專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)水稻粒型的分子標(biāo)記方法、試劑盒和引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻品種資源特性的檢測(cè)技術(shù)，特別涉及檢測(cè)水稻粒型基因的分子標(biāo)記標(biāo)記方法、試劑盒和引物。
背景技術(shù)：
水稻谷粒內(nèi)、外稃的兩緣相互勾合包被著糙米，在籽粒形成中起著重要的作用，一方面合成同化物，另一方面對(duì)籽粒進(jìn)行塑型，影響稻米粒型、灌漿充實(shí)度和千粒重等。通過(guò)從水稻花發(fā)育突變體中分離克隆到相關(guān)的基因，以及利用已克隆的植物花發(fā)育基因的保守序列為探針從水稻基因組文庫(kù)和CDNA文庫(kù)篩選分離到與水稻花發(fā)育有關(guān)的A、B、C、D、E類(lèi)基因。依據(jù)花器官突變體表型與相關(guān)基因的關(guān)系總結(jié)出調(diào)控單子葉植物花形態(tài)建成遺傳控制的AB⑶E模型假說(shuō)。發(fā)明內(nèi)容
為了能檢測(cè)出水稻粒型性狀的基因型，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供用于檢測(cè)水稻粒型的特異性分子標(biāo)記，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供采用上述的特異性分子標(biāo)記檢測(cè)水稻粒型的分子標(biāo)記方法，本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供采用上述的特異性分子標(biāo)記檢測(cè)水稻粒型的分子標(biāo)記試劑盒。采用上述的特異性分子標(biāo)記檢測(cè)水稻植株粒型性狀的基因型，具有準(zhǔn)確性高，操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案用于檢測(cè)水稻粒型的特異性分子標(biāo)記，該特異性分子標(biāo)記具有正向引物和反向引物， 正向引物自5'端至:V端的核苷酸序列為AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5' 端至3'端的核苷酸序列為T(mén)CTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案 檢測(cè)水稻粒型的分子標(biāo)記方法，該方法按以下步驟進(jìn)行提取水稻DNA，采用Caps分子標(biāo)記mg進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Caps分子標(biāo)記mg包括正向引物和反向引物，正向引物自5'端至 3'端的核苷酸序列為AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自Y端至3'端的核苷酸序列為T(mén)CTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG，將PCR產(chǎn)物用Bsrh I酶切后，電泳檢測(cè)1)檢測(cè)水稻粒型性狀顯性純合基因的特異性酶切片段分別為309bp和488bp；2)檢測(cè)水稻粒型性狀隱性純合基因的特異性酶切片段分別為63bp，241bp，488bp；3)檢測(cè)水稻粒型性狀雜合基因的特異性酶切片段分別為63bp，241bp，309bp，488bp。
作為優(yōu)選，上述提取水稻DNA的方法包括以下步驟1)取新鮮水稻葉片3-5cm放入2.OmL離心管中，加入液氮并用竹筷研磨成粉末；2)加入500 μ I 的 TPS 抽提液，TPS 抽提液包括 IOOmM Tris-HCl, IOmM EDTA，pH8. O, IM KCl，滅菌后備用，65°C空氣浴中放置lh，每隔30min顛倒混勻離心管中的沉淀；3)12000rpm離心15min，移上清液約350μ L于新離心管中，加入等體積的異丙醇，放入冰箱 IOmin,再 IlOOOrpm 離心 IOmin ；4)棄上清液,再沉淀，加入Iml70%酒精,8000rpm離心5min ；5)棄上清液，室溫下白色的DNA沉淀風(fēng)干后溶解于100μ L滅菌ddH20，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 作為優(yōu)選，上述的PCR反應(yīng)體系如下DNA模板I μ I2.5mM dNTPs 5 μ I 10XK0D buffer 12. 5μ I ΙΟμΜ正向引物 Ιμ ΙΟμΜ反向引物 Ιμ IU/ μ I KOD SI O. 5 μ I H2O4 μ Io
作為優(yōu)選，上述的PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性60sec，65°C退火 60sec，72°C延伸120sec，共34個(gè)循環(huán);最后72°C延伸IOmin0
為了實(shí)現(xiàn)上述的第三個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案檢測(cè)水稻粒型的分子標(biāo)記試劑盒，該試劑盒包括Caps分子標(biāo)記mg, Caps分子標(biāo)記mg包括正向引物和反向引物，正向引物自5'端至3'端的核苷酸序列為AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5 '端至3 '端的核苷酸序列為 TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。
