專利名稱：一種ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，特別涉及一種ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株及其構建方法。
背景技術：
神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病是一類疾病，包括帕金森、阿爾茨海默等疾病，目前尚無有效、特異療法，干細胞移植替代療法具有良好的前景。移植入體內(nèi)干細胞來源的神經(jīng)元必須能與宿主神經(jīng)系統(tǒng)存留的神經(jīng)元之間建立有功能的突觸聯(lián)系，才能恢復突觸信息的傳遞。目前的多種研究只是在形態(tài)學方面提供了間接證據(jù)，尚未在功能上尤其是傳遞信息的突觸層
面闡明該問題。光遺傳學技術的發(fā)展可以解決該問題。利用遺傳學技術使細胞表達光敏感蛋白，可實現(xiàn)對細胞功能的光學控制，斯坦福大學的Deisseroth教授等將這種結合光學和遺傳學結合的技術稱為光遺傳學技術。光敏感蛋白是能夠被光激活的一類膜蛋白，廣泛分布于原核生物、植物以及動物的視覺系統(tǒng)中，目前在光控神經(jīng)元研究中廣泛應用的是光敏感蛋白(Channelrhodopsin-2,簡稱ChR2)。ChR2是從單細胞綠藻中分離出來的一種感光性膜表達陽離子通道蛋白，能夠通過基因轉染技術表達在神經(jīng)元的細胞膜上，當在低能量470nm藍光瞬間(5-15ms)照射下，ChR2通道打開，Na+、Ca2+等陽離子進入胞內(nèi)引起細胞去極化從而產(chǎn)生動作電位，而且不會影響神經(jīng)元生物活性，因此是目前最常用的光敏感蛋白。通過基因轉染，使干細胞同時穩(wěn)定表達ChR2_GFP，其中GFP (綠色熒光蛋白，英文為green fluorescent protein,簡稱GFP)用于示蹤干細胞,ChR2用于刺激細胞；移植入體內(nèi)后，干細胞來源的神經(jīng)元穩(wěn)定表達ChR2和GFP，通過GFP示蹤其位置，同時470nm激光光刺激表達ChR2的干細胞分化來源神經(jīng)元細胞，同時通過膜片鉗技術記錄宿主神經(jīng)元的突觸后電流，研究移植干細胞來源的神經(jīng)元與宿主神經(jīng)元細胞的功能整合，為臨床干細胞移植治療變性疾病提供理論依據(jù)。然而，快速構建、篩選重組細胞株不是一件容易的事，提高重組基因工程化神經(jīng)干細胞株的構建篩選效率也一直是重組干細胞實驗的重要內(nèi)容之一，一種好的構建、篩選方法可以節(jié)省大量的人力、物力，并加快科學研究的步伐。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種ChR2_GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株，所述細胞株為能穩(wěn)定表達光敏感蛋白(channelrhodopsin-2, ChR2)和綠色突光蛋白(greenfluorescent protein, GFP)的重組 C17. 2 神經(jīng)干細胞株。本發(fā)明的另一目的是提供一種構建ChR2_GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株的方法，包括如下步驟第一步，重組慢病毒的構建和篩選接種293FT細胞于加有10%FBS+DMEM培養(yǎng)基的24孔板中，每孔細胞接種細胞數(shù)為I X IO5個，然后用慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锖虲hR2-GFP慢病毒表達質(zhì)粒共轉染所述293FT細胞,24小時換為含1%FBS DMEM培養(yǎng)液，48小時5000rpm離心5min收集培養(yǎng)液上清，0. 45 u m的PVDF膜過濾所述上清得重組慢病毒液。以標準病毒液I X IO8Cfu / L為對照，將重組慢病毒液和標準病毒液按感染復數(shù)值分別設5個梯度1、3、5、10和20，感染293FT細胞并于24小時后根據(jù)綠色熒光細胞的強度和數(shù)量確定病毒滴度，當表達GFP的細胞超過95%、慢病毒液滴度達I. OX IO8Cfu / L的重組慢病毒液用于下一步實驗。第二步，重組C17. 2神經(jīng)干細胞株的構建和篩選C17. 