約 ρΗ12.0±0.5、約 ρΗ12.1±0.5、約 ρΗ12.2±0.5、約 ρΗ12.3±0.5、約 ρΗ12.4±0.5、約 ρΗ12.5±0.5、約 ρΗ12.6±0.5、約 ρΗ12.7±0.5、約 ρΗ12.8±0.5、約 ρΗ12.9±0.5、約 ρΗ13.0±0.5、約 ρΗ13.1±0.5、約 ρΗ13.2±0.5、約 ρΗ13.3±0.5、約ρΗ13.4±0.5、約 ρΗ13.5±0.5、約 ρΗ13.6±0.5、約 ρΗ13.7±0.5、約 ρΗ13.8±0.5 或者約ρΗ13.9±0.5。
[0087]如前面提到，pH的調(diào)節(jié)不需包括卡拉膠，并且卡拉膠的任何使用不需包括pH調(diào)節(jié)，尤其是PH3.5或者3以下。而且，任何將離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)到0.5以下、或者0.4以下、或者
0.3以下、或者0.2以下不需包括將pH調(diào)節(jié)到3.5或者3以下和/或使用卡拉膠。導(dǎo)致降低pH的pH調(diào)節(jié)可通過添加酸如硫酸來實(shí)現(xiàn)。
[0088]沉淀劑，例如添加的鹽、醇、水混溶性有機(jī)溶劑或者水溶性聚合物或者陽(yáng)離子聚合物、和/或PH調(diào)節(jié)、和/或溫度調(diào)節(jié)和/或溫度提高的加入量或者pH調(diào)節(jié)量，要實(shí)現(xiàn)生物表面活性劑(例如疏水蛋白如疏水蛋白11)的充分沉淀或者不溶解化，有利地以避免使用消泡劑。也就是說，不溶解化對(duì)于泡沫控制是有利的。換句話說，不溶解化是作為控制泡沫的手段來進(jìn)行，而沉淀劑的量或者PH調(diào)節(jié)或者溫度調(diào)節(jié)的量要能造成一定量的不溶解化以控制發(fā)泡。而且，有利的是，沉淀劑的量或者PH調(diào)節(jié)或者溫度調(diào)節(jié)的量不會(huì)不利地影響細(xì)胞或者微生物生長(zhǎng)和/或生物表面活性劑的產(chǎn)生。
[0089]疏水蛋白的低溶解度的優(yōu)選pH范圍為約3.5-4.5。對(duì)于其他表面活性劑，pH范圍可能大不相同，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定優(yōu)選的pH范圍。
[0090]對(duì)于疏水蛋白，在3.5-4.5之間的pH范圍內(nèi)，硫酸銨或者硫酸鈉的所需濃度是溫度依賴性的。在約30°C至約60°C之間，優(yōu)選的濃度為約0.1%至約5%。在約30°C或者以下，硫酸鈉的濃度有利地在5%以上，直至該鹽的飽和極限，這對(duì)于硫酸鈉而言為約15%，對(duì)于硫酸銨而言為約30-50%，根據(jù)溫度而定。
[0091]同樣，對(duì)于其他生物表面活性劑，這些沉淀劑的溫度和濃度都可能大不相同，要通過實(shí)驗(yàn)對(duì)每一者進(jìn)行確定。
[0092]在其他有利的實(shí)`施例中，生物表面活性劑可以是鼠李糖脂、槐糖脂或者表面活性肽。有利地，鼠李糖脂可用氯化鈉、氯化鈣、硫酸鈉和/或陽(yáng)離子聚合物(如但不限于C581)進(jìn)行沉淀。有利地，槐糖脂可用氯化鈉、氯化鈣、硫酸鈉和/或陽(yáng)離子聚合物(如但不限于C581)進(jìn)行沉淀。有利地，表面活性肽可用氯化鈉、氯化鈣和/或硫酸鈉進(jìn)行沉淀。在另一個(gè)有利的實(shí)施例中，鼠李糖脂、槐糖脂和表面活性肽可在地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)和 / 或里氏木霉(Trichodermareseei)中擴(kuò)增。
[0093]疏水蛋白的無鹽、濃縮溶液(達(dá)80g/L或者以上)可單獨(dú)通過極高的溫度進(jìn)行沉淀以控制發(fā)泡。例如，80°C的溫度有效地破壞了在加熱到該溫度的過程中形成的任何泡沫，其中在該溫度下PH在約6-7之間。
