專利名稱：轉(zhuǎn)基因玉米bt11品系的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物、試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品檢驗(yàn)技術(shù)方法領(lǐng)域，具體涉及一種食品中轉(zhuǎn)基因玉米BTll品系環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP )引物、試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
玉米是世界上重要的糧食作物之一，其單位面積產(chǎn)量位居榜首。世界范圍內(nèi)玉米害蟲高達(dá)350多種，其中以鱗翅目的玉米螟分布最廣、危害最重，是世界性的重要玉米害蟲，其嚴(yán)重影響著玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。近十多年來，轉(zhuǎn)基因植物培育取得突破，推出了一批新品種，在改善農(nóng)作物生產(chǎn)中發(fā)揮了明顯的作用，也顯露出巨大的潛力。然而，人們對轉(zhuǎn)基因玉米的安全性存在著很多的爭論。面對生物基因工程技術(shù)對我國經(jīng)濟(jì)利益帶來的沖擊和國外轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對生態(tài)環(huán)境和消費(fèi)者可能帶來的風(fēng)險(xiǎn)，對轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行檢測具有重要的 現(xiàn)實(shí)意義。2009年，我國已經(jīng)解除了對玉米進(jìn)口的限制，大批量的玉米已經(jīng)涌入中國。這勢必對我國的農(nóng)業(yè)安全帶來沖擊。Btll轉(zhuǎn)基因玉米品系是瑞士先正達(dá)種子有限公司研發(fā)的產(chǎn)品，是DNA直接轉(zhuǎn)化先天玉米品系H8540，并在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)而出的，具有抗歐洲玉米螟(ECB;0strinianubilalis)的抗性，也可以抗草甘膦除草劑。在2004年4月6日首次獲得中國農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的安全證書，是目前用于加工食品和飼料最多的品系之一。目前，轉(zhuǎn)基因玉米成分檢測方法主要為TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR方法和普通PCR方法。普通PCR方法由于操作繁瑣，污染環(huán)境、靈敏度低等不足已逐漸被實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法所取代。但是TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測對技術(shù)要求相對較高且成本昂貴，目前急需制定在檢驗(yàn)檢疫一線的基層實(shí)驗(yàn)室能夠普遍適用的快速、簡便、準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。國內(nèi)發(fā)布的食品轉(zhuǎn)基因玉米BTll品系特異性檢測標(biāo)準(zhǔn)有GB/T 19495. 5 一 2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸定量PCR檢測方法》、SN/T 1196-2003《玉米中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR檢測方法》、SN/T 1201-2003《植物性飼料中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR檢測方法》和農(nóng)業(yè)部869號公告-3-2007《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲和耐除草劑玉米Btll及其衍生品種定性PCR方法》，這4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)均采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法或普通PCR方法。國外發(fā)布的轉(zhuǎn)基因玉米BTll品系特異性檢測技術(shù)是歐盟發(fā)布的官方檢測方法“Event-specific Method for the Quantification of Maize Line BtlI UsingReal-time PCR(CRLVL10/07VP) ”，該方法采用的是實(shí)時(shí)熒光PCR方法。國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求由于歐盟是最為關(guān)注食品轉(zhuǎn)基因成分的地區(qū)，多年來不斷更新檢驗(yàn)監(jiān)管規(guī)定和檢測技術(shù)要求，因此玉米轉(zhuǎn)基因BTll品系的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法歷來主要依據(jù)歐盟規(guī)定的方法，國內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)也是參考?xì)W盟的技術(shù)文件制定的。目前，轉(zhuǎn)基因玉米BTll品系標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的文獻(xiàn)依據(jù)是歐盟發(fā)布的官方方法“Event-specific Method for the Quantification of MaizeLine Btll Using Real-time PCR(CRLVL10/07VP)’’，國內(nèi)的 GB/T 19495. 5 — 2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸定量PCR檢測方法》也規(guī)定了同樣的技術(shù)內(nèi)容。這些方法采用的均是TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR方法，最低檢出限為O. 5%。