專利名稱：一種用于重組工程的大腸桿菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體是涉及一株用于重組工程的大腸桿菌。
背景技術(shù)：
重組工程是指由重組酶催化的DNA短片段之間的同源重組而在大腸桿菌中進(jìn)行基因 克隆或DNA改造的一種較為新穎的基因克隆手段。重組工程在常規(guī)基因克隆方法難以進(jìn)行 或效率極低時(shí)有著極大的優(yōu)勢(shì)。例如當(dāng)待克隆的DNA片段過大時(shí)，合適的酶切位點(diǎn)難以尋 找、凝膠回收難以進(jìn)行、PCR擴(kuò)增的得率低且易引入錯(cuò)配堿基；DNA片段經(jīng)自外于照射等 操作也可能基因發(fā)生突變。重組工程則避免了這些操作步驟，已逐漸成為常規(guī)的克隆手段。 重組工程中的重組酶主要是來源自Wl菌體三個(gè)基因，其中reda(exo)編碼DNA5'端至 3'端的外切酶，其作用于雙鏈DNA分子而產(chǎn)生3'端突出的分子；re鄰(bet)編碼單鏈結(jié)合蛋 白，其結(jié)合在DNA分子的3'突出端而防止大腸桿菌所產(chǎn)生的DNA內(nèi)切酶RecBCD對(duì)外源 DNA的降解，同時(shí)還行使重組酶活性，即促進(jìn)兩個(gè)單鏈、同源DNA分子之間的退火；gam 基因的作用是抑制大腸桿菌RecBCD對(duì)外源DNA的降解。這三個(gè)基因也就是通常意義上的 重組酶基因。
目前主要有兩種重組工程系統(tǒng)，即兩種重組酶存在和受誘導(dǎo)的形式。第一種是重組酶 基因克隆在質(zhì)粒上的，如美國Purdue大學(xué)Barry Wanner教授實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的pKD46載體和 德國Dresden大學(xué)Youming Zhang博士等構(gòu)建的pSC101-BAD-gbaA載體。這兩個(gè)質(zhì)粒的 共同點(diǎn)是l.由reda， re鄰和gam由pBAD啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)，pBAD啟動(dòng)子受L-阿拉伯糖誘 導(dǎo)表達(dá)的araC基因所激活。2.質(zhì)粒的復(fù)制子為來源于pSC101的溫度敏感性復(fù)制子，此復(fù)制 子在30°C行使復(fù)制功能，在37°C或更高溫度時(shí)質(zhì)粒不再復(fù)制而丟失。兩個(gè)質(zhì)粒的不同點(diǎn) 是l.pKD46含有orf60a基因而pSC101-BAD-gbaA含有大腸桿菌來源的recA基因，這兩 個(gè)基因都可以可促進(jìn)同源重組的效率。常規(guī)的大腸桿菌的克隆宿主菌如DH10B是recA基 因缺陷型的以避免基因克隆中的異常重組。重組工程系統(tǒng)中的recA基因是瞬時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)的， 故不會(huì)產(chǎn)生異常的重組。2.pKD46是氨芐青霉素抗性的，而pSC101-BAD-gbaA是四環(huán)素抗 性的。
第二種系統(tǒng)是美國國立癌癥研究所Donald Court實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大腸桿菌DY380。DY380中的redcc, red和gam基因包含在缺陷前噬菌體中，此缺陷前噬菌體以整合至大腸桿菌基 因組的形式存在。reda， red(3和gam基因由PL啟動(dòng)子所誘導(dǎo)。32°C時(shí)，PL啟動(dòng)子被溫度 敏感性抑制子cI857所抑制，42T時(shí)抑制解除。因此在DY380中，重組酶的表達(dá)是由32°C 轉(zhuǎn)移至42。C時(shí)的熱所誘導(dǎo)的。
這兩個(gè)系統(tǒng)都有些缺點(diǎn)，首先它們均是在30°C時(shí)生長，而大腸桿菌的最適溫度是37°C， 這樣菌株的生長較慢；其次，含重組酶的質(zhì)粒在重組發(fā)生后，在37°C下也不完全丟失，這 樣就對(duì)重組克隆的分離帶來困難。這常常需要將重組產(chǎn)物再次轉(zhuǎn)化以去除含重組酶的質(zhì)粒， 而這在進(jìn)行細(xì)菌人工染色體(BAC)的操作時(shí)，會(huì)帶來麻煩，因?yàn)锽AC較大(其克隆片段可 達(dá)300kb)，反復(fù)轉(zhuǎn)化(在多次修飾時(shí))就可能對(duì)DNA有所傷害。對(duì)BAC的操作是重組工 程的優(yōu)越點(diǎn)所在，也是經(jīng)常要進(jìn)行的。而整合型的DY380需要42。C水浴進(jìn)行15分鐘的熱 誘導(dǎo)，這就增加了額外的操作，主要的是保持溫度均勻有時(shí)難以控制。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供了一株重組工程菌，該菌株是將重組酶基因(reda， re鄰 和gam)以及相關(guān)的araC， pBAD， recA和慶大霉素抗性基因(Gm)—起在同源重組下，整 合至大腸桿菌DH10B的基因組上的endA基因區(qū)域而獲得了 。
大腸埃希氏菌CGMCC No. 3192是通過以下方法獲得將行使重組工程的基因片段，即 包含來源于大腸桿菌的阿拉伯糖操縱元的調(diào)節(jié)基因araC，阿拉伯糖操縱元的啟動(dòng)子pBAD， 來源于X噬菌體的重組酶基因reda、 red P和gam，來源于大腸桿菌recA基因和慶大霉素抗 性基因(Gm)， 一起整合至大腸桿菌DH10B的基因組中的endA基因區(qū)域而獲得。其中redoc， re鄰，gam和recA由pBAD啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)。當(dāng)在培養(yǎng)基中加入L-阿拉伯糖時(shí)，pBAD驅(qū)動(dòng) reda, re鄰，gam和recA的表達(dá)，此時(shí)可催化DNA短片段之間的同源重組，即重組工程。 DNA短片段的長度一般在50個(gè)堿基對(duì)。
