Cdkn1b基因突變檢測(cè)特異性引物和液相芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種CDKN1B基因突變檢測(cè)液相芯片和特異性引物，該液相芯片主要包括有：每種由5’端的tag序列和3’端針對(duì)目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列為：針對(duì)G-79A位點(diǎn)的SEQ?ID?NO.7及SEQ?ID?NO.8，針對(duì)G-838T位點(diǎn)的SEQ?ID?NO.9及SEQ?ID?NO.10，和/或針對(duì)T326G位點(diǎn)的SEQ?ID?NO.11及SEQ?ID?NO.12；有anti-tag序列包被的微球；擴(kuò)增引物。本發(fā)明所提供的檢測(cè)液相芯片的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序法的吻合率高達(dá)100％，實(shí)現(xiàn)多個(gè)突變位點(diǎn)的野生型和突變型并行檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】CDKN1B基因突變檢測(cè)特異性引物和液相芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種⑶KNlB基因突變檢測(cè)特異性引物和液相芯片。
【背景技術(shù)】[0002]Q3KN1B基因全稱周期蛋白依賴激酶抑制因子IB (cyclin dependentkinaseinhibitor IB, CDKN1B)，又稱為 p27，Kipl，定位于 12 號(hào)染色體 12ρ13.1_ρ12 短臂上，是一種調(diào)控細(xì)胞周期并抑制細(xì)胞分裂的重要基因。CDKNlB基因編碼的P27蛋白為細(xì)胞周期素(cyclin)依賴性蛋白激酶抑制因子，其編碼的蛋白質(zhì)含有198個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量約27X 103，由2個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。P27蛋白質(zhì)N端沒(méi)有結(jié)構(gòu)鋅指的結(jié)構(gòu)域，C端有2個(gè)分開(kāi)的核定位信號(hào)。p27主要與cyclin結(jié)合而發(fā)揮對(duì)cyclin2⑶K的抑制作用，具有多種生物學(xué)功能:(I)可直接抑制cyclin2CDK復(fù)合物的生物學(xué)活性，從而阻止細(xì)胞由Gl期向S期的轉(zhuǎn)變，同時(shí)還可作為細(xì)胞外刺激信號(hào)的潛在媒介來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期。(2)促進(jìn)細(xì)胞分化，介導(dǎo)細(xì)胞間黏附及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Gardner等發(fā)現(xiàn)，缺氧可誘導(dǎo)p27的產(chǎn)生，抑制⑶K2的活性，從而阻滯細(xì)胞周期，如減少或清除P27將清除缺氧所致的Gl期阻滯，但也有p27抑制細(xì)胞凋亡的報(bào)道。P27誘導(dǎo)還可抑制細(xì)胞凋亡，可能與細(xì)胞類型、生長(zhǎng)狀態(tài)及其惡性化與否有關(guān)。(3)與細(xì)胞衰老有關(guān)。Tsukiyama等發(fā)現(xiàn)，⑶4與⑶8_的胸腺細(xì)胞和激活的成熟T細(xì)胞的P27表達(dá)下降，人為上調(diào)p27表達(dá)后，可引起胸腺細(xì)胞發(fā)育障礙和成熟T細(xì)胞增殖能力下降，推測(cè)P27表達(dá)下降對(duì)T細(xì)胞的發(fā)育、增殖及免疫反應(yīng)是必需的。研究表明，pRb導(dǎo)致細(xì)胞衰老可因p27表達(dá)減弱而喪失,pRb可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)上調(diào)p27表達(dá),并特異性地抑制CDK2活性來(lái)延長(zhǎng)細(xì)胞周期阻滯，從而實(shí)現(xiàn)其誘導(dǎo)衰老的作用。p27作為細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為是一種抑癌基因。大量研究發(fā)現(xiàn)，P27基因多態(tài)性位點(diǎn)與甲狀腺乳頭狀癌、心肌梗塞、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌的發(fā)生呈現(xiàn)顯著相關(guān)性。
[0003]目前，⑶KNlB基因突變檢測(cè)方法主要有:PCR-RFLP技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)和Affymetrix芯片技術(shù)，PCR-RFLP法是基于基因突變?cè)斐傻南拗菩詢?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的改變，如位點(diǎn)丟失或產(chǎn)生新位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增某一特定片段，再用限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳觀察片段的大小，這種方法用于檢測(cè)酶切位點(diǎn)改變的基因突變，可直接判斷基因型，但該法不能用于沒(méi)有產(chǎn)生新酶切位點(diǎn)的基因突變檢測(cè)。熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高的特點(diǎn)，但也存在樣品易污染、假陽(yáng)性率高的缺點(diǎn)，且每次只能檢測(cè)一種突變類型。雖然高通量是Affymetrix芯片技術(shù)比較成熟，然而該芯片技術(shù)對(duì)于中低密度的臨床診斷型芯片并不合適，很難在同一個(gè)反應(yīng)體系中擴(kuò)展檢測(cè)眾多生物學(xué)性狀相關(guān)的SNP或標(biāo)簽SNP。另外，Affymetrix芯片主要在表達(dá)譜芯片上比較強(qiáng)，物種較多，在SNP芯片上相對(duì)較弱，而且檢測(cè)價(jià)格昂貴，并不能滿足實(shí)際需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是提供⑶KNlB基因突變檢測(cè)液相芯片，該液相芯片可用于單獨(dú)或并行檢測(cè)CDKNlB基因三種常見(jiàn)基因型G-79A、G-838T和T326G的野生型和突變型。
[0005]實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0006]一種⑶KNlB基因突變檢測(cè)液相芯片，包括有:
[0007](A).針對(duì)⑶KNlB基因不同突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物對(duì):每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對(duì)目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對(duì)G-79A位點(diǎn)的SEQ ID N0.7及SEQ ID N0.8，針對(duì)G-838T位點(diǎn)的 SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10，和 /或針對(duì)T326G位點(diǎn)的 SEQ ID N0.11 及SEQ ID N0.12 ；所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.6 ；
[0008](B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.13~SEQ IDN0.18,且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對(duì)；
[0009]( C).用于擴(kuò)增出需要檢測(cè)的、具有相應(yīng)突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。
[0010]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述擴(kuò)增引物為:針對(duì)G-79A位點(diǎn)的SEQ ID N0.19及SEQID N0.20，針對(duì) G-838T 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.21 及 SEQ ID N0.22，和 / 或針對(duì) T326G 位點(diǎn)的SEQ ID N0.23 及 SEQID N0.24。
[0011]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述ASPE引物為:針對(duì)G-79A位點(diǎn)的由SEQ ID N0.1和SEQID N0.7組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.8組成的序列，針對(duì)G-838T位點(diǎn)的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.9組成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.10組成的序列，和/或針對(duì)T326G位點(diǎn)的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.11組成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.12組成的序`列。
