專利名稱：一株重組大腸桿菌及用該菌株制備磷脂酶A₁的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株重組大腸桿菌及用該菌株進(jìn)行自誘導(dǎo)發(fā)酵來制備磷脂酶A1的方法。
背景技術(shù)：
磷脂酶A1 (PhospholipaseA1, EC 3.1.1.32,簡稱PLA1)屬于水解酶,可專一水解天然磷脂Sn-1位?；?，得到Sn-2?；苎字陀坞x脂肪酸。磷脂酶A1是一種優(yōu)良的表面活性劑，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料和皮革等領(lǐng)域；此外，磷脂酶4還可應(yīng)用于植物油脫膠，同傳統(tǒng)脫膠方法相比，磷脂酶A1脫膠這種新型脫膠方法具有反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，近年來已在油脂精煉行業(yè)得到大規(guī)模推廣。經(jīng)證實(shí)，許多動(dòng)物的細(xì)胞、組織和毒液含有少量的磷脂酶4。磷脂酶A1的傳統(tǒng)來源為動(dòng)物胰液，但該來源提取量有限且價(jià)格昂貴，已于近幾年逐漸被淘汰，取而代之的是從微生物中提取，但提取自微生物的磷脂酶A1大多與細(xì)胞膜結(jié)合，難以進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，因此，研究磷脂酶A1基因在工程菌中的克隆表達(dá)并努力提高其產(chǎn)量成為近年來的主要研究方向。國內(nèi)外利用微生物產(chǎn)磷脂酶A1的起步較晚，且產(chǎn)量普遍較低:1988年，MichaelGivskova等從液化沙 雷氏菌中提取磷脂酶A1基因在大腸桿菌克隆和表達(dá)，其酶活不到IU/ml (Givskov M, Molin S.Secretion of Serratia liquefaciens phospholipase fromEseherichia.coli [J].Mol.Microbiol, 1993 (8):229-42.) ；2000 年，M.Hartmann 等使用隨機(jī)化學(xué)突變、單細(xì)胞融合以及基因雜交技術(shù)，篩選出4株嗜熱四膜蟲屬突變株，其酶活最高達(dá)至丨J 35.2 + 2.60U/ml (Hartmann M, etal.Screening forand charaeterizationofphospholipase A1 hypersecretory mutants of Tetrahymena thermophila[J].Appl.Microbiol.Biotechnol，2000 (54):390-396) ；2008年，國內(nèi)付建紅等從新疆天山一號(hào)冰川凍土中篩選到一株產(chǎn)低溫堿性磷脂酶A1的菌株xjFl，初步優(yōu)化后，酶活力最高達(dá)17.5U/ml(付建紅，唐輝桂，姚斌，等.一株產(chǎn)低溫堿性磷脂酶A1耐冷細(xì)菌的篩選及發(fā)酵條件的初步研究.工業(yè)微生物2008.38:12-16.)。目前商品化的磷脂酶A1產(chǎn)品僅有丹麥諾維信公司的Lecitase Novo (Novozymes A/S),其是通過蛋白質(zhì)修飾技術(shù)由來源于嗜熱絲胞菌的脂肪酶改性而來。因此，尋找更加優(yōu)良的磷脂酶A1基因并在工程菌中進(jìn)行克隆表達(dá)以期提高其表達(dá)水平是亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一株重組大腸桿菌及用該菌株制備磷脂酶A1的方法。利用該菌株通過液體發(fā)酵制備磷脂酶A1，具有產(chǎn)酶量和酶活性高、生產(chǎn)工藝簡單、成本低、易于工藝放大等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一株重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)/pET-pla，保藏編號(hào)為 CCTCCM 2012423，該重組大腸桿菌包含一段來源于液化沙雷氏菌CICCN0.21538的pla基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。其進(jìn)一步的技術(shù)方案為:所述重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla，CCTCC N0.M 2012423由下述方法制得:(I)以所述液化沙雷氏菌CICC N0.21538的基因組為模板，克隆得到所述pla基因；(2)將步驟(I)所得pla基因克隆到表達(dá)載體pET-28a ( + )上，得到重組載體pET-pla ；(3)將步驟(2)所得重組載體pET-pla轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建得到能表達(dá)磷脂酶A1的重組大腸桿菌。本發(fā)明還提供了一種用上述重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET_pla，CCTCC N0.M2012423制備磷脂酶A1的方法，是以該重組大腸桿菌為發(fā)酵菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，制備磷脂酶