2神經(jīng)干細胞株用10%FBS(胎牛血清)+5%馬血清+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37°C、5%C02 6孔板細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細胞至50%融合時每孔更換Iml新的10%FBS (胎牛血清)+5%馬血清+DMEM培養(yǎng)基，加入Iul所述重組慢病毒液，同時加入病毒感染輔助劑Polybrene使終濃度為8 u g/ml，轉染6小時后，換為DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞80%_90%貼壁時以密度2X IO4 / ml傳代至IOcm細胞培養(yǎng)皿中。在熒光顯微鏡下在所述IOcm細胞培養(yǎng)皿的底部標記表達GFP的細胞群，PBS清洗3遍后，將0. 05%胰酶-EDTA滴在剪成直徑3mm的無菌濾紙片上，含有胰酶的濾紙片貼在已經(jīng)標記GFP的細胞群上面，370C 3min后，將濾紙片加入新的含有10%FBS DMEM培養(yǎng)基的IOcm平皿中，終止消化，輕輕吹打，使黏附在濾紙片的細胞分散在平皿中，4天后，通過FACS分選出表達GFP 0.5%比率的細胞，并以I個細胞/孔的密度傳至96孔板中。再通過免疫熒光雙標檢測和全細胞對光反應膜片鉗鑒定獲得重組ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株。本發(fā)明中，ChR2_GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株可以同時穩(wěn)定表達ChR2_GFP，且可以穩(wěn)定傳代，并且470nm藍光刺激能引起細胞產(chǎn)生內(nèi)向電流。本發(fā)明方法構建重組干細胞，尤其是利用濾紙片消化法提高了 GFP陽性細胞的比率，有利于流式(FACS)分選，提高了實驗效率。本發(fā)明的細胞株可用于移植干細胞分化來源的神經(jīng)元與宿主神經(jīng)系統(tǒng)功能整合的在體及離體研究，為干細胞移植后分化來源的神經(jīng)元與宿主神經(jīng)系統(tǒng)功能整合的研究提供一個良好的平臺。


圖I為本發(fā)明ChR2_GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株的光學顯微鏡圖；圖2為本發(fā)明免疫熒光雙標檢測ChR2_GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株表達ChR2-GFP蛋白和神經(jīng)干細胞標記物Nestin蛋白的熒光圖；圖3為本發(fā)明全細胞對光反應膜片鉗鑒定ChR2_GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株的對470nm藍光刺激反應能力的電流具體實施例方式下面將結合實施例和附圖來詳細說明本發(fā)明，這些實施例和附圖僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應用范圍。本發(fā)明不限于下述實施方式或?qū)嵤├膊贿`背本發(fā)明精神所做出的修改及變形，均應包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本發(fā)明構建ChR2_GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株實驗例第一步，重組慢病毒的構建和篩選接種293FT細胞于加有10%FBS+DMEM培養(yǎng)基的24孔板中，每孔細胞接種細胞數(shù)為I X IO5個，然后用慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锖虲hR2-GFP慢病毒表達質(zhì)粒(購買于Addgene公司)共轉染293FT細胞；24小時換為含1%FBS DMEM培養(yǎng)液；48小時收集細胞，5000rpm離心5min, 0. 45 u m的PVDF膜過濾上清后用作待測病毒液(重組慢病毒液)；以標準病毒液IXlO8Cfu / L為對照，將待測病毒液和標準病毒液按感染復數(shù)值分別設5個梯度1、3、5、10和20，感染293T細胞并于24小時觀察綠色熒光細胞的強度和數(shù)量以確定病毒滴度，將表達GFP的細胞超過95%，病毒液滴度達I. OX IO8Cfu / L的重組慢病毒液用于下一步實驗。