[0094]疏水蛋白可用異丙醇在室溫下進(jìn)行沉淀。兩到三體積的異丙醇當(dāng)加到一體積的疏水蛋白水溶液時(shí)將使疏水蛋白沉淀。
[0095]在另一個(gè)實(shí)施例中，物理?xiàng)l件是溫度。
[0096]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，對(duì)培養(yǎng)液的溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)。根據(jù)生物表面活性劑和濃度而定，在這里溫度范圍可很大，可在約20°C至約90°C的范圍內(nèi)。對(duì)于疏水蛋白，溫度在30°C以上。對(duì)于鼠李糖脂、槐糖脂或者表面活性肽，溫度可為約20°C至約30°C。
[0097]有幾種方式測(cè)試泡沫控制的有效性。最容易的方式是檢查表面泡沫，看是否有總體積顯著減少的跡象。夾帶的空氣可用具有能記錄液體密度隨時(shí)間的變化的密度計(jì)的類似設(shè)備進(jìn)行測(cè)試。[0098]在一個(gè)有利的實(shí)施例中，泡沫控制的有效性可通過受試溶液的膨脹度進(jìn)行測(cè)量，膨脹度是一種計(jì)算值，涉及發(fā)泡溶液的體積減去起始體積再除以起始體積，以分?jǐn)?shù)或者百分?jǐn)?shù)報(bào)告。膨脹度為零意味著溶液不含泡沫。
[0099]也可采用泡沫減少指數(shù)作為用于控制泡沫的處理的有效性的度量。它是未處理的溶液與經(jīng)處理的溶液的膨脹度之比。
[0100]在另一個(gè)實(shí)施例中，泡沫減少的有效性也可以是測(cè)量生物表面活性劑的絕對(duì)和相對(duì)不溶性。如果生物表面活性劑至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或者95%不可溶，則可認(rèn)定泡沫減少有效。
[0101]如果少于0.lg/kg、0.5g/kg、lg/kg、2g/kg、3g/kg、4g/kg、5g/kg、6g/kg、7g/kg、8g/kg、9g/kg或者10g/kg的生物表面活性劑(以g測(cè)量)存在于溶液(以kg測(cè)量)中，則可認(rèn)定泡沫減少有效。
[0102]在一個(gè)有利的實(shí)施例中，如果生物表面活性劑至少約25%不可溶和/或如果不超過lg/kg的生物表面活性劑存在于上清液中，則可認(rèn)定泡沫減少有效。
[0103]在一個(gè)有利的實(shí)施例中，如果生物表面活性劑是蛋白質(zhì)，可通過測(cè)量沉淀物(不溶性)和上清液(可溶性)中該蛋白質(zhì)的量來定量該蛋白質(zhì)的不溶性?？赏ㄟ^定量沉淀物(不溶性)和上清液(可溶性)中的該蛋白質(zhì)，來確定絕對(duì)和相對(duì)不溶性。定量蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。
[0104]定量沉淀物中的和溶液中的非蛋白質(zhì)生物表面活性劑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0105]多重光散射耦合垂直掃描是最廣泛使用的監(jiān)測(cè)產(chǎn)品的分散狀態(tài)、從而鑒定和定量去穩(wěn)定化現(xiàn)象的技術(shù)[Roland 等人，《國(guó)際藥物雜志》(International Journalof Pharmaceutics), 263 (2003) 85-94 ；Lemarchand 等人，《藥物研究》(PharmaceuticalResearch)，20-8 (2003) 1284-1292 ；Mengual等人，《膠體與表面A:物理化學(xué)和工程方面》(Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects),152 (1999) 111 - 123 ；Bru等人，《顆粒尺寸測(cè)定與表征》(Particle sizing andcharacterisation), T.Provder和J.Texter編輯，(2004)]。