本發(fā)明的大腸桿菌工程菌中，reda, re鄰和gam和recA基因受pBAD啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)。 pBAD啟動(dòng)子受araC基因所調(diào)節(jié)，araC基因在L-阿拉伯糖存在時(shí)才發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。reda， re鄰和gam和recA基因在受pBAD啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)后，催化短DNA片段之間的同源重組， 即重組工程。araC， pBAD， redct， redf3， gam和recA基因，整合至大腸桿菌DH10B基因 組中的endA基因區(qū)域，endA 基因被去除。慶大霉素抗性基因Gm和araC， pBAD, reda， re鄰，gam和recA基因連接
4在一起，作為基因整合菌株的篩選標(biāo)記。
盡管所整合的DNA片段中含有recA基因，可行使同源重組的功能，但為了增加效率， 我們采用pSC101-BAD-gbaA進(jìn)行同源重組。同時(shí)，雖然pSC101-BAD-gbaA所催化的重組 工程系統(tǒng)可以利用短至50個(gè)堿基對(duì)的同源臂進(jìn)行同源重組，但重組酶及其相關(guān)部分較大 (5.8kb)， PCR擴(kuò)增的效率低，更有可能引起堿基錯(cuò)配而使基因突變。這樣為保險(xiǎn)起見，我 們使用較長的DNA片段(本發(fā)明中實(shí)際使用左側(cè)140bp和右側(cè)370bp作為同源片段進(jìn)行同 源重組)。
所選擇的整合位點(diǎn)為endA基因區(qū)域，endA基因是DNA專一性內(nèi)切酶，其降解DNA 而損傷DNA的質(zhì)量，故在大腸桿菌DH10B中是點(diǎn)突變而失去活性的，本發(fā)明擴(kuò)增其兩側(cè) 的DNA作為同源片段以進(jìn)行同源重組后，將重組酶基因部分整合至基因組，endA基因部 分被去除。
按上述方法構(gòu)建的一株具體的菌株是大腸埃希氏菌CEscA^r/z/fl co//) CGMCC No. 3192。該 菌株含有來源于X噬菌體的重組酶基因reda, re鄰和gam和來源于大腸桿菌recA基因。 從實(shí)施例中以大腸桿菌LS-GR進(jìn)行同源重組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可得如下結(jié)論
1. 盡管在中等拷貝數(shù)的質(zhì)粒修飾實(shí)驗(yàn)中，直接涂布轉(zhuǎn)化液所得到的單倍體正確克隆的比例 較小(1/22)，但培養(yǎng)數(shù)小時(shí)培養(yǎng)后提質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化可得到80%(8/10)的正確率。由于是中等 拷貝數(shù)的質(zhì)粒，其克隆的片段不會(huì)大(一般在數(shù)kb至十幾kb)，因此反復(fù)轉(zhuǎn)化不會(huì)對(duì)DNA 有損害。
2. 對(duì)單拷貝的、重組工程中經(jīng)常使用的BAC載體，直接涂布轉(zhuǎn)化液所得到正確克隆比例高 (6/8)。轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)再提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，可得到100%的效率(8/8)，但這沒有必要， 一方面是 增加了時(shí)間，另一方面，轉(zhuǎn)化含大片段DNA的BAC可能對(duì)DNA有所傷害。直接涂布 轉(zhuǎn)化液篩選正確的克隆已足夠。
本菌株的優(yōu)點(diǎn)在于l.可在37°C，不加抗生素下培養(yǎng)，生長迅速；2.以L-阿拉伯糖進(jìn) 行誘導(dǎo)，簡便易行；3.無任何殘留質(zhì)粒的干擾；4.同源重組的效率高，尤其是針對(duì)重組工程 中常見的BAC載體的效率高。本發(fā)明所得菌株可成為重組工程的通用菌株。


圖1是重組酶及其相關(guān)基因克隆后所得到的質(zhì)粒pGR的圖譜。 其中
707-1126是endA基因左側(cè)420 bp的同源片段，實(shí)際使用的是其中 PvuII-XhoI之間的170bp作為同源重組的片段；1198-1731是3'端至5'端方向的慶大霉素抗性基因的開放閱讀框；1968-2846是3'端至5'端方向的阿拉伯糖操作元調(diào)節(jié)基因araC;3022-3149是阿拉伯糖操作元的啟動(dòng)子pBAD;3192-3608是來源于X噬菌體的gam基因；3614-4399是來源于X噬菌體的reda基因；4402-5076是來源于Wl菌體的re鄰基因；5100-6161是大腸桿菌中的recA基因；6949-7616是3'端至5'端方向的載體復(fù)制區(qū)colEl;7764-8624是3'端至5'端方向的氨芐青霉素抗性基因的開放閱讀框；6170-6550是endA基因右370bp的同源片段。圖2是pGR以不同限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切的瓊脂糖凝膠電泳圖。
1. DL2000分子量禾示準(zhǔn):2.0，1.0,0.75，0.5,0.25,0.1 kb
2. XDNA/Hindlll分子量標(biāo)準(zhǔn):23.1,9.4,6.6,4.4,2.3，2.0 kb
3. pGR7EcoRI: 0.7,1.2， 1.4,5.3 kb
4. pGR/EcoRV:0.2,1.04,3.0,4.54 kb
5. pGR/PvuII:0.44,2.51,5.8 kb
6. pGR/XhoI-BamHI/0.42，2.0，2.2,3.0 kb