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供用于CDKNlB基因突變檢測(cè)的特異性引物。
[0013]實(shí)現(xiàn)上述目的技術(shù)方案如下。
[0014]用于CDKNlB基因突變檢測(cè)的特異性引物，所述特異性引物序列為:針對(duì)G-79A位點(diǎn)的 SEQ ID N0.7 及 SEQ ID N0.8，針對(duì) G-838T 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.9 及 SEQ ID N0.10，和/ 或針對(duì) T326G 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12。
[0015]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于:
[0016]1.本發(fā)明所提供的CDKNlB基因突變檢測(cè)液相芯片的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序法的吻合率高達(dá)100%。且檢測(cè)所需要的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測(cè)序技術(shù)，特別符合實(shí)際應(yīng)用需要。所制備的CDKNlB基因突變檢測(cè)液相芯片具有非常好的信號(hào)-噪聲比，并且所設(shè)計(jì)的探針以及ant1-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)，tag標(biāo)簽序列、ant1-tag標(biāo)簽序列的選取以及tag標(biāo)簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免交叉反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)多個(gè)突變位點(diǎn)的并行檢測(cè)。
[0017]2.本發(fā)明通過(guò)發(fā)明人長(zhǎng)期積累的設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)和大量的實(shí)驗(yàn)操作，從眾多的特異性引物中選取了最優(yōu)的組合。本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識(shí)別目標(biāo)檢測(cè)的突變位點(diǎn)，準(zhǔn)確區(qū)分各種型別的基因型；在同一個(gè)反應(yīng)體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標(biāo)檢測(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之間基本上不存在交叉反應(yīng)，檢測(cè)特異性好，交叉反應(yīng)率低于3% ;除了能夠檢測(cè)單個(gè)位點(diǎn)突變情況，也能夠同時(shí)并行檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)的突變情況，檢測(cè)效果一致。
[0018]3.本發(fā)明的檢測(cè)方法步驟簡(jiǎn)單，3種突變位點(diǎn)檢測(cè)可通過(guò)一步PCR即可完成3條含有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過(guò)程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測(cè)準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的同時(shí)定性、定量分析特征。
[0019]4.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，同時(shí)對(duì)現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備微球能適用于不同的檢測(cè)項(xiàng)目，具有很強(qiáng)的拓展性。檢測(cè)的熒光信號(hào)值大大提高，從而使得檢測(cè)的靈敏度進(jìn)一步得到提高，信噪比增強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例1⑶KNlB基因突變檢測(cè)液相芯片，主要包括有:
[0021]一、ASPE 引物
[0022]針對(duì)CDKNlB基因三種常見(jiàn)基因型G-79A、G-838T和T326G的野生型和突變型，分別設(shè)計(jì)特異性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示:
[0023]表1⑶KNlB基因的ASPE引物序列(tag序列+特異性引物序列)
[0024]
【權(quán)利要求】
1.一種⑶KNlB基因突變檢測(cè)液相芯片，其特征是，包括有: (A).針對(duì)CDKNlB基因不同突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物對(duì):每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對(duì)目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對(duì)G-79A位點(diǎn)的SEQ ID N0.7及SEQ ID N0.8，針對(duì)G-838T位點(diǎn)的SEQ ID N0.9 及 SEQ ID N0.10，和 / 或針對(duì) T326G 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12 ；所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.6 ； (B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.13~SEQ ID N0.18，且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對(duì)； (C).用于擴(kuò)增出需要檢測(cè)的、具有相應(yīng)突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CDKNlB基因突變檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述擴(kuò)增引物為:針對(duì) G-79A 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20，針對(duì) G-838T 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.21 及SEQ IDN0.22，和 / 或針對(duì) T326G 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.23 及 SEQ ID N0.24。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的CDKNlB基因突變檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述ASPE引物為:針對(duì)G-79A位點(diǎn)的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.8組成的序列，針對(duì)G-838T位點(diǎn)的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.9組成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.10組成的序列，和/或針對(duì)T326G位點(diǎn)的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.11組成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.12組成的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的CDKNlB基因突變檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述間隔臂為5 — 10個(gè)T。
5.用于CDKNlB基因突變檢測(cè)的特異性引物，其特征是，所述特異性引物為:針對(duì)G-79A位點(diǎn)的 SEQ ID N0.7 及 SEQ ID N0.8`，針對(duì) G-838T 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.9 及 SEQ ID N0.10，和 / 或針對(duì) T326G 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103865990SQ201210545906
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月14日
【發(fā)明者】劉麗, 許昌有 申請(qǐng)人:益善生物技術(shù)股份有限公司