它對(duì)任何沒有稀釋的濃縮分散體適用，包括泡沫在內(nèi)。當(dāng)使光線穿過樣品時(shí)，光線被氣泡反向散射。反向散射強(qiáng)度與分散相的尺寸和體積分?jǐn)?shù)成正比。因此，濃度的局部改變(排水、脫水收縮)和尺寸的全局改變(熟化、凝聚)被檢測(cè)出和監(jiān)測(cè)到。也可用電導(dǎo)率來監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)培養(yǎng)基成分的濃度以及監(jiān)測(cè)濁度。
[0106]來自本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)點(diǎn)是，生產(chǎn)生物表面活性劑的工藝可以是連續(xù)的。例如，在本發(fā)明的實(shí)施中，生物反應(yīng)器或者發(fā)酵罐可具有用于移除溶解的生物表面活性劑(例如疏水蛋白)的裝置，例如閥門控制的流體管道，由該流體管道可從生物反應(yīng)器或者發(fā)酵罐移除溶解的生物表面活性劑。閥門可與用于打開和關(guān)閉閥門的處理器或者微處理器相連而被操作。處理器或者微處理器可從傳感器接收信號(hào)，如指示生物表面活性劑在溶液中的濃度或其變化或者溶液的濁度或者別的參數(shù)(如泡沫的量)的傳感器，并且基于該傳感器信號(hào)，處理器或者微處理器可指示閥門的打開或者關(guān)閉以移除溶解的生物表面活性劑；或者處理器或者微處理器可基于其他參數(shù)促使閥門打開或者關(guān)閉，所述其他參數(shù)例如添加或者施加沉淀劑和/或沉淀?xiàng)l件的開始時(shí)間，沉淀劑濃度的達(dá)到和/或沉淀?xiàng)l件的達(dá)到，包括在一段時(shí)間內(nèi)。生物反應(yīng)器或者發(fā)酵罐還可包括用于添加沉淀劑或者流體或者其他條件以達(dá)到沉淀?xiàng)l件的裝置，所述裝置例如是閥門控制的流體管道，通過該流體管道可添加沉淀劑，例如鹽(有利地在溶液中)、醇、或者能實(shí)現(xiàn)沉淀?xiàng)l件的流體(例如用于降低pH的酸)，或者所述裝置是加熱器。閥門或者加熱器可與用于打開和關(guān)閉閥門或者加熱器的處理器或者微處理器相連。處理器或者微處理器可從傳感器接收信號(hào)，如指示生物表面活性劑在溶液中的濃度或其變化或者別的參數(shù)(如泡沫)的傳感器，并且基于該傳感器信號(hào)，處理器或者微處理器可指示閥門或者加熱器的打開或者關(guān)閉以添加沉淀劑或者流體或者其他造成溶解(solubilization)的手段；或者處理器或者微處理器可基于其他參數(shù)促使閥門打開或者關(guān)閉，所述其他參數(shù)例如移除溶解的生物表面活性劑的開始時(shí)間。此外，生物反應(yīng)器或者發(fā)酵罐可包括用于添加生產(chǎn)生物表面活性劑的培養(yǎng)基和/或細(xì)胞或者微生物或者培養(yǎng)基的其他成分的裝置。在移除溶解的生物表面活性劑時(shí)不可避免的是，一些生產(chǎn)生物表面活性劑的培養(yǎng)基和/或細(xì)胞或者微生物或者培養(yǎng)基的其他成分將隨該溶解的表面活性劑一起失去，因此生物反應(yīng)器或者發(fā)酵罐包括補(bǔ)充裝置。這個(gè)補(bǔ)充裝置可例如是閥門控制的流體連接裝置，細(xì)胞或者生物體或者培養(yǎng)基或者培養(yǎng)基的其他成分從這個(gè)流體連接裝置被輸送到生物反應(yīng)器或者發(fā)酵罐。閥門可與用于打開和關(guān)閉閥門的處理器或者微處理器連接。處理器或者微處理器可從傳感器接收信號(hào)，如指示細(xì)胞或者微生物或者培養(yǎng)基的其他成分的濃度或其變化或者溶液的濁度或者別的參數(shù)的傳感器，并且基于該傳感器信號(hào)，處理器或者微處理器可指示閥門的打開或者關(guān)閉以進(jìn)行補(bǔ)充；或者處理器或者微處理器可基于其他參數(shù)(如時(shí)間)促使閥門打開或者關(guān)閉。