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的快速發(fā)展，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為基礎(chǔ)的新型鑒定技術(shù)已日益得到廣泛應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP, Loop-mediated IsothermalAmplification)是在PCR基礎(chǔ)上創(chuàng)建的一種較理想的手段，其特點(diǎn)是①只需一恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性；②高特異性采用六個(gè)區(qū)段，四條引物，擴(kuò)增特異性高，可以根據(jù)是否擴(kuò)增來判斷目標(biāo)基因的存在與否；③快速、高效擴(kuò)增擴(kuò)增在不到Ih即可完成，且產(chǎn)率高；④靈敏度高擴(kuò)增模板可達(dá)10拷貝或更少；⑤鑒定簡便在核酸大量合成時(shí)，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物-焦磷酸鎂沉淀，可用肉眼觀察判斷擴(kuò)增與否；另外，它利用恒溫和低反應(yīng)溫度(63°C)，減少細(xì)胞損傷，檢測人員實(shí)際操作非常簡便?？傮w而言，LAMP法是一種簡便、快速、高特異的基因擴(kuò)增法，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，采用該方法能建立起總成本低廉的檢測體系，在轉(zhuǎn)基因食品檢測等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前尚未發(fā)現(xiàn)LAMP方法應(yīng)用于食品轉(zhuǎn)基因成分檢測的標(biāo)準(zhǔn)化研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案為通過考察并鎖定轉(zhuǎn)基因玉米BTll品系靶基因，轉(zhuǎn)基因玉米BTll品系外源基因和玉米邊界序列(AY123624. I)中的SEQ ID NO 1序列，然后設(shè)計(jì)合成4套特異性LAMP引物，優(yōu)化體系，最后確定一套特異性LAMP引物，其堿基序列如SEQ ID NO 2 7 ;進(jìn)而確定了 LAMP方法的技術(shù)參數(shù)，最后室內(nèi)外驗(yàn)證驗(yàn)證引物特異性、靈敏度、穩(wěn)定性。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下本發(fā)明涉及一種檢測轉(zhuǎn)基因玉米BTll品系的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，其堿基序列為 SEQID NO :2 7，如表 I 表I轉(zhuǎn)基因玉米品系LAMP BTll弓丨物
權(quán)利要求
1.一種檢測轉(zhuǎn)基因玉米BTll品系的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，其特征在于，堿基序列為SEQ ID NO -.2 。
2.—種轉(zhuǎn)基因玉米BTll品系的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測試劑盒，其特征在于，包括檢測引物SEQ ID NO :2 7。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因玉米BTll品系的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測試劑盒，其特征在于，在檢測試劑盒中每 25μ L的LAMP 反應(yīng)體系包括SEQ ID NO :2 3 各 O. 2 μ M、SEQ ID NO :4 5 各 I. 6 μ Μ、SEQ ID NO :6 7 各 0· 8 μ Μ、I X ThermoPol 緩沖液、0. 8mM 甜菜堿、I. 4mM dNTP、8UBst DNA 大片段聚合酶； 其中上述 IXThermoPol 緩沖液為IOmM KCl,20mM pH 8. 8 的 Tris-HCl，IOmM(NH4) 2S04,2mM MgSO4 和 O. l%Triton X-IOO0
4.利用權(quán)利要求2所述試劑盒檢測轉(zhuǎn)基因玉米BTll品系的方法，其特征在于，檢測步驟包括 ①分別提取BTll轉(zhuǎn)基因玉米品系標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品的基因組DNA； ②分別以步驟①精提的DNA作為模板，利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測 每 25yL 的LAMP反應(yīng)體系，其包括DNA 模板 200ng、SEQ ID NO :2 3 各 O. 2 μ M、SEQ IDNO :4 5 各 I. 6 μ M、SEQ ID NO :6 7 各 0· 8 μ Μ、I X ThermoPol 緩沖液、0. 8mM 甜菜堿、I. 4mMdNTP、8U Bst DNA大片段聚合酶、蒸餾水余量； 其中上述 IXThermoPol 緩沖液為IOmM KCl,20mM pH 8. 8 的 Tris-HCl，IOmM(NH4) 2S04,2mM MgSO4 和 O. l%Triton X-IOO ； 反應(yīng)條件為63°C恒溫反應(yīng)60min，80°C下保溫5min ； ③環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法的檢測結(jié)果以肉眼、濁度法或顯色法進(jìn)行判斷。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測轉(zhuǎn)基因玉米BTll品系的方法，其特征在于，所述步驟③中的濁度法利用LAMP實(shí)時(shí)濁度儀完成。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測轉(zhuǎn)基因玉米BTll品系的方法，其特征在于，所述步驟③中的顯色法使用熒光染料SYBR Green I。
全文摘要
本發(fā)明公開一種轉(zhuǎn)基因玉米BT11品系的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物、試劑盒及其應(yīng)用，所述的LAMP檢測所用的引物，其堿基序列如SEQIDNO2~7；采用LAMP檢測技術(shù)，結(jié)合濁度法或顯色法，建立了適用于食品中轉(zhuǎn)基因玉米BT11品系特異性檢測標(biāo)準(zhǔn)方法，本發(fā)明所述方法操作簡單，不依賴昂貴儀器，檢測時(shí)間在1小時(shí)左右，方法靈敏度達(dá)到0.5%，檢測效率達(dá)到傳統(tǒng)PCR方法或熒光定量PCR方法，能夠應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫實(shí)際工作，尤其適用于大量樣品快速初篩和各種基層實(shí)驗(yàn)室食品品質(zhì)監(jiān)控，適合作為行業(yè)推薦性標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102827939SQ201210330429
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者徐君怡, 曹際娟, 鄭秋月, 趙昕 申請人:徐君怡, 曹際娟, 鄭秋月, 趙昕