A1O具體步驟如下:(I)種子培養(yǎng):將經(jīng)過斜面培養(yǎng)的所述重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET_pla，CCTCCN0.M 2012423單菌落接種于種子培養(yǎng)基，于35 37°C振蕩培養(yǎng)5 7h，搖床轉(zhuǎn)速180 200r/min ；(2)自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng):將上述種子培養(yǎng)所得活化種子液按體積百分比I 4%的接種量接種至自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基，于3`5 37°C振蕩培養(yǎng)3 5h小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速180 200r/min ;再向所述自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加其總重量0.5 2%的甘氨酸和曲拉通，繼續(xù)培養(yǎng)12 14h ;發(fā)酵完畢，得到發(fā)酵液；(3)粗酶液的提取:將上述發(fā)酵液離心，收集上清液，即得含磷脂酶A1的粗酶液。其進(jìn)一步的技術(shù)方案為:步驟(I)所述斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分以IL計(jì)為:蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖8g，氯化鈉1，其余成分為水，調(diào)節(jié)pH值至7.4 ;所述種子培養(yǎng)基成分以IL計(jì)為:蛋白胨10g，酵母粉 5g，葡萄糖 8g，Na2HPO4 25mM, KH2PO4 25mM, NH4Cl 50mM, Na2SO4 5mM, MgSO4 2mM，其余成分為水；上述種子培養(yǎng)基還包括終濃度為100μ g/ml的卡那霉素。步驟(2)所述自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基成分以IL計(jì)為:蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖
0.5g,乳糖 2g,甘油 5g, Na2HPO4 25mM, KH2PO4 25mM, NH4Cl 50mM, Na2SO4 5mM, MgSO4 2mM,FeCl3 50 μ M, CaCl2 20 μ M，其余成分為水。磷脂酶A1酶活測定方法如下:采用改良NaOH 滴定法(Sheelu 等，J Am Oil Chem Soc 85:739-748，2008)。將 4g已乳化的大豆卵磷脂溶于100ml 50mM的磷酸緩沖液(pH 7.0)，取20ml該溶液和稀釋5倍的粗酶液在轉(zhuǎn)速為180r/min的恒溫震蕩水浴鍋中于50°C預(yù)熱10分鐘；取200 μ L已稀釋的粗酶液加入上述反應(yīng)體系中精確反應(yīng)10分鐘，立即補(bǔ)加15ml的95%乙醇終止反應(yīng)。用已標(biāo)定的30mmol/L NaOH溶液滴定上述粗酶液中磷脂酶A1所釋放的游離脂肪酸，取pH8.2為滴定終點(diǎn)；磷脂酶A1酶活力定義為:在上述反應(yīng)條件下，每分鐘釋放I μ mol的游離脂肪酸的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。本發(fā)明所提供的重組大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET_pla,已于2012年10月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào):CCTCC NO:M 2012423，地址:中國，武漢，武漢大學(xué)。該菌株以下簡稱:重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla CCTCCM 2012423。本發(fā)明的有益技術(shù)效果如下:本發(fā)明成功構(gòu)建了一株磷脂酶A1基因來源于液化沙雷氏菌CICC N0.21538的基因重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla CCTCC M 2012423，分析結(jié)果表明，該重組大腸桿菌所包含的磷脂酶A1基因(pla基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)與GenBank編號(hào)X66505.1的磷脂酶A1基因的序列同源性較低，為76.4%，拓寬了磷脂酶A1的基因來源；以該重組大腸桿菌為發(fā)酵菌株并通過本發(fā)明方法制備磷脂酶A1,產(chǎn)酶量高，經(jīng)檢測胞外酶活性最高可達(dá)137.6U/ml ;本發(fā)明方法生產(chǎn)工藝簡單、生產(chǎn)周期短、成本低、易于工藝放大，在油脂精煉、磷脂改性等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