7. pGR//NcoI-KpnI:2.0，2.4,4.3 kb
8. DL500分子量豐示準(zhǔn):5.0，4.0，3.5，3.0,2.5，2.0,1.5,1.0,0.5,0.25 kb圖3是大腸桿菌LS-GR基因組上重組酶等基因的位置圖。
其中KI4和KG， KB和KE和KA和KI1等是驗(yàn)證大腸桿菌LS-GR基因型的PCR引物。圖4是本發(fā)明中重組工程實(shí)例的示意圖。
其中neo是卡那霉素抗性基因，kan是卡那霉素。HA1是與待修飾的質(zhì)粒plasmid 1上一端序列相同的同源臂，5'是針對(duì)與卡那霉素5'的引物部分，整個(gè)引物是由HA1和5'的序列所組成;HA2是與待修飾的質(zhì)粒plasmid 1上另一端序列相同的同源臂，3'是針對(duì)與卡那霉素3'的引物部分，整個(gè)引物是由HA2和3'的序列所組成。擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至含有plasmidl的大腸桿菌LS-GR中，經(jīng)過同源重組，在卡那霉素抗性的篩選之下，得到經(jīng)修飾的質(zhì)粒plasmid 2。圖5是pACYC184的質(zhì)粒圖譜。圖6是pAEN的質(zhì)粒圖譜。
6圖7是大腸桿菌LS-GR介導(dǎo)將pACYC184上的四環(huán)素抗性基因(Tc)置換為卡 那霉素抗性基因(neo)的同源重組實(shí)驗(yàn)中，從轉(zhuǎn)化液直接涂布抗性平板上，所得的單菌落 提取的pAEN質(zhì)粒電泳檢測(cè)結(jié)果。 l-22.為隨機(jī)獲得的22個(gè)克隆質(zhì)粒電泳 M.pACYC184
可見第1，6,9,12，15，17，19，20，21，22號(hào)克隆為單倍體質(zhì)粒帶型，其余均為質(zhì)粒多倍體帶型。 圖8是圖7中所獲得的質(zhì)粒以Ncol進(jìn)行酶切的結(jié)果。
M: DL500分子量標(biāo)準(zhǔn):5.0，4.0，3.5，3.0，2.5,2.0，1.5，1.0，0.5,0.25 kb
可見只有第19號(hào)克隆為重組質(zhì)粒pAEN單體，Ncol進(jìn)行酶切得到1.4 kb和2.5 kb兩條 帶，而其余克隆均含有pACYC184，即多出一條4.2kb的條帶。 圖9是以大腸桿菌LS-GR將pACYC184上的四環(huán)素抗性基因(Tc)置換為卡 那霉素抗性基因(neo)的同源重組實(shí)驗(yàn)中，電轉(zhuǎn)化后，培養(yǎng)，提質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化DH10B 所得單菌落，所提取的質(zhì)粒電泳的檢測(cè)結(jié)果。 M. pACYC184
l-10.為隨機(jī)獲得的10個(gè)克隆質(zhì)粒電泳，其中第6和第7號(hào)克隆為多倍體。
圖10是圖9所獲得的質(zhì)粒以Ncol進(jìn)行酶切的結(jié)果。
M: DL500分子量豐示準(zhǔn):5.0，4.0，3.5，3.0,2.5，2.0,1.5,1.0，0.5，0.25 kb
卜IO.酶切顯示pAEN以Ncol進(jìn)行酶切所得的1.4 kb和2.5 kb兩條帶，而第6和第7號(hào)克
隆含有pACYC184，即多出一個(gè)4,2kb的條帶。 圖11是圖9所獲得的質(zhì)粒以Sphl和Xbal雙酶切的結(jié)果。 M: DL500分子量木示準(zhǔn):5.0，4.0，3.5，3.0,2.5，2.0，1.5,1.0，0.5,0.25 kb
卜IO.酶切顯示pAEN以Sphl和Xbal雙酶切所得的0.8 kb和3.1 kb兩條帶，而第6和第7
號(hào)克隆含有pACYC184，即多出0.6kb和3.6kb兩條帶。 圖12是pECBACl的質(zhì)粒圖譜。 圖13是pBACN的質(zhì)粒圖譜。
圖14是以大腸桿菌LS-GR將pECBAC氯霉素抗性基因(Cm)置換為卡那霉素抗性基因 (neo)的同源重組實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)化液直接涂布所得的單菌落提取的pBACN質(zhì)粒及電轉(zhuǎn)化后， 培養(yǎng)，提質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化至￡ )//011108所得單菌落，所提取的質(zhì)粒電泳的檢測(cè)結(jié)果。 1-8.從轉(zhuǎn)化液直接涂布所得的單菌落中隨機(jī)挑取的8個(gè)提取的pBACN質(zhì)粒 M.pECBACl9-16.再轉(zhuǎn)化￡.co// DH10B所得單菌落中隨機(jī)挑取的8個(gè)提取的pBACN質(zhì)粒圖15是圖14所得質(zhì)粒的Ncol酶切的結(jié)果。
1-8.是圖14中1-8質(zhì)粒Ncol酶切的結(jié)果，pBACN酶切得到2.5 kb和5.3 kb兩條帶，第3
號(hào)和第7號(hào)克隆含有pECBACl單體，即多出1.9 kb和5.6kb兩條帶(5.6 kb和pBACN酶
切得到的5.3kb不能分開)。
M1.DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn):2.0,1.0，0.75，0.5,0.25,0.1 kb
M2. XDNA/Hindlll分子量木示準(zhǔn):23.1，9.4，6.6,4.4，2.3，2.0kb
9-16.是圖14中9-16質(zhì)粒NcoI酶切的結(jié)果，均顯示正確的pBACN酶切所得到的2.5kb和5.3kb兩條帶
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明， 一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。
下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