本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案，只采取一次PCR和酶切就能檢測(cè)出粒型性狀的基因型，提高了檢測(cè)效率，具有準(zhǔn)確性高，操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。


圖1為特異性分子標(biāo)記mg對(duì)“93-11/浙粳月亮型”雜交后F2分離群體的PCR擴(kuò)增結(jié)果。圖2為PCR產(chǎn)物用沒(méi)srb I酶切結(jié)果。圖中，M代表標(biāo)記(Marker)，93-ll代表水稻品種93-11 ；G代表浙粳月亮型P1代表“93-11/浙粳月亮型”的雜種F1植株；F2代表“93-11/ 浙粳月亮型”的F2植株。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1用于檢測(cè)水稻粒型的特異性分子標(biāo)記，該特異性分子標(biāo)記具有正向引物和反向引物， 正向引物自5'端至3'端的核苷酸序列為AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5' 端至3'端的核苷酸序列為T(mén)CTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。
實(shí)施例2本發(fā)明涉及浙粳月亮型粒型，保藏號(hào)CGMCC No. 5554，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏時(shí)間為2011年12月31日；分類(lèi)命名水稻(Orjza saiira );性狀穩(wěn)定。發(fā)明人在研究中將浙粳月亮型穎殼與秈稻品種93-11 (國(guó)家水稻中期庫(kù)保存號(hào)CN20483)配組，構(gòu)建群體， 分析各個(gè)株系的基因型。在種植上述93-11與浙粳月亮型穎殼雜交后的F2群體，苗期采用特異性分子標(biāo)記mg進(jìn)行水稻粒型基因的檢測(cè)。
一、DNA 提取1.取新鮮水稻葉片3-5cm放入2.OmL離心管中，加入液氮并用竹筷研磨成粉末；2.加入500 μ I 的 TPS 抽提液(IOOmM Tris-HCl，IOmM EDTA, ρΗ8· O, IM KCl，滅菌后備用)，65°C空氣浴中放置lh，每隔30min顛倒混勻離心管中的沉淀；3.12000rpm離心15min，移上清液約350 μ L于新離心管中，加入等體積的異丙醇，放入冰箱 IOmin,再 IlOOOrpm 離心 IOmin ；4.棄上清液，再沉淀，加入Iml70%酒精,8000rpm離心5min ；5.棄上清液，室溫下白色的DNA沉淀風(fēng)干后溶解于100μ L滅菌ddH20，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 二、PCR 擴(kuò)增PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。
I PCR反應(yīng)體系(25 μ I)如下DNA模板I μ IdNTPs (2. 5mM) 5 μ I10XK0D buffer 12. 5μ I mg (正向引物，10 μ Μ) 1μ Img (反向引物，10 μ Μ) I μ IKOD酶(東洋紡公司，IU/ μ I) O. 5 μ IH2O 4 μ I2. PCR反應(yīng)條件引物mg溫度反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性60sec，65°C退火60sec，72°C延伸120sec，共34個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0
三、PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)將擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)溴化乙錠染色后上樣在1%瓊脂糖凝膠上，電泳，在UVP凝膠成像儀上成像。
在F2分離群體中存在兩種表型的植株，從月亮型粒型表型植株中收獲的種子，只有一種隱性純合的月亮型突變表型植株(aa基因型)，后代不發(fā)生分離，都出現(xiàn)突變表型； 從正常表型植株中收獲的種子，有兩種基因型。一種是顯性純合的正常表型植株(AA基因型)，后代不發(fā)生分離，都出現(xiàn)正常表型；另一種是雜合的植株(Aa基因型)，雖然當(dāng)代表現(xiàn)為正常表型，但后代發(fā)生分離，出現(xiàn)正常和月亮型粒型兩種表型。
分別對(duì)F2分離群體中兩種表型的植株進(jìn)行檢測(cè)，用標(biāo)記mg擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物大小為797bp，將PCR產(chǎn)物用Bsrh I酶切后，根據(jù)酶切條帶大小可檢測(cè)AA、Aa和aa三種不同的基因型1)檢測(cè)水稻粒型性狀顯性純合基因的特異性酶切片段分別為309bp和488bp；2)檢測(cè)水稻粒型性狀隱性純合基因的特異性酶切片段分別為63bp，241bp，488bp；3)檢測(cè)水稻粒型性狀雜合基因的特異性酶切片段分別為63bp，241bp，309bp，488bp。
