一種中間蒼白桿菌scuec4菌株及其篩選方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種中間蒼白桿菌SCUEC4(Ochrobactrum intermedium SCUEC4)菌株，該菌株的保藏編號為：CCTCC NO：M2014403，該菌株的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。該菌株的不僅能夠運(yùn)用于煙堿降解中，而且還能夠加快煙葉成熟。本發(fā)明同時還提供了一種篩選分離上述菌株的方法，包括以下步驟：首先富集培養(yǎng)，然后分離純化最后將分離純化后的菌株按單菌落接種于煙堿培養(yǎng)基中，在室溫下?lián)u床培養(yǎng)1-3天后，測定煙堿培養(yǎng)基的發(fā)酵液中煙堿含量，根據(jù)煙堿降解率的大小來復(fù)篩菌株，從而得到中間蒼白桿菌SCUEC4菌株。
CCTCC NO：M2014403
2014.09.09
【專利說明】-種中間蒼白桿菌SCUEC4菌株及其篩選方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種降解煙堿的微生物菌株，具體涉及一種中間蒼白桿菌SCUEC4菌 株，以及該菌株的篩選方法和用途，屬于煙堿降解【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 煙堿不僅是存在于煙草中的最重要的化學(xué)成分，煙堿含量的高低對煙草產(chǎn)品的質(zhì) 量起著相當(dāng)重要的作用。目前，我國烤煙煙堿含量普遍偏高，尤其是上部煙葉更加明顯，如： 神農(nóng)架周邊地區(qū)部分區(qū)域煙葉外觀質(zhì)量已接近國內(nèi)和國際先進(jìn)水平，但一些產(chǎn)煙縣煙葉 煙堿含量高達(dá)3. 5%?4. 5%，白肋煙上部煙堿含量更是高達(dá)6%。這不但影響了上部煙的 質(zhì)量，而且影響上部的可用性，給卷煙配方工業(yè)帶來了困難，制約了上部煙葉市場經(jīng)營。
[0003] 迅速有效降低高煙堿含量煙葉中的煙堿含量是煙草行業(yè)所面臨的現(xiàn)實(shí)問題，因 而，國內(nèi)外對降低高煙堿含量煙葉中的煙堿含量作了大量研究，這些研究大都集中在生態(tài)、 栽培因子、物理措施降低煙堿含量，如施肥、過濾、打孔稀釋、煙草薄片等，而對利用生物技 術(shù)降解煙堿研究報道較少。
[0004]中國發(fā)明專利申請（申請?zhí)枮椋?00710013068. 3, 200710013069. 8， 200710070805. 3, 200910097536. 9,等），這些專利涉及的菌株對煙堿具有有效的降解性能， 唯一的缺點(diǎn)是在室內(nèi)實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行煙堿降解，對于真實(shí)生產(chǎn)的田間煙葉是否具有作用 還未經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種中間蒼白桿菌SCUEC4菌株，該菌株的不僅能夠運(yùn)用于煙堿降 解中，而且還能夠加快煙葉成熟。
[0006]本發(fā)明提供的中間蒼白桿菌 SCUEC4(0chrobactrum intermedium SCUEC4)菌株， 該菌株的保藏編號為：CCTCC NO :M2014403,該菌株的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 本發(fā)明同時還提供了一種篩選分離上述菌株的方法，包括以下步驟：
[0008](1)、富集培養(yǎng)：將煙草種植田的土壤放入煙堿培養(yǎng)基中，在室溫條件下?lián)u床培養(yǎng)， 培養(yǎng)1-3天后，將富集液轉(zhuǎn)接至新鮮煙堿培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)接步驟三次以上， 以達(dá)到富集的目的，收集富集培養(yǎng)液備用；
[0009](2)、分離純化：采用生理鹽水按梯度逐級稀釋富集培養(yǎng)液，然后將稀釋液涂布在 煙堿分離培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)，然后選取生長速度快、生長勢頭好的菌株進(jìn)行分離純化；
[0010](3)、將分離純化后的菌株按單菌落接種于煙堿培養(yǎng)基中，在室溫下?lián)u床培養(yǎng)1-3 天后，測定煙堿培養(yǎng)基的發(fā)酵液中煙堿含量，根據(jù)煙堿降解率的大小來復(fù)篩菌株，從而得到 中間蒼白桿菌 SCUEC4(0chrobactrum intermedium SCUEC4)菌株。
[0011] 所述的培養(yǎng)步驟具體為：在30°C條件下，采用180rpm搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為48h。
[0012] 所述的生理鹽水為質(zhì)量濃度0. 9%的生理鹽水。
[0013] 本發(fā)明提供的中間蒼白桿菌SCUEC4菌株具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、該菌株的降解能力強(qiáng)， 經(jīng)測試，在實(shí)驗(yàn)室中該菌株的降解率最高可達(dá)到92. 68%，在田間試驗(yàn)中，該菌株的煙堿降 解率最高可達(dá)27. 34%。2、該菌株能夠加速煙葉的成熟。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例中煙堿降解率曲線表。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做詳細(xì)具體的說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局 限于以下實(shí)施例。
[0016] 本實(shí)施例中所提供的中間蒼白桿菌SCUEC4(0chrobactrum intermedium SCUEOi) 菌株于2014年9月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)武 漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO :M2014403,該菌株的16S核苷酸序列如SEQ IDN0. 1所示，包 括1160個堿基。