本發(fā)明中所述大腸桿菌LS-GR于2009年7月10日送交中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所；保藏菌株分類命名為大腸埃希氏菌(Esc/ieArWflco//)，保藏編號(hào)CGMCC No 3192.實(shí)施例中所用到的菌株和質(zhì)粒，均為已公開的菌株和質(zhì)粒
1. ￡ic/rer/cA/a co// DH10B 。 基因型 F wcrA A(Awr-;m/RMS-mcTBC)(()80d/。cZAM15 A/acX74 cfeoR wcAl araD139A(ara, /ew)7697 ga/U ga/K r/wL e"fi Al聰; G.。文獻(xiàn)Life Technologies, Inc. Focus (1990)12,19。購自美國Invitrogen公司。
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5. pSC101-BAD-gbaA。文獻(xiàn)Wang， J" Sarov， M.， Rientjes, J" Fu， J" Hollak， H" Kranz， H.， Xie, W.， Stewart, A.F. and Zhang, Y. (2006) An improved recombineering approach by adding RecA to lambda Red recombination. Mol Biotechnol， 32,43-53 。來自德國Dresden大學(xué)的Youming Zhang博士
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實(shí)施例l
本發(fā)明大腸桿菌LS-GR構(gòu)建的過程如下
l.大腸桿菌DH10B的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備和DNA轉(zhuǎn)化
自平板上接種新鮮劃線培養(yǎng)的單菌落至2ml LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩過夜，以1/50體 積轉(zhuǎn)至50mlLB,振蕩培養(yǎng)至菌體OD6(K)約為0.6。將菌液倒入預(yù)冷的離心管，冰浴10分鐘， 4°C， 5000rpm離心5分鐘，棄上清。以10%的甘油洗滌沉淀兩次，最后懸浮于200 ^的10% 甘油中，50pl每管分裝。
將DNA加至50ixl冰上融化的DH10B的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻。將混合液轉(zhuǎn) 移至冰上預(yù)冷的lmm電轉(zhuǎn)杯中，電擊轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化條件lmm電轉(zhuǎn)杯，200Q， 1800 V， Bio-Rad公司GenePulserllR電轉(zhuǎn)化儀。加lml LB液體培養(yǎng)基至電轉(zhuǎn)杯，吹打混勻，將溶液 轉(zhuǎn)移至一個(gè)無菌的1.5mleppendorf管中，37°C或30°C振蕩培養(yǎng)60分鐘后，轉(zhuǎn)化液涂布在 相應(yīng)抗生素的抗性平板上，37°C或30°C培養(yǎng)。挑取單菌落，在含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切和測(cè)序鑒定。2. Gm抗性基因克隆至DBluescript KS"得到PKAG
將pBAD322G和pBluescript KS(-)均以Sacl酶切，割膠回收0.8 kb的Gm片段和3.0 kb的pBluescript KS/SacI片段，以T4連接酶在16°C連接過夜，連接液轉(zhuǎn)化五.co// DH10B感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布含50 pg/ml硫酸慶大霉素，30 |ag/ml IPTG和40 pg/ml XGal的LB固體平板，挑取白色菌落，37°C培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒酶切，測(cè)序驗(yàn)證，正確的克隆命名為pKAG。
3. 將Gm抗性基因和PKD46的araC基因克隆至DBhiescriut KS(-、得到dGAC
設(shè)計(jì)引物
GRK1:5'陽GGGCTCGAG GCGGCGTTGTGACAATTTACCG-3' , (SEQ ID NO. 1)GRK2: 5'-GGGGAGCTCGAATTGACATAAGCCTG-3'， (SEQ ID N0.2)分別在5'端引入XhoI位點(diǎn)，在3'端保留SacI位點(diǎn)(以下劃線表示)，以pKAG為模板，PCR擴(kuò)增0.8kb的Gm片段，乙醇沉淀回收后以XhoI和SacI酶切后，割膠回收。設(shè)計(jì)引物
GRK3: 5'隱GGGGAGCTC CATCGATTTATTATGACAACTTGACGGC-3' ， ( SEQ ID N0.3 )GRK4: 5'-GGG GGATCCGCTAATCTTATGGATAAAAATG-3'， (SEQ ID N0.4)分別在5'端和3'端引入SacI和BamHI位點(diǎn)(以下劃線表示)，以pKD46為模板，PCR
擴(kuò)增U kb的araC片段，以Sacl和BamHI酶切后，割膠回收。
將酶切回收的Gm片段，araC片段與以Xhol和BamHI酶切的pBluescript KS(-)三片段
連接，轉(zhuǎn)化五.co// DH10B感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布含100 pg/ml氨芐青霉素,30 pg/ml IPTG
和40pg/mlXGal的LB固體平板，挑取白色菌落，37。C培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，測(cè)
序正確后，得到克隆pGAC。