做進(jìn)一步的描述，以下實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。以下實(shí)施例所涉及實(shí)驗(yàn)材料如下:大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109和E.coliBL21 (DE3)購自寶生物工程(大連)有限公司；液化沙雷氏菌購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)，保藏編號(hào)為=CICC N0.21538 ；pMD18T-simple Vector、T4DNA連接酶和 10XT4連接酶Buffer購自寶生物工程(大連)有限公司；pET_28a ( + )購自Novagen ;限制性內(nèi)切酶 EcoR1、Hind III 以及共用 Buffer 購自 Fermentas。其他原料和試劑均為市售國產(chǎn)或進(jìn)口分析純產(chǎn)品。實(shí)施例1憐脂 酶A1基因的克隆根據(jù)NCBI GenBank:X66505.1的基因序列設(shè)計(jì)引物，其中，上游引物為:5' -CGGAATTCAGTATGTCTTTGAGTTTTACCTCTGC~3/ (下劃線表示 EcoR I 酶切位點(diǎn))，下游引物為:5’ -CCAAGCTTCGTTACTGCTGTCCGTATTGC-3'(下劃線表示 Hind III酶切位點(diǎn))。以保藏編號(hào)為CICC N0.21538的液化沙雷氏菌基因組DNA為模板，運(yùn)用PCR的方法(引物如上所述)克隆得到磷脂酶A1基因pla，并與載體pMDlST-simple連接得到克隆載體pMD-pla，將該克隆載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109，挑選陽性克隆，測序驗(yàn)證，其堿基序列如SEQ ID N0:1所示，結(jié)果表明磷脂酶A1基因克隆成功。序列分析顯示，該基因序列與GenBank編號(hào)X66505.1的磷脂酶A1基因序列同源性較低，為76.4%。實(shí)施例2重組載體pET-pla的構(gòu)建用EcoR I和Hind III對(duì)重組載體pMD-pla和表達(dá)載體pET_28a ( + )進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系為 50 μ L:載體 20 μ L、酶反應(yīng) Buffer 5 μ L,EcoR I 2.5 μ L、Hind III 2.5 μ L，補(bǔ)充雙蒸去離子水至50yL，37°C反應(yīng)2小時(shí)?；厥彰盖泻蟮哪康幕蚝洼d體DNA，并用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系IOyL:目的基因2 μ L、載體DNA I μ L、10X Τ4連接酶Buffer I μ L、T4DNA連接酶I μ L，雙蒸去離子水5 μ L，于16°C反應(yīng)12小時(shí)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109，轉(zhuǎn)化方法如下:(I)取 E.coli JM109 100 μ L 置于無菌1.5ml EP 管中；(2)加入上述連接產(chǎn)物并輕輕混勻；
(3)將上述EP管置于42°C金屬浴，精確計(jì)時(shí)90s，勿搖動(dòng)EP管；(4)轉(zhuǎn)移EP管至冰浴中，冷卻5 IOmin ；(5)每管加入無菌SOC培養(yǎng)基800 μ L，置于37°C培養(yǎng)箱復(fù)蘇Ih ；(6)以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min，吸去800 μ L上清培養(yǎng)基，用移液槍輕輕吹吸剩余培養(yǎng)基和細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至含終濃度50 μ g/ml卡那霉素的LB固體平板，涂勻并于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 24h ；(7)挑取陽性克隆，并經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切驗(yàn)證。實(shí)施例3 重組大腸桿菌 BL21 (DE3) /pET-pla CCTCC M 2012423 的構(gòu)建將構(gòu)建好的重組載體pET-pla轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，轉(zhuǎn)化方法如下:(I)取 E.coli BL21 (DE3) 100 μ L 置于無菌1.5ml 的 EP 管中；(2)加入上述重組質(zhì)粒pET-pla并輕輕混勻；(3)將上述EP管置于42°C金屬浴，精確計(jì)時(shí)90s，勿搖動(dòng)EP管；(4)轉(zhuǎn)移EP管于冰浴中，冷卻5 IOmin ；(5)每管加入無菌SOC培養(yǎng)基800 μ L，置于37°C培養(yǎng)箱復(fù)蘇Ih ；(6)以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min，吸去800 μ L上清培養(yǎng)基，用移液槍輕輕吹吸剩余培養(yǎng)基和細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至含終濃度50 μ g/ml卡那霉素的LB固體平板，涂勻并于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 24小時(shí)；(7)挑取轉(zhuǎn)化子，經(jīng)EcoR I和Hindm酶切驗(yàn)證重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-pla構(gòu)建成功，與等體積的30 %甘油混勻，于-70 0C保藏。