當(dāng)細(xì)胞、微生物或者培養(yǎng)基或者培養(yǎng)基的成分隨溶解的表面活性劑一起收獲時(shí)，可將該細(xì)胞、微生物或者培養(yǎng)基或者培養(yǎng)基的成分與該溶解的生物表面活性劑分離，并例如通過補(bǔ)充裝置循環(huán)回到發(fā)酵罐或者生物反應(yīng)器。前面所述的傳感器可以是生物反應(yīng)器或者發(fā)酵罐中的或者與生物反應(yīng)器或者發(fā)酵罐連接的一個(gè)或者多個(gè)傳感器。
[0107]這樣， 將用于生產(chǎn)和能生產(chǎn)生物表面活性劑(例如疏水蛋白如疏水蛋白I1、鼠李糖月旨、槐糖脂或者表面活性肽)的培養(yǎng)基輸送到生物反應(yīng)器或者發(fā)酵罐，隨著發(fā)泡發(fā)生或者正在發(fā)生或者在它顯著發(fā)生之前或者在培養(yǎng)基在生物反應(yīng)器或者發(fā)酵罐中一段時(shí)間后，添加或者施加沉淀劑或者沉淀?xiàng)l件，例如添加硫酸鈉和/或添加醇和/或施加熱量和/或調(diào)節(jié)PH (有利地向下調(diào)節(jié))，由此泡沫得到控制，生物表面活性劑發(fā)生沉淀或者不溶解化。將不溶解化的生物表面活性劑從生物反應(yīng)器或者發(fā)酵罐移除。并將培養(yǎng)基或其成分例如細(xì)胞或者微生物、營(yíng)養(yǎng)物、或者培養(yǎng)基的其他成分輸送到生物反應(yīng)器或者發(fā)酵罐中，即培養(yǎng)基或其成分例如細(xì)胞或者微生物、營(yíng)養(yǎng)物、或者培養(yǎng)基的其他成分得到補(bǔ)充。任選地，將隨不溶解化的生物表面活性劑一起分離的培養(yǎng)基或其成分例如細(xì)胞或者微生物、營(yíng)養(yǎng)物、或者培養(yǎng)基的其他成分循環(huán)回到生物反應(yīng)器或者發(fā)酵罐。這樣可以連續(xù)生產(chǎn)生物表面活性劑。
[0108]該方法可在反應(yīng)器例如生物反應(yīng)器中進(jìn)行。本文所用的“生物反應(yīng)器”指任何制造的或者設(shè)計(jì)的能夠支撐生物活性環(huán)境的裝置或者系統(tǒng)。例如，生物反應(yīng)器可包括其中進(jìn)行一個(gè)或者多個(gè)化學(xué)和/或生物過程的容器。在一些實(shí)施例中，這些過程涉及生物體或者衍生自這種生物體的生化活性物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，生物體或者細(xì)胞可在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)。在一些實(shí)施例中，生物體可在使用過程中懸浮或者固定在反應(yīng)器中。
[0109]隨這個(gè)方法使用的反應(yīng)器可包括但不限于批式反應(yīng)器、補(bǔ)料分批反應(yīng)器、連續(xù)反應(yīng)器如連續(xù)攪拌的罐式反應(yīng)器、移動(dòng)培養(yǎng)基、填充床、纖維床、膜反應(yīng)器或者本領(lǐng)域已知的或者有待發(fā)現(xiàn)的任何其他系統(tǒng)。
[0110]在一些實(shí)施例中，連續(xù)反應(yīng)器的使用可以將物料連續(xù)泵送經(jīng)過反應(yīng)器。所泵送的物料的流動(dòng)可以促進(jìn)混合。在一些實(shí)施例中，可在反應(yīng)器中使用靜態(tài)混合器如擋板和/或機(jī)械攪拌，以促進(jìn)各組分的混合。