4. endA基因兩端同源臂克隆到DBluescript KS"得到pENLR
以￡. o /fDH10B基因組為模板，設(shè)計(jì)引物
EA1: 5'-GGGGAATTCGCACGAACTGGCACATTTGCTGG-3' ， ( SEQ ID NO.5 )EA2: 5'-GGGCTCGAGGGAAAATGCTGCGCTCAGTAC-3', (SEQ ID N0.6 )分別在5'端和3'端引入EcoRI和Xhol位點(diǎn)(以下劃線表示)。PCR擴(kuò)增420 bp的DNA片段，乙醇沉淀沉淀回收后以EcoRI和XhoI酶切，割膠回收。
EA3: 5'-GGGCTCGAGATCATAACCCGTATGTGCAAC-3', ( SEQ ID NO.7)
10EA4: 5'-GGGGGTACCGGTGAATATGCAGCGGAGATTC-3' ， ( SEQ ID N0.8 )分別在5'端和3'端引入XhoI和Kpnl位點(diǎn)(以下劃線表示)。PCR擴(kuò)增370bp的DNA
片段，乙醇沉淀沉淀回收后以XhoI和KpnI酶切，割膠回收。
將酶切回收后的兩個(gè)片段與以EcoRI和Kpnl酶切的pBluescript KS(-)進(jìn)行三片段連接，
轉(zhuǎn)化co// DH10B感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布含100 pg/ml氨芐青霉素，30 pg/ml IPTG和
40嗎/mlXGal的LB固體平板，挑取白色菌落，37。C培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，測(cè)序
正確后，得到克隆pENLR。
以上50ulPCR反應(yīng)體系
dd H205pllOXPCR反應(yīng)緩沖液1.3|il 10mMdNTP1.5pl上游引物(終濃度0.75mM)1.5)^1下游引物(終濃度0.75mM)2pl模板(質(zhì)粒 100ng，基因組DNA 200ng)0.5^1 pfU聚合酶(5U/jxl)
PCR反應(yīng)條件95。C變性5分鐘，(95。C45秒，60GC 1分鐘，72°C lkb每分鐘)，共34個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘。使用儀器為Bio-rad公司的PTC-200型號(hào)的PCR儀。反應(yīng)結(jié)束后，以加入20 pg/ml的溴化乙錠(EB)的1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
5. 重組酶基因gam, reda， redB和recA基因克隆到nBluescriDt KS(-)得到dGBAR
將pSC101-BAD-gbaA以BamHI和Xhol酶切，割膠回收3.1 kb的片段，克與BamHI和Xhol酶切的pBluescript KS(-)相連，轉(zhuǎn)化￡ co/!' DH10B感受態(tài)細(xì)胞，
轉(zhuǎn)化液涂布含100pg/ml氨芐青霉素的LB固體平板，挑取菌落，37°<:培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒酶切酶切，測(cè)序正確后，得到pGBAR。
6. 重組酶基因gam, reda， redB及相關(guān)基因克隆得到dGR
將質(zhì)粒pGAC用XhoI-BamHI酶切，割膠回收2.0 kb的片段；pGBAR用BamHI和Xhol酶切，割膠回收3.1 kb的片段。將這兩個(gè)片段與XhoI酶切的pENLR相連，轉(zhuǎn)化E co//DH10B感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布含100 ng/ml氨芐青霉素和50 pg/ml硫酸慶大霉素的LB固體平板，挑取菌落，37。C培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證正確后，得到質(zhì)粒pGR(圖l)。 pGR的酶切 結(jié)果見圖2。
7. 大腸桿菌DH10B/pSC101-BAD-gbaA電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備
首先將pSC101-BAD-gbaA如步驟1中方法轉(zhuǎn)化至大腸桿DH10B中，在30°C培養(yǎng)和四 環(huán)素終濃度為10 ng/ml條件下篩選，所得菌株為大腸桿菌DH10B/pSC101-BAD-gbaA。
將在-7(^C凍存的菌株劃線于四環(huán)素10 pg/m的LB抗性平板，30°C培養(yǎng)20小時(shí)以上。 挑取單菌落至2ml含四環(huán)素10 pg/ml的LB液體培養(yǎng)基，于30°C振蕩培養(yǎng)過夜，按1/50 的體積轉(zhuǎn)接至20ml同樣的培養(yǎng)基，30°C振蕩培養(yǎng)，至OD6oo為0.2時(shí)，加入終濃度為0.15% 的L-阿拉伯糖，37°C振蕩培養(yǎng)約1小時(shí)，OD6oo為0.3 0.4之間。將菌體冰浴10分鐘，4°C， 5000rpm離心5分鐘，棄上清。以10%的甘油洗滌沉淀兩次，最后懸浮于100 pl的10%甘 油中，每管50pl分裝。
8. 重組工程法構(gòu)建菌株大腸桿菌LS-GR
提取pGR質(zhì)粒，以PvuII酶切，割膠回收5.8 kb的片段，為了消除環(huán)狀質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時(shí)帶 來的背景干擾，酶切回收的片段進(jìn)行第二次PvuII酶切，并割膠回收。以上兩次割膠回收都 是使用無EB的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓為25 V，時(shí)間是12小時(shí)?；厥掌魏笠?.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，調(diào)整DNA濃度為200ng/p1.