第二步，轉導C17. 2神經(jīng)干細胞株，熒光活化細胞分選系統(tǒng)(fluorescenceactivated cell sorting,簡稱FACS)篩選穩(wěn)轉細胞株C17. 2神經(jīng)干細胞株用10%FBS(胎牛血清)+5%馬血清+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37°C、5%C02 6孔板細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細胞至50%左右融合，首先換為lmllO%FBS (胎牛血清)+5%馬血清+DMEM培養(yǎng)基，再取Iul (I.OX IO8Cfu / L)含有ChR2_GFP基因的慢病毒加入培養(yǎng)液 中，同時加入病毒感染輔助劑Polybrene(終濃度8iig / ml )，轉染6小時后，換為正常DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，細胞長滿后傳代至IOcm細胞培養(yǎng)皿中(2X IO4 / ml)，同時在熒光顯微鏡下在IOcm平皿的底部標記表達GFP的細胞群，然后PBS清洗3遍，然后將0. 05%胰酶-EDTA(Gibco)滴在剪成直徑3mm的無菌濾紙片上，含有胰酶的濾紙片貼在已經(jīng)標記GFP的細胞群上面，37°C 3min后，將濾紙片加入新的含有10%FBS DMEM培養(yǎng)基的IOcm平皿中，終止消化，輕輕吹打，使黏附在濾紙片的細胞分散在平皿中，4天后，通過FACS分選出表達GFP 0. 5%比率的細胞，并以I個細胞/孔的密度傳至96孔板中。FACS分選出的ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株的光學顯微鏡圖如圖I所示，呈單克隆樣成長。將分選的細胞進行免疫熒光雙標檢測ChR2_GFP蛋白的表達，實驗方法為a. ChR2-GFP的基因工程化干細胞以I X IO5 / ml的密度接種于預先放入滅菌的直徑為12mm的圓玻璃爬片的24孔板內(nèi)，用固定液4%多聚甲醛溶液固定，再棄固定液，PBS振洗 3 X5min。b.每孔加 200 V- I 4°C保存的 0. 1% triton,室溫孵育 IOmin, PBS 振洗 3X5min。c.每孔加200 U I濃度為10%正常山羊血清工作液，室溫孵育30min。d.吸去多余液體,加300 ii I含有1:200 Rabbit-anti_GFP—抗(碧云天生物技術研究所)和 1:300 Mouse-anti-Nestin (Abeam) 一抗，37°C孵育 Ih 后，4°C過夜。e.次日，PBS 振洗 3X5min。f.加入300 ill I 200的FITC-標記的山羊抗兔IgG和Cy3_標記的羊抗小鼠二抗，37°C孵育lh。g. PBS 振洗 3 X 5min。h. DAPI 染色后，PBS 振洗 3 X 5min。i. GVA水溶性封片劑封片，Olympus DP71數(shù)碼顯微照相機照相。免疫熒光雙標檢測ChR2_GFP蛋白的表達的熒光圖如圖2所示，藍色熒光為細胞核，綠色熒光為GFP蛋白即說明了 ChR2-GFP蛋白的表達，紅色熒光為神經(jīng)干細胞標記物Nestin蛋白的表達。由此說明成功獲得ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株。將分選的細胞進行全細胞對光反應膜片鉗鑒定對光反應能力，實驗方法為在暗室內(nèi)將細胞爬片置于灌流槽中，用室溫下氧飽和的細胞外液灌流(l_2ml/min)。選擇表面光潔、折光性強的細胞進行全細胞膜片鉗實驗，玻璃微電極拉制好并充灌適量的電極內(nèi)液(葡萄糖酸鉀 140mM, MgCl2 2mM, K2ATP2mM, EGTA I. ImM, HEPES 10mM)，調(diào)節(jié)微操縱器，使電極尖端接近細胞，利用特定的測試方波電脈沖形成封接，Giga歐(IO9 Q )封接完成后穩(wěn)定Imin,輕輕吸破細胞膜，形成全細胞膜片鉗模式，細胞穩(wěn)定2min后，立即記錄其靜息膜電位(RMP)、膜電容(Cm)及膜阻抗。電壓鉗模式下將膜電位鉗制在_25mV，同時給予470nm藍光刺激，記錄細胞對光反應電流。細胞對470nm藍光刺激反應能力的電流圖如圖3所示，光反應電流最大可為150pA，也說明成功獲得ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技 術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。