[0111]在一些實(shí)施例中，該方法可用生物反應(yīng)器進(jìn)行。細(xì)胞和培養(yǎng)基可通過輸入部件提供到生物反應(yīng)器，輸入部件包括但不限于端口、輸送管、管道、軟管和/或本領(lǐng)域知道的任何其他輸入裝置?？墒褂枚鄠€(gè)輸入部件來將細(xì)胞、培養(yǎng)基和/或營(yíng)養(yǎng)物提供到反應(yīng)器。
[0112]可利用包括一個(gè)或者多個(gè)傳感器以及一個(gè)或者多個(gè)控制器的控制系統(tǒng)來控制反應(yīng)器內(nèi)的條件?？刂破骺砂ǖ幌抻谔幚砥鳌⑽⑻幚砥骰蛘弑绢I(lǐng)域知道的其他控制器。用來控制反應(yīng)器條件的信息可從一個(gè)或者多個(gè)傳感器和/或從使用者提供到控制器。
[0113]傳感器可用來測(cè)量反應(yīng)器內(nèi)的條件，包括但不限于溫度、pH、組成、泡沫的存在、泡沫的量、壓力、沉淀物的存在、沉淀物的量和/或本領(lǐng)域知道的任何其他相關(guān)測(cè)量項(xiàng)目。多個(gè)傳感器可設(shè)置在反應(yīng)器周圍，以測(cè)定特定位置的條件。例如，在一些實(shí)施例中可將用來測(cè)定沉淀物的量或者存在的傳感器設(shè)置為接近反應(yīng)器的底部。各實(shí)施例可包括接近輸入部件開口、罐內(nèi)各種位置和/或任何目的位置的，用于測(cè)定泡沫的存在的傳感器?？墒褂帽绢I(lǐng)域知道的任何傳感器。
[0114]一些實(shí)施例可包括罐中的窗口或者開口以便觀察。一些反應(yīng)器可包括設(shè)置在反應(yīng)器中的燈以便觀察反應(yīng)器內(nèi)的條件。操作者可以能夠觀察罐中的條件并將數(shù)據(jù)輸入到與一個(gè)或者多個(gè)控制器連接的用戶界面中，以調(diào)節(jié)罐內(nèi)的條件。
[0115]例如，基于來自傳感器和/或使用者輸入部件的數(shù)據(jù)，可根據(jù)反應(yīng)器中的需要打開或者關(guān)閉閥門。在一些實(shí)施例中，輸入部件上的閥門可控制營(yíng)養(yǎng)物、緩沖劑、培養(yǎng)基、生物體和/或其他組分的添加。
[0116]一些實(shí)施例可包括讓細(xì)胞在反應(yīng)器的內(nèi)室中生長(zhǎng)。可將營(yíng)養(yǎng)物、培養(yǎng)基和細(xì)胞以足以優(yōu)化目的生物體的生長(zhǎng)的比例加入到反應(yīng)器。在一些實(shí)施例中，控制所添加的物料的組成以優(yōu)化目的組分的生產(chǎn)。例如，目的組分可以是蛋白質(zhì)或者化合物。
[0117]在一些實(shí)施例中，隨著目的組分的濃度提高，發(fā)泡可能開始出現(xiàn)?？衫么翱诤?或傳感器來檢測(cè)反應(yīng)器中的發(fā)泡。例如，可使用傳感器或者窗口來確定是否出現(xiàn)發(fā)泡。一旦檢測(cè)到發(fā)泡，控制器可指示添加沉淀劑到反應(yīng)器。在一些實(shí)施例中，沉淀劑可讓目的組分從溶液中沉淀出來。沉淀的組分可積累在反應(yīng)器的底部。
[0118]一些實(shí)施例可包括一個(gè)或者多個(gè)設(shè)置為接近反應(yīng)器底部的傳感器，以測(cè)定是否存在沉淀物和/或存在的沉淀物的量。這些傳感器可與一個(gè)或者多個(gè)控制器通訊。控制器可使用這個(gè)輸入來確定打開接近反應(yīng)器底部的閥門，從而沉淀物排出反應(yīng)器。
[0119]在一些實(shí)施例中，可利用輸入部件和輸出部件上的泵來促進(jìn)物料在輸入部件和輸出部件中的移動(dòng)。