將300 ng的5.8 kb DNA片段，加入到新鮮制備的大腸桿菌DH10B/pSC101-BAD-gbaA 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)中，槍頭輕輕吹打混勻?；旌弦恨D(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，電擊轉(zhuǎn)化。電 轉(zhuǎn)化條件1 mm電轉(zhuǎn)杯，200Q, 1800v， Bio-Rad公司Gene Pulser IIR電轉(zhuǎn)化儀。加1 ml LB 液體培養(yǎng)基至電轉(zhuǎn)杯，吹打混勻，將溶液轉(zhuǎn)移至一個(gè)無菌的1.5mleppendorf管中，37°C振 蕩培養(yǎng)70分鐘后，轉(zhuǎn)化液涂布于含50pg/ml的硫酸慶大霉素的抗性平板上，37。C培養(yǎng)20 小時(shí)，挑取長出的菌落進(jìn)行驗(yàn)證。
9. 大腸桿菌LS-GR的獲得
隨機(jī)挑取步驟9中獲得的4個(gè)菌落，在含50 pg/ml硫酸慶大霉素的LB液體培養(yǎng)基中 于37。C培養(yǎng)三代，菌體稀釋后涂布在含50ng/ml硫酸慶大霉素的LB固體平板上，隨機(jī)挑 取100個(gè)菌落，分別影印至50 ng/ml硫酸慶大霉素的LB固體平板上和含10 pg/ml四環(huán)素 的LB抗性平板上，分別在37°C和30°C培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌落在含50 ng/ml硫酸慶大霉素的LB固體平板上生長良好，而在含l(^g/ml四環(huán)素的LB抗性平板上不生長，表明菌株中不再有pSC101-BAD-gbaA。驗(yàn)證pSC101-BAD-gbaA不再存在至關(guān)重要，因?yàn)闅埩舻膒SC101-BAD-gbaA可表現(xiàn)出重組酶的活性，這樣就可對(duì)目的菌株產(chǎn)生干擾。
為進(jìn)一步確證pSC101-BAD-gbaA的丟失，隨機(jī)挑取4個(gè)菌落，在含50 ng/ml硫酸慶大霉素的LB液體培養(yǎng)后，提質(zhì)粒，電泳后發(fā)現(xiàn)菌株不含質(zhì)粒。
將這4個(gè)菌株，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，設(shè)計(jì)擴(kuò)增pSC101-BAD-gbaA復(fù)制子repA區(qū)域的引物如下
repAl: 5'-ATGTCTGAATTAGTTGTTTTC-3' (SEQ ID N0.9)repA2: 5'-CAACGTATCAGTCGGGCGGCC-3' (SEQ ID NO.10)
以大腸桿菌DH10B/pSC101-BAD-gba的菌落PCR為對(duì)照，對(duì)照可擴(kuò)增出0.4kb的repA片段，而所選擇的4個(gè)菌株未擴(kuò)增出產(chǎn)物。
綜合抗性驗(yàn)證、質(zhì)粒提取和PCR驗(yàn)證，我們確認(rèn)菌株中已不再含有pSC101-BAD-gbaA。最終，隨機(jī)選取一個(gè)菌株命名為大腸桿菌LS-GR。
10.大腸桿菌LS-GR中重組酶等基因的整合狀態(tài)的PCR和克隆、測(cè)序驗(yàn)證根據(jù)預(yù)期的基因在基因組上的整合狀態(tài)，設(shè)計(jì)三對(duì)引物KI4: 5'-GTTCGATCGATTTCTGGATAG-3' (SEQ ID NO. 11)KG: 5'-GGTCGATGTTTGATGTTATGG-3' (SEQ ID N0.12)KB: 5'-CGACCCACAGGAACTGATCAC-3' (SEQIDN0.13)KE: 5'-ATTCAAACAGGGTTCTGGCGTC-3' (SEQIDN0.14)KA: 5'-TCTCACATGGGCCTTGCGGCAC-3' (SEQIDN0.15)KI1: 5'-ATGAAATTCGCCTCAATCCCG國3' (SEQIDN0.16)
其中，KI4位于基因組上整合位點(diǎn)的上游外部，KG位于Gm部分；KB位于re鄰部分，KE位于redoc部分；KA位于recA部分，KI1位于的基因組上整合位點(diǎn)的下游外部。
以大腸桿菌LS-GR的菌落為模板，以Takara公司的Ext叫進(jìn)行PCR擴(kuò)增，三對(duì)引物(KI4和KG， KB和KE, KA和KIl)均可擴(kuò)增出1.0 kb的目的片段。將這三個(gè)片段克隆在pGEM-T easy載體上，測(cè)序發(fā)現(xiàn)序列與預(yù)期完全一致。這就證明了大腸桿菌LS-GR中的基因型，如圖3所示。實(shí)施例2:
如圖4的實(shí)驗(yàn)流程示意圖所示，本專利為檢驗(yàn)大腸桿菌LS-GR的重組工程的功能，將 含中等拷貝數(shù)的pl5A復(fù)制子的質(zhì)粒pACYC184 (圖5)上的四環(huán)素抗性基因(Tc)置換為 卡那霉素抗性基因(neo),得到的新質(zhì)粒命名為pAEN (圖6)。
1. 帶同源臂的卡那霉素抗性基因(neo)的擴(kuò)增
設(shè)計(jì)引物
AEN1:5'-ATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTATG GACAGCAAGCGAACCGG-3' (SEQ ID NO. 17)
AEN2:5'-TTGATTGGCTCCAATTCTTGGAGTGGTGAATCCGTTAGCGAGGTGCCGCCTCA GAAGAACTCGTCAAGAAG-3' (SEQ ID NO. 18)
引物前面50個(gè)堿基是pACYC184質(zhì)粒上Tc基因兩端的同源臂(下劃線表示)，后面的 堿基是pKD4質(zhì)粒上neo基因兩端部分。
以pKD4模板，PCR擴(kuò)增0.8kb的neo基因，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物沉 淀回收，調(diào)節(jié)DNA濃度為200ng/jil。
2. 誘導(dǎo)重組酶表達(dá)的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備
首先將pACYC184以上述常規(guī)方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌LS-GR，以含25 pg/ml氯霉素的 LB固體平板篩選，所得菌株命名為LS-GR/ pACYC184。制備重組酶表達(dá)的 LS-GR/pACYC184電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的方法如下挑取單菌落至含25 ng/ml氯霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，220 rpm， 37°C培養(yǎng)16個(gè)小時(shí)。菌液以1/50的比例接種到100 ml的氯霉 素25 pg/ml的LB液體培養(yǎng)基中，37°C， 220rpm培養(yǎng)約2.5小時(shí)，測(cè)量OD柳在0.2到0.3 之間。加入終濃度為10 mM的L-阿拉伯糖，37°C， 220 rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)1小時(shí)。將菌體冰 浴10分鐘后，4°C， 5，000rpm離心5分鐘，棄上清。以預(yù)冷的10%甘油洗滌沉淀兩次，最 后懸浮于300^1的預(yù)冷的10%甘油中，每管5(^1分裝。