權利要求
1.一種ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株，其特征在于所述細胞株為能穩(wěn)定表達光敏感蛋白(ChR2)和綠色熒光蛋白(GFP)的重組C17. 2神經(jīng)干細胞株。
2.—種構建權利要求I所述的ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株的方法，其特征在于包括如下步驟 第一步，重組慢病毒的構建和篩選 接種293FT細胞于加有10%FBS+DMEM培養(yǎng)基的24孔板中，每孔細胞接種細胞數(shù)為I X IO5個，然后用慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锖虲hR2-GFP慢病毒表達質(zhì)粒共轉染所述293FT細胞,24小時換為含1%FBS DMEM培養(yǎng)液，48小時5000rpm離心5min收集培養(yǎng)液上清，O. 45 μ m的PVDF膜過濾所述上清得重組慢病毒液。
以標準病毒液I X IO8Cfu / L為對照，將所述重組慢病毒液和標準病毒液按感染復數(shù)值分別設5個梯度1、3、5、10和20，感染293FT細胞并于24小時后根據(jù)綠色熒光細胞的強度和數(shù)量確定病毒滴度，當表達GFP的細胞超過95%、慢病毒液滴度達I. OX IO8Cfu / L的重組慢病毒液用于下一步實驗。
第二步，重組C17. 2神經(jīng)干細胞株的構建和篩選 C17. 2神經(jīng)干細胞株用10%FBS(胎牛血清)+5%馬血清+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37°C、5%C026孔板細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細胞至50%融合時每孔更換Iml新的10%FBS (胎牛血清)+5%馬血清+DMEM培養(yǎng)基，加入Iul所述重組慢病毒液，同時加入病毒感染輔助劑Polybrene使終濃度為8 μ g/ml，轉染6小時后，換為DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞80%_90%貼壁時以密度2 X IO4 /ml傳代至IOcm細胞培養(yǎng)皿中。
在熒光顯微鏡下在所述IOcm細胞培養(yǎng)皿的底部標記表達GFP的細胞群，PBS清洗3遍后，將O. 05%胰酶-EDTA滴在剪成直徑3mm的無菌濾紙片上，含有胰酶的濾紙片貼在已經(jīng)標記GFP的細胞群上面，37°C 3min后，將濾紙片加入新的含有10%FBS DMEM培養(yǎng)基的IOcm平皿中，終止消化，輕輕吹打，使黏附在濾紙片的細胞分散在平皿中，4天后，通過FACS分選出表達GFP O. 5%比率的細胞，并以I個細胞/孔的密度傳至96孔板中。再通過免疫熒光雙標檢測和全細胞對光反應膜片鉗鑒定獲得重組ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株及其構建方法，所述細胞株為能穩(wěn)定表達光敏感蛋白(ChR2)和綠色熒光蛋白(GFP)的重組C17.2神經(jīng)干細胞株；通過構建重組慢病毒、轉導C17.2神經(jīng)干細胞株以及篩選獲得重組ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細胞株；本發(fā)明的細胞株可用于移植干細胞分化來源的神經(jīng)元與宿主神經(jīng)系統(tǒng)功能整合的在體及離體研究，為干細胞移植后分化來源的神經(jīng)元與宿主神經(jīng)系統(tǒng)功能整合的研究提供一個良好的平臺；本發(fā)明構建重組干細胞方法，尤其是利用濾紙片消化法，提高了GFP陽性細胞的比率，有利于流式FACS分選，大大提高了實驗效率。
文檔編號C12N5/10GK102978164SQ201210459119
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月14日 優(yōu)先權日2012年11月14日
發(fā)明者王少軍 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院