用重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla CCTCC M 2012423通過自誘導(dǎo)發(fā)酵制備磷脂酶A1實(shí)施例4 實(shí)施例8所述斜面培養(yǎng)方法如下:將上述甘油保藏的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET-pla CCTCC M 2012423劃線接種于斜面培養(yǎng)基，于37°C培養(yǎng)12h ;上述斜面培養(yǎng)基成分以IL計(jì)為:蛋白胨IOg,酵母粉5g,葡萄糖8g,氯化鈉I,其余成分為水,調(diào)節(jié)pH值至7.4,于IX IO5Pa高壓下滅菌20min。所述種子培養(yǎng)基成分以IL計(jì)為:蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖8g，Na2HP0425mM,KH2PO4 25mM, NH4Cl 50mM, Na2SO4 5mM, MgSO4 2mM，其余成分為水，于 I X IO5Pa 高壓下滅菌20mino所述自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基成分以IL計(jì)為:蛋白胨IOg,酵母粉5g,葡萄糖0.5g,乳糖2g,甘油 5g, Na2HPO4 25mM, KH2PO4 25mM, NH4Cl 50mM, Na2SO- 45mM, MgSO4 2mM, FeCl3 50 μ M,CaCl2 20 μ M,其余成分為水，于I X IO5Pa高壓下滅菌20min。實(shí)施例4(I)種子培養(yǎng):將經(jīng)過斜面培養(yǎng)的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET-plaCCTCCM2012423單菌落接種于種子培養(yǎng)基(含終濃度為100 μ g/ml的卡那霉素)，在回旋式搖床上于36°C振蕩培養(yǎng)6h，搖床轉(zhuǎn)速180r/min ；

(2)自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng):將上述種子培養(yǎng)所得活化種子液按體積百分比2%的接種量接種至自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基，自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于36°C振蕩培養(yǎng)4h小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速180r/min ;分別向自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加其總重量0.5%的甘氨酸和0.5%的曲拉通，繼續(xù)培養(yǎng)12h ;發(fā)酵完畢，得到發(fā)酵液；
(3)粗酶液的提取:將上述發(fā)酵液于4°C離心IOmin,轉(zhuǎn)速8000r/min ;收集上清液，即得胞外重組磷脂酶A1的粗酶液。經(jīng)檢測，上述胞外磷脂酶A1粗酶液的酶活為94.7U/ml。實(shí)施例5(I)種子培養(yǎng):將經(jīng)過斜面培養(yǎng)的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla CCTCCM2012423單菌落接種于種子培養(yǎng)基(含終濃度為100 μ g/ml的卡那霉素)，在回旋式搖床上于36°C振蕩培養(yǎng)7h，搖床轉(zhuǎn)速200r/min ；(2)自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng):將上述種子培養(yǎng)所得活化種子液按體積百分比3%的接種量接種至自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基，自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于36°C振蕩培養(yǎng)5h小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速200r/min ;分別向自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加其總重量0.75%的甘氨酸和0.75%的曲拉通，繼續(xù)培養(yǎng)13h ;發(fā)酵完畢，得到發(fā)酵液；(3)粗酶液的提取:同實(shí)施例4。經(jīng)檢測，上述胞外磷脂酶A1粗酶液的酶活為109.8UM。實(shí)施例6(I)種子培養(yǎng):將經(jīng)過斜面培養(yǎng)的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla CCTCCM2012423單菌落接種于種子培養(yǎng)基(含終濃度為100 μ g/ml的卡那霉素)，在回旋式搖床上于37°C振蕩培養(yǎng)7h，搖床轉(zhuǎn)速200r/min ；(2)自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng):將上述種子培養(yǎng)所得活化種子液按體積百分比4%的接種量接種至自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基，自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于37°C振蕩培養(yǎng)4h小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速200r/min ;分別向自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加其總重量I %的甘氨酸和I %的曲拉通，繼續(xù)培養(yǎng)13h ;發(fā)酵完畢，得到發(fā)酵液；(3)粗酶液的提取:同實(shí)施例4。