3. 大腸桿菌LS-GR介導(dǎo)的同源重組
取200ng的neo PCR產(chǎn)物，加入到新鮮制備的重組酶表達(dá)的￡.co/f LS-GR/pACYC184 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)中，槍頭輕輕吹打混勻?；旌弦恨D(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，電擊轉(zhuǎn)化。 電轉(zhuǎn)化條件lmm電轉(zhuǎn)杯，200Q， 1800v， Bio-Rad公司GenePulserIIR電轉(zhuǎn)化儀。力BlmlLB液體培養(yǎng)基至電轉(zhuǎn)杯，吹打混勻，將溶液轉(zhuǎn)移至一個(gè)無菌的1.5mleppendorf管中，37°C振蕩培養(yǎng)70分鐘后。
(1) 取0.1ml轉(zhuǎn)化液直接涂布與含30^ig/ml卡那霉素的LB平板，37。C培養(yǎng)20小時(shí)，挑取單菌落培養(yǎng)，提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。質(zhì)粒電泳結(jié)果見圖7，酶切驗(yàn)證結(jié)果見圖8。
(2) 取0.5ml菌液接至3.0ml含30 ng/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)8個(gè)小時(shí)，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至fi.coZ!'DH10B中，涂布至含3(Hig/ml卡那霉素的LB平板。挑取單菌落培養(yǎng)，提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。質(zhì)粒電泳結(jié)果見圖9,酶切驗(yàn)證結(jié)果見圖10和圖11。
試驗(yàn)結(jié)果
(l)O.lml轉(zhuǎn)化液直接涂布平板，長出的菌落數(shù)平均為196個(gè)。隨機(jī)挑取22個(gè)菌株進(jìn)行質(zhì)粒驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)有9個(gè)菌株中提取的質(zhì)粒是正確的單倍體，其他13個(gè)是多倍體質(zhì)粒。將這9個(gè)質(zhì)粒用Ncol酶切驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)僅有一個(gè)質(zhì)粒是pAEN單體，其它的質(zhì)粒為pACYC184和pAEN的混合質(zhì)粒。
(2)從轉(zhuǎn)化至￡.co// DH10B的平板上隨機(jī)挑取10個(gè)菌落提取質(zhì)粒驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)有8個(gè)是正確的單倍體，使用Ncol以及Xbal和Sphl雙酶切驗(yàn)證，證明這8個(gè)質(zhì)粒全部是pAEN，沒有pACYC184混在其中。
實(shí)施例3:
利用大腸桿菌LS-GR的重組工程的功能，將單拷貝質(zhì)粒pECBACl (圖12)氯霉素抗性基因(Cm)置換為卡那霉素抗性基因(neo)，得到的新質(zhì)粒命名為pBACN (圖13)。
l.帶同源臂的卡那霉素抗性基因(neo)的擴(kuò)增設(shè)計(jì)引物
CEN1:5'-TAAGGGCACCAATAACTGCCTTAAAAAAATTACGCCCCGCCCTGCCACT￡TATGGACAGCAAGCGAACCGG-3' (SEQ ID NO. 19 )
CEN2:5'-GCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3' (SEQ ID NO.20)
引物前面50個(gè)堿基是pECBACl質(zhì)粒上Cm基因兩端的同源臂(下劃線表示)，后面的堿基是pKD4質(zhì)粒上neo基因兩端部分。以pKD4模板，PCR擴(kuò)增0.8kb的neo基因，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物沉淀 回收，調(diào)節(jié)DNA濃度為200 ngVl。
2. 誘導(dǎo)重組酶表達(dá)的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備
首先將pECBACl以上述常規(guī)方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌LS-GR，以含12.5 pg/ml氯霉素的 LB平板篩選，所得菌株命名為￡.co/!' LS-GR/ pECBACl 。制備重組酶表達(dá)的￡.co// LS-GR/ pECBACl方法同實(shí)例2。
3. 大腸桿菌LS-GR介導(dǎo)的同源重組
DNA轉(zhuǎn)化和篩選的方法同實(shí)例2。試驗(yàn)結(jié)果
(1) 0.1ml轉(zhuǎn)化液直接涂布平板，長出的菌落數(shù)平均為121個(gè)，隨機(jī)挑取8個(gè)菌株挑取進(jìn)行 質(zhì)粒驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)菌株中提取的質(zhì)粒是正確的單倍體，其他2個(gè)異常。質(zhì)粒電泳結(jié) 果見圖14。將這8個(gè)質(zhì)粒用NcoI酶切驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)都為正確的pCEN單體，2個(gè)異常的為 pBACN和pECBACl的混合質(zhì)粒。酶切驗(yàn)證結(jié)果見圖15。
(2) 從轉(zhuǎn)化至￡.co// DH10B的平板上隨機(jī)挑取8個(gè)菌落提取質(zhì)粒驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)8個(gè)都是正確 的單倍體。質(zhì)粒電泳結(jié)果見圖14。用Ncol及Sphl酶切驗(yàn)證，證明這8個(gè)質(zhì)粒全部是純 的pBACN，沒有pECBACl混在其中。酶切驗(yàn)證結(jié)果見圖15。SEQUENCE LISTING
<110>南京師范大學(xué)
<120> —種用于重組工程的大腸桿菌菌株
<130>
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< 170> Patentln version 3.3
<210> 1
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<212> DNA <213>人工序列
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gggctcgagg cggcgttgtg acaatttacc g 31
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gggg嗎ctcg aattgacata agcctg 26