[0120]如圖3中所示，一些實(shí)施例可包括利用反應(yīng)器100進(jìn)行該方法。細(xì)胞、培養(yǎng)基和/或營(yíng)養(yǎng)物可通過輸入部件102提供到反應(yīng)器100。如圖3中所示，輸入部件102可包括用來控制生物體和/或培養(yǎng)基向容器的遞送的閥門104。在一些實(shí)施例中，可利用多個(gè)輸入部件來將生物體和/或培養(yǎng)基遞送到反應(yīng)器的不同位置。在一些實(shí)施例中，如圖3中所示，細(xì)胞和培養(yǎng)基通過輸入部件102提供。多個(gè)傳感器106可設(shè)置在反應(yīng)器100的各個(gè)位置。傳感器106給控制器108，110提供數(shù)據(jù)?？刂破?08，110能夠控制細(xì)胞、培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)物、沉淀劑和/或其他組分的量。在一些實(shí)施例中，控制器可作出調(diào)整以控制反應(yīng)器、輸入部件和/或輸出部件中的條件。
[0121]一些實(shí)施例可包括讓細(xì)胞在反應(yīng)器的內(nèi)室中生長(zhǎng)。隨著目的組分的濃度提高，發(fā)泡可能開始出現(xiàn)。在一些實(shí)施例中，可利用窗口和/或傳感器來檢測(cè)反應(yīng)器中的發(fā)泡。一旦檢測(cè)到發(fā)泡，可向反應(yīng)器添加沉淀劑。在一些實(shí)施例中，沉淀劑可讓目的組分從溶液中沉淀出來。沉淀的組分可用傳感器106檢測(cè)。在一些實(shí)施例中，反應(yīng)器100中存在窗口 116以讓使用者觀察反應(yīng)器中的條件。
[0122]控制器108連接到出口閥門112?？刂破?10可指示閥門112打開以讓沉淀物通過輸出部件114離開罐。在一些實(shí)施例中，使用者的輸入可讓控制器指示閥門112按需打開和/或關(guān)閉。
[0123]如圖3中所示，可使用輸入部件118向反應(yīng)器提供營(yíng)養(yǎng)物，包括但不限于空氣、氧氣或者本領(lǐng)域知道的任何其他營(yíng)養(yǎng)物。輸入部件118可連接到遞送裝置120以將營(yíng)養(yǎng)物提供到反應(yīng)器100。在一些實(shí)施例中，遞送裝置可設(shè)置在反應(yīng)器中的任何位置。一些實(shí)施例包括混合器122以促進(jìn)反應(yīng)器中各組分的混合。
[0124]雖然已詳細(xì)描述的本發(fā)明及其優(yōu)點(diǎn)，但應(yīng)理解，可在不偏離所附權(quán)利要求書中所限定的本發(fā)明精神和范圍的前提下，在這里作出各種變化、替換和變更。
[0125]以下實(shí)例將進(jìn)一步說明本發(fā)明，這些實(shí)例僅為說明的目的給出，并不旨在以任何方式限制本發(fā)明。
[0126]SM
[0127]實(shí)例1:澄清的未純化的疏水蛋白溶液
[0128]這里給出一種采用硫酸鈉和pH調(diào)節(jié)來減少澄清的疏水蛋白溶液中的泡沫形成的方法。疏水蛋白溶液采用常規(guī)的生產(chǎn)方法獲得。疏水蛋白溶液的濃度為33g/kg。硫酸鈉處理是通過加入無水硫酸鈉至達(dá)到2.5%w/w的最終濃度，伴以輕輕混合讓其溶解來實(shí)現(xiàn)。使用1%硫酸將pH調(diào)節(jié)至4.0。將溶液在10°C下混合16小時(shí)。將2X5mL的經(jīng)Na2S04處理的濃縮物離心以除去液體部分。將每個(gè)沉淀物在水中重懸至與初始疏水蛋白濃縮物相同的體積。使用抹刀使沉淀物松開并重懸。制備2X5mL的未經(jīng)處理的疏水蛋白濃縮物。將濃縮物之一和Na2SO4處理的濃縮物之一進(jìn)行振動(dòng)混合。
[0129]立即和在4小時(shí)后，拍照片并記錄每個(gè)管子的總體積。結(jié)果在表1中給出。經(jīng)硫酸鈉處理的溶液的可溶性疏水蛋白濃度為lg/L。在加入硫酸鈉后，97%的疏水蛋白不可溶。
[0130]表1
[0131]
I初始體積混合后體積保持膨賬度保持 I
(iiiL)(mL)(%)
處理O小時(shí)后 4小時(shí)后 O小時(shí)后 4小時(shí)后
^51414180% 130%"""
經(jīng)硫酸鈉處理I 56.56.5 30% 30% |
泡沫減少指數(shù)ω6.0[0132]實(shí)例2:純化的疏水蛋白溶液