經(jīng)檢測，上述胞外磷脂酶A1粗酶液的酶活為117.2U/ml。實(shí)施例7(I)種子培養(yǎng):將經(jīng)過斜面培養(yǎng)的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla CCTCCM2012423單菌落接種于種子培養(yǎng)基(含終濃度為100 μ g/ml的卡那霉素)，在回旋式搖床上于35°C振蕩培養(yǎng)5h，搖床轉(zhuǎn)速180r/min ；(2)自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng):將上述種子培養(yǎng)所得活化種子液按體積百分比1%的接種量接種至自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基，自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于35°C振蕩培養(yǎng)3h小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速180r/min ;分別向自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加其總重量2%的甘氨酸和2%的曲拉通，繼續(xù)培養(yǎng)12h ;發(fā)酵完畢，得到發(fā)酵液；(3)粗酶液的提取:同實(shí)施例4。經(jīng)檢測，上述胞外磷脂酶A1粗酶液的酶活為78.3U/ml。實(shí)施例8(I)種子培養(yǎng):將經(jīng)過斜面培養(yǎng)的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla CCTCCM2012423單菌落接種于種子培養(yǎng)基(含終濃度為100 μ g/ml的卡那霉素)，在回旋式搖床上于37°C振蕩培養(yǎng)7h，搖床轉(zhuǎn)速200r/min ；(2)自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng):將上 述種子培養(yǎng)所得活化種子液按體積百分比4%的接種量接種至自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基，自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于37°C振蕩培養(yǎng)5h小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速200r/min ;分別向自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加其總重量0.75%的甘氨酸和I %的曲拉通，繼續(xù)培養(yǎng)14h ;發(fā)酵完畢，得到發(fā)酵液；(3)粗酶液的提取:同實(shí)施例4。經(jīng)檢測，上述胞外磷脂酶A1粗酶液的酶活為137.6U/ml。綜上所述，實(shí) 施例8所述磷脂酶A1制備方法具有最高的酶活性，為最佳實(shí)施例。
_說明書核苷酸序列表_
<110>江南大學(xué)
<120> 一株重組大腸桿菌及用該菌株制備磷脂酶Al的方法 <160> I
<170> PatentIn version 3.3
<210> I<211 >963<212> DNA
<213〉大腸桿菌(Escherichia coli sp.) BL21 (DE3) /pET-pla <400〉I
atgagtatgc cttlgagttt tacctctgcg gtcagccctg cggcgattca gcccccggca 60acgcgctcgt tgccagagcg tttggatcct tcccagccta ctgaacccic ggcatcaaag 120gcccccgcgg ccacgcUtc ccagaatagc ctgaatgccc agaacctgct gaacacgctg 180gtcagcgatt tgtcggcagc agcgccggcg gcggcgaatc agggtgtgac acgcggtcag 2-0cagccacaga agggggacta tacgctggcg ttactggcta aagacgrtta cagcaccggc 300agtcagggcg tcgaaggatt caatcggttg agtgccgatg ctttgctggg ggttggcatt 360galcclgcca glcigcaaga lgcagcgicg ggtIllcagg ccgggatlia caglgalaal 42U`
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權(quán)利要求