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<212> DNA <213>人工序列
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ggggagctcc atcgatttat tatgacaact tgacggc 37
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<400> 4
gggggatccg ctaatcttat ggataaaaat g 31
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ggggaattcg cacgaactgg cacatttgct gg 32
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gggctcgagg gaaaatgctg cgctcagtac
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gggctcgaga tcataacccg tatgtgcaac
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gggggtaccg gtgaatatgc agcggagatt c
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atgtctgaat tagttgtttt c
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caacgtatca gtcgggcggc c
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gttcgatcga tttctggata g
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cgacccacag gaactgatca c <210> 14
說明書第17/19頁
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attcaaacag ggttctggcg tc
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tctcacatgg gccttgcggc ac
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atgaaattcg cctcaatccc g
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atgtttgaca gcttatcatc gataagcttt aatgcggtag tttatcacag tatggacagc 60 aagcgaaccg g 71
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ttgattggct ccaattcttg gagtggtgaa tccgttagcg aggtgccgcc tcagaagaac 60tcgtcaagaa g 71
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taagggcacc aataactgcc ttaaaaaaat tacgccccgc cctgccactc tatggacagc 60 aagcgaaccg g 71
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<212> DNA <213>人工序列
<400> 20
gcgtattttt tgagttatcg agattttcag gagctaagga agctaaaatg tcagaagaac 60 tcgtcaagaa g 7權(quán)利要求
1、一種用于重組工程的大腸桿菌工程菌，其特征在于，是將來源于大腸桿菌的阿拉伯糖操縱元的調(diào)節(jié)基因araC，阿拉伯糖操縱元的啟動(dòng)子pBAD，來源于λ噬菌體的重組酶基因redα、red β和gam，來源于大腸桿菌recA基因和慶大霉素抗性基因Gm，一起整合至大腸桿菌DH10B的基因組中的endA基因區(qū)域而獲得；其中redα，redβ，gam和recA由pBAD啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)。
2、 如權(quán)利要求1所述的大腸桿菌工程菌，是大腸埃希氏菌(Esc;^ c/^/flco//)CGMCC No. 3192或其變異體。
3、 如權(quán)利要求2所說的大腸桿菌工程菌，其特征在于，該菌株含有來源于X噬菌體的重組 酶基因reda, red(3和gam和來源于大腸桿菌recA基因。
4、 如權(quán)利要求1或3所說的大腸桿菌工程菌，其特征在于，reda, re鄰和gam和recA基 因受受由L-阿拉伯糖誘導(dǎo)的pBAD所驅(qū)動(dòng)。
5、 如權(quán)利要求4^f說的大腸桿菌工程菌，其特征在于，pBAD啟動(dòng)子受araC基因所調(diào)節(jié)， araC基因在L-阿拉伯糖存在時(shí)才發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。
6、 如權(quán)利要求5所說的方法，其特征在于，重組酶可催化DNA短片段之間的同源重組， 即重組工程。
7、 如權(quán)利要求1所說的大腸桿菌工程菌，其特征在于，araC， pBAD， reda， re鄰，gam和 recA基因，整合至大腸桿菌DH10B基因組中的endA基因區(qū)域，endA基因被去除。
8、 如權(quán)利要求l所說的大腸桿菌工程菌,其特征在于，慶大霉素抗性基因Gm和araC，pBAD， reda， re鄰，gam和recA基因連接在一起，作為基因整合菌株的篩選標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株用于重組工程的大腸桿菌CGMCC No.3192及其變異體。該菌株是將行使重組工程的基因片段，即來源于大腸桿菌的阿拉伯糖操縱元的調(diào)節(jié)基因araC，阿拉伯糖操縱元的啟動(dòng)子pBAD，來源于λ噬菌體的重組酶基因redα，redβ和gam，來源于大腸桿菌recA基因和慶大霉素抗性基因(Gm)一起，整合至大腸桿菌DH10B基因組中的endA基因區(qū)域而獲得。其中redα，redβ，gam和recA受由L-阿拉伯糖誘導(dǎo)的pBAD所驅(qū)動(dòng)。重組酶可催化DNA短片段之間的同源重組，即重組工程。DNA片段長度約為50個(gè)堿基對(duì)。以本菌株進(jìn)行重組工程的操作簡便，重組效率高，可成為通用的重組工程用菌株。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101633901SQ200910184219
公開日2010年1月27日 申請(qǐng)日期2009年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月14日
發(fā)明者杰 宋, 尚廣東, 黃慧穎 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)