[0133]這里給出一種使用熱量來減少疏水蛋白溶液的泡沫形成的方法。疏水蛋白溶液的濃度為130g/kg。當(dāng)在500mL Pyrex中混合320g的疏水蛋白溶液時(shí)，泡沫充滿瓶子的頂部空間(圖1左邊的照片)。當(dāng)將另一個(gè)經(jīng)類似混合的疏水蛋白溶液加熱到80°C時(shí)，沉淀物形成，泡沫崩潰(圖1右邊的照片)。結(jié)果在表2中給出。
[0134]轟^
【權(quán)利要求】
1.一種控制生物表面活性劑的發(fā)泡的方法，所述生物表面活性劑在以下情況下發(fā)泡:在發(fā)酵培養(yǎng)基中通過宿主細(xì)胞生產(chǎn)所述生物表面活性劑期間，當(dāng)所述宿主細(xì)胞胞外分泌所述生物表面活性劑并且所述生物表面活性劑可溶于所述發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)；所述方法包括在通過所述宿主細(xì)胞生產(chǎn)所述生物表面活性劑的同時(shí)使所述生物表面活性劑不溶解化，由此發(fā)泡受到控制，因?yàn)樗霾蝗芙饣纳锉砻婊钚詣┎粫?huì)發(fā)泡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物表面活性劑包含疏水蛋白I1、鼠李糖脂、槐糖脂或者表面活性肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中泡沫減少指數(shù)大于I，和/或泡沫減少指數(shù)大于2，和/或泡沫減少指數(shù)大于3 ;和/或所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的可溶性生物表面活性劑的濃度至多約lg/kg ;和/或至少25%的所生產(chǎn)的生物表面活性劑被不溶解化；和/或所述方法在不添加消泡劑的情況下進(jìn)行；和/或與不加以不溶解化而進(jìn)行的方法相比，所述方法用減低量的消泡劑來進(jìn)行；和/或所述方法通過加入沉淀劑和/或施加沉淀?xiàng)l件來進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法是一種連續(xù)工藝，包括:向生物反應(yīng)器輸入發(fā)酵培養(yǎng)基，加入沉淀劑或者施加沉淀?xiàng)l件，收集不溶解化的生物表面活性劑，并補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)基或其成分或者宿主細(xì)胞；任選地，將與不溶解化的生物表面活性劑一起被收集的任何發(fā)酵培養(yǎng)基或其成分或者宿主細(xì)胞進(jìn)行再循環(huán)。
5.—種控制生物表面活性劑的發(fā)泡的方法,所述生物表面活性劑在以下情況下發(fā)泡:在發(fā)酵培養(yǎng)基中通過宿主細(xì)胞生產(chǎn)所述生物表面活性劑期間，當(dāng)所述宿主細(xì)胞胞外分泌所述生物表面活性劑并且所述生物表面活性劑可溶于所述發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)；所述方法包括在通過所述宿主細(xì)胞生產(chǎn)所述生物表面活性劑的同時(shí)使所述生物表面活性劑不溶解化，由此發(fā)泡受到控制，因?yàn)樗霾蝗芙饣纳锉砻婊钚詣┎粫?huì)發(fā)泡，其中泡沫減少指數(shù)大于1，和/或泡沫減少指數(shù)大于2，和/或泡沫減少指數(shù)大于3 ;和/或所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的可溶性生物表面活性劑的濃度至多約lg/kg ;和/或至少25%的所生產(chǎn)的生物表面活性劑被不溶解化；和/或所述方法在不添加消泡劑的情況下進(jìn)行；和/或與不對(duì)所述生物表面活性劑加以不溶解化而進(jìn)行的方`法相比，所述方法用減低量的消泡劑來進(jìn)行；和/或所述方法通過加入沉淀劑和/或施加沉淀?xiàng)l件來進(jìn)行。