[0017] 本實(shí)施例中提供的中間蒼白桿菌SCUEC4(Ochrobactrum intermedium SCUEC4)菌 株的篩選分離方法如下：（1)、富集培養(yǎng)：將煙草種植田的土壤2g放入煙堿培養(yǎng)基20mL中， 在30°C條件下采用180rpm搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，將lmL富集液轉(zhuǎn)接至新鮮煙堿培養(yǎng)基中 繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)接步驟三次，以達(dá)到富集的目的，收集富集培養(yǎng)液備用；
[0018] (2)、分離純化：采用質(zhì)量濃度0.9%的生理鹽水按梯度逐級稀釋富集培養(yǎng)液，然 后將稀釋液涂布在煙堿分離培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)，然后選取生長速度快、生長勢頭好的菌株 進(jìn)行分離純化；
[0019] 在此步驟中由于煙堿分離培養(yǎng)基以煙堿作為唯一碳源，氮源為無機(jī)鹽，因此能在 此分離培養(yǎng)基上生長的微生物就是可能具有降解煙堿的能力的微生物。
[0020](3)、將分離純化后的菌株按單菌落接種于煙堿培養(yǎng)基中，在室溫下?lián)u床培養(yǎng)1-3 天后，測定煙堿培養(yǎng)基的發(fā)酵液中煙堿含量，根據(jù)煙堿降解率的大小來復(fù)篩菌株，從而得到 中間蒼白桿菌 SCUEC4(0chrobactrum intermedium SCUEC4)菌株。
[0021] 雖然能在以上煙堿分離培養(yǎng)基上生長的菌株有可能具有降解煙堿的能力，但還有 可能只是耐煙堿并不降解它，所以本步驟中要對純化的菌落進(jìn)行復(fù)篩。
[0022] 將本實(shí)施例中篩選得到的中間蒼白桿菌SCUEW (Ochrobactrum intermedium SCUEC4)菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室煙堿降解實(shí)驗(yàn)，經(jīng)分析后確定最優(yōu)降解條件為：煙堿初始濃度為 2g/L、溫度為30°C、初始pH為5. 5-6. 0、以蛋白胨和牛肉膏各0. 5%作為復(fù)合氮源、微量元素 的濃度為5mL/L，在此最優(yōu)條件下煙堿降解率能達(dá)到92. 68%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，在圖 1中可以看出，隨著培養(yǎng)時間的增長，煙堿濃度逐漸降低，而吸光度不斷升高。
[0023] 然后進(jìn)行田間煙堿降解實(shí)驗(yàn)，將本實(shí)施例中篩選得到的中間蒼白桿菌 SCUEC4(Ochrobactrum intermedium SCUEC4)菌株制成菌懸液，將菌懸液處理采收前的新 鮮煙葉，試驗(yàn)完成后，經(jīng)測定可有效降低煙葉中煙堿含量，煙堿降解率為27. 34%。同時，經(jīng) 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中間蒼白桿菌SCUEC4(Ochrobactrum intermedium SCUEC4)菌株還能加速煙葉成 熟。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于煙喊降解的中間蒼白桿菌SCUEC4(0chrobactrum intermedium SCUEC4)菌 株，該菌株的保藏編號為：CCTCC NO :M2014403,該菌株的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -種權(quán)利要求1所述菌株的篩選分離方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 、富集培養(yǎng)：將煙草種植田的土壤放入煙堿培養(yǎng)基中，在室溫條件下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng) 1-3天后，將富集液轉(zhuǎn)接至新鮮煙堿培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)接步驟三次以上，以達(dá) 到富集的目的，收集富集培養(yǎng)液備用； (2) 、分離純化：采用生理鹽水按梯度逐級稀釋富集培養(yǎng)液，然后將稀釋液涂布在煙堿 分離培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)，然后選取生長速度快、生長勢頭好的菌株進(jìn)行分離純化； (3) 、將分離純化后的菌株按單菌落接種于煙堿培養(yǎng)基中，在室溫下?lián)u床培養(yǎng)1-3天 后，測定煙堿培養(yǎng)基的發(fā)酵液中煙堿含量，根據(jù)煙堿降解率的大小來復(fù)篩菌株，從而得到中 間蒼白桿菌 SCUEC4(0chrobactrum intermedium SCUEC4)菌株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選分離方法，其特征在于：所述的培養(yǎng)步驟具體為：在 30°C條件下，采用180rpm搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為48h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選分離方法，其特征在于：所述的生理鹽水為質(zhì)量濃度 0. 9%的生理鹽水。
5. 權(quán)利要求1所述的菌株在煙堿降解中的用途。
6. 權(quán)利要求1所述的菌株在加快煙葉成熟中的用途。
【文檔編號】A62D3/02GK104328067SQ201410522701
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】李曉華, 孔文, 郭利, 李陽, 楊振飛, 王曉麗, 何冬蘭, 程國軍, 劉濤, 李開, 曹麗君, 陳濤, 龔傳清, 李永輝, 曹祥練, 胡健康, 盧紅良, 彭功銀 申請人:中南民族大學(xué)