1.一株重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)/pET-pla，保藏編號(hào)為 CCTCCN0.M 2012423，其特征在于:該重組大腸桿菌包含一段來源于液化沙雷氏菌CICC N0.21538的Pla基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-pla，CCTCC N0.M2012423，其特征在于由下述方法制得: Cl)以所述液化沙雷氏菌CICC N0.21538的基因組為模板，克隆得到所述pla基因； (2)將步驟(I)所得pla基因克隆到表達(dá)載體pET-28a( + )上，得到重組載體pET-pla ； (3)將步驟(2)所得重組載體pET-pla轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建得到能表達(dá)磷脂酶A1的重組大腸桿菌。
3.用權(quán)利要求1 2任一項(xiàng)所述重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-pla，CCTCCN0.M2012423制備磷脂酶A1的方法，其特征在于以該重組大腸桿菌為發(fā)酵菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，制備憐脂酶A1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備磷脂酶A1的方法，其特征在于具體步驟如下: (1)種子培養(yǎng):將經(jīng)過斜面培養(yǎng)的所述重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-pla，CCTCC N0.M2012423單菌落接種于種子培養(yǎng)基，于35 37°C振蕩培養(yǎng)5 7h，搖床轉(zhuǎn)速180 200r/min ； (2)自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng):將上述種子培養(yǎng)所得活化種子液按體積百分比廣4%的接種量接種至自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基，于35 37°C振蕩培養(yǎng)3 5h小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速180 200r/min ；再向所述自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加其總重量0.5 2%的甘氨酸和曲拉通，繼續(xù)培養(yǎng)12 14h ;發(fā)酵完畢，得到發(fā)酵液； (3)粗酶液的提取:將上述發(fā)酵液離心，收集上清液，即得含磷脂酶A1的粗酶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備磷脂酶A1的方法，其特征在于步驟(I)所述斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分以IL計(jì)為:蛋白胨IOg,酵母粉5g,葡萄糖8g,氯化鈉I,其余成分為水,調(diào)節(jié)pH值至7.4 ;所述種子培養(yǎng)基成分以IL計(jì)為:蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖8g，Na2HPO4 25mM,KH2PO4 25mM, NH4Cl 50mM, Na2SO4 5mM, MgSO4 2mM，其余成分為水。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備磷脂酶A1的方法，其特征在于步驟(2)所述自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基成分以IL計(jì)為:蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖0.5g，乳糖2g，甘油5g，Na2HPO4 25mM,KH2PO4 25mM, NH4Cl 50mM, Na2SO4 5mM, MgSO4 2mM, FeCl3 50 μ M, CaCl2 20 μ M，其余成分為水。
全文摘要
本發(fā)明提供一株重組大腸桿菌及用該菌株制備磷脂酶A1的方法。本發(fā)明成功構(gòu)建了一株磷脂酶A1基因來源于液化沙雷氏菌CICC No.21538的基因重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-pla CCTCC M 2012423，用該菌株進(jìn)行液體發(fā)酵來制備溶血性磷脂酶A1，其制備方法包括斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、自發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)(包括添加滲透性物質(zhì))以及粗酶液的提取。利用本發(fā)明菌株通過液體發(fā)酵制備磷脂酶A1，具有產(chǎn)酶量和酶活性高、生產(chǎn)工藝簡單、生產(chǎn)周期短、成本低、易于工藝放大等優(yōu)點(diǎn)，在油脂精煉、磷脂改性等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/425GK103074290SQ20121055132
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月18日
發(fā)明者張梁, 石貴陽, 延晉雷, 丁重陽, 顧正華 申請(qǐng)人:江南大學(xué)