6.一種控制在生產(chǎn)過程中發(fā)泡的生物表面活性劑在溶液中的發(fā)泡的方法，所述方法包括: 在所述生物表面活性劑的生產(chǎn)過程中，在條件能引起泡沫形成的時(shí)候，與此同時(shí)將所述生物表面活性劑進(jìn)行不溶解化，由此發(fā)泡受到控制，因?yàn)樗霾蝗芙饣纳锉砻婊钚詣┎粫?huì)發(fā)泡。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述溶液包含發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述生產(chǎn)包括在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中通過宿主細(xì)胞表達(dá)所述生物表面活性劑，并且其中所述宿主細(xì)胞胞外分泌所述生物表面活性劑且所述生物表面活性劑可溶于所述發(fā)酵培養(yǎng)基，由此,條件能引起泡沫形成。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述方法是一種連續(xù)工藝，包括: 向生物反應(yīng)器輸入發(fā)酵培養(yǎng)基； 加入沉淀劑或者施加沉淀?xiàng)l件； 收集不溶解化的生物表面活性劑；以及補(bǔ)充溶液或其成分或者宿主細(xì)胞；任選地，將與不溶解化的生物表面活性劑一起被收集的任何溶液或其成分或者宿主細(xì)胞進(jìn)行再循環(huán)。
9.一種控制在生產(chǎn)過程中發(fā)泡的生物表面活性劑的發(fā)泡的方法，所述方法包括: 在通過宿主細(xì)胞在溶液中生產(chǎn)所述生物表面活性劑的同時(shí)，使所述生物表面活性劑不溶解化， 控制發(fā)泡，使得: 泡沫減少指數(shù)大于1，和/或泡沫減少指數(shù)大于2，和/或泡沫減少指數(shù)大于3 ;和/或 所述溶液中的可溶性生物表面活性劑的濃度至多約lg/kg ;和/或 至少25%的所生產(chǎn)的生物表面活性劑被不溶解化；和/或 所述方法在不添加消泡劑的情況下進(jìn)行；和/或 與不加以不溶解化而進(jìn)行的方法相比，所述方法用減低量的消泡劑來進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、5、6或者9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物表面活性劑包含疏水蛋白I1、鼠李糖脂、槐糖脂或者表面活性肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求1、5、6或者9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是里氏木霉。
12.根據(jù)權(quán)利要求1、5、6或者9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌。
13.根據(jù)權(quán)利要求1、5、6或者9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是地衣芽孢桿菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求1、5、6或者9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是曲霉屬的種。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103492552SQ201280016434
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月29日
【發(fā)明者】M·H·恒, M·波多 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司