如圖1所示，F(xiàn)2分離群體用標(biāo)記mg擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物大小無(wú)差異。將PCR產(chǎn)物用 Bsrb I酶切后，結(jié)果如圖2所示，泳道3酶切片段與93-11 —致，說(shuō)明這一植株的基因型為 AA ;泳道1、2、4、5、6、8、9、10、11、12酶切片段與G —致，這些植株的基因型均為aa ;泳道7 與F1—致，說(shuō)明這些植株的基因型為Aa。與實(shí)際相符。這說(shuō)明，利用分子標(biāo)記mg能夠準(zhǔn)確檢測(cè)水稻植株的粒型基因 型。序列表〈110〉浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院〈120〉檢測(cè)水稻粒型的分子標(biāo)記方法、試劑盒和弓I物 <160>2<210>1 〈211〉 25 〈212〉引物 〈213〉人工合成 〈400〉 IAAGAACTCAC GGGATGATGA ACTGC 25<210>2 〈211〉 25 〈212〉引 物 〈213〉人工合成 〈400〉 2TCTTGTGATT CAGGTTGCAT TACGG 2權(quán)利要求
1.檢測(cè)水稻粒型的分子標(biāo)記方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn)行提取水稻DNA，采用Caps分子標(biāo)記mg進(jìn)行PCR擴(kuò)增,Caps分子標(biāo)記mg包括正向引物和反向引物,正向引物自5'端至3,端的核苷酸序列為AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5'端至3,端的核苷酸序列為T(mén)CTTGTGATTCAGGTTGCATTACGGJf PCR產(chǎn)物用Bsrh I酶切后，電泳檢測(cè) 1)檢測(cè)水稻粒型性狀顯性純合基因的特異性酶切片段分別為309bp和488bp； 2)檢測(cè)水稻粒型性狀隱性純合基因的特異性酶切片段分別為63bp，241bp，488bp； 3)檢測(cè)水稻粒型性狀雜合基因的特異性酶切片段分別為63bp，241bp，309bp，488bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)水稻粒型的分子標(biāo)記方法，其特征在于提取水稻DNA的方法包括以下的步驟 1)取新鮮水稻葉片3-5cm放入2.OmL離心管中，加入液氮并用竹筷研磨成粉末；2)加入500 ill 的 TPS 抽提液，TPS 抽提液包括 IOOmM Tris-HCl, IOmM EDTA, pH8. 0, IMKCl，滅菌后備用，65°C空氣浴中放置lh，每隔30min顛倒混勻離心管中的沉淀； 3)12000rpm離心15min，移上清液約350y L于新離心管中，加入等體積的異丙醇，放入冰箱 IOmin,再 IlOOOrpm 離心 IOmin ； 4)棄上清液,再沉淀，加入Iml70%酒精,8000rpm離心5min ； 5)棄上清液，室溫下白色的DNA沉淀風(fēng)干后溶解于IOOiiL滅菌ddH20，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)水稻粒型的分子標(biāo)記方法，其特征在于PCR反應(yīng)體系如下 DNA模板I u I 2.5mM dNTPs 5 U IIOXKOD buffer 12. 5u I IOiiM正向引物 IiU IOiiM反向引物 IiU IU/ul KOD SI 0. 5u I H2O4u I0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)水稻粒型的分子標(biāo)記方法，其特征在于PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性60sec，65°C退火60sec，72°C延伸120sec，共34個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸 lOmin。
5.檢測(cè)水稻粒型的分子標(biāo)記試劑盒，其特征在于該試劑盒包括Caps分子標(biāo)記mg,Caps分子標(biāo)記mg包括正向引物和反向引物，正向引物和反向引物，正向引物自5'端至3'端的核苷酸序列為AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5'端至3'端的核苷酸序列為T(mén)CTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。
6.用于檢測(cè)水稻粒型的特異性分子標(biāo)記，該特異性分子標(biāo)記具有正向引物和反向引物，正向引物自5'端至3'端的核苷酸序列為AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5'端至3'端的核苷酸序列為T(mén)CTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻品種資源特性的檢測(cè)技術(shù)，特別涉及檢測(cè)水稻粒型基因的分子標(biāo)記標(biāo)記方法、試劑盒和引物。用于檢測(cè)水稻粒型的特異性分子標(biāo)記，該特異性分子標(biāo)記具有正向引物和反向引物，正向引物自5′端至3′端的核苷酸序列為AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5′端至3′端的核苷酸序列為T(mén)CTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。本發(fā)明只采取一次PCR和酶切就能檢測(cè)出粒型性狀的基因型，提高了檢測(cè)效率，具有準(zhǔn)確性高，操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102994635SQ20121044324
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日
發(fā)明者張小明, 周崖, 葉勝海, 金慶生, 吳慶 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院