專利名稱：煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合發(fā)酵香料及其在重組煙葉中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組煙葉添加劑技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合發(fā)酵香料及其在重組煙葉中的應(yīng)用
背景技術(shù)：
重組煙葉又稱再造煙葉或均質(zhì)煙葉，主要由煙末、碎片、煙?；虻痛螣熑~加入膠粘劑和其他添加劑等組成。國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的造紙法薄片生產(chǎn)工藝將煙葉和煙梗中的水溶性物質(zhì)用水萃取，經(jīng)固液分離后，固體部分經(jīng)制漿后再制成紙基，而液體部分則濃縮后回涂到紙基上。用該方法所得到的重組煙葉與作為原料的煙葉、煙?；瘜W(xué)組分差別不大，導(dǎo)致重組煙葉存在雜氣重、刺激性大和口感不適等吸味缺陷，影響了重組煙葉在卷煙產(chǎn)品中的使用效果和添加量。國(guó)內(nèi)通常的做法是采用加料的辦法來改善部分不足之處。煙用較多的煙草、天然植物類提取物一般采用傳統(tǒng)方法制得，即采用單體煙葉或復(fù)配的葉組為原料通過水、醇·提取或分子蒸餾得到，添加后對(duì)卷煙的改善有一定局限，改善程度有限，仍有刺激性大、雜氣多的缺陷。葫蘆巴(Trigonella foenum-graecum L.)為一種藥食兩用植物，葫蘆巴籽及葫蘆巴草都具有特殊的風(fēng)味。食品、煙草工業(yè)中，葫蘆巴籽去雜，破碎后用水蒸氣蒸餾或用超臨界二氧化碳抽提即得葫蘆巴油。產(chǎn)品具有令人愉快的焦糖樣烤香，微甜微苦味。常用于配制可可、咖啡、堅(jiān)果、楓槭和焦糖香韻中。甜椒(Capsicum annuum)是一種蔬菜,果肉厚而脆嫩,富含維生素C,還含有阿魏酸等物質(zhì)。青果含水分93. 9%左右、碳水化合物約3. 8%，富含維生素C ;紅熟果含維生素C最高可達(dá)460毫克；它能增強(qiáng)人的體力，緩解因工作、生活壓力造成的疲勞；含有豐富的維生素C、維生素K，可以防治壞血病，對(duì)牙齦出血、貧血、血管脆弱有輔助治療作用；其特有的味道和所含的辣椒素有刺激唾液分泌的作用，能增進(jìn)食欲，幫助消化，促進(jìn)腸蠕動(dòng)，防止便秘。西紅柿(Solanum Iycopersicum)果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富,具特殊風(fēng)味,含有豐富的胡蘿卜素、維生素C、B族維生素。其中蘋果酸、檸檬酸、糖類有助消化；果酸能降低膽固醇含量；番茄紅素具有很強(qiáng)的抗氧化性；蛋白質(zhì)、纖維素、煙酸、葉酸、維生素E、維生素A、核黃素、阿魏酸、多種微量元素等。通過傳統(tǒng)回流提取所制備的煙葉提取物浸膏，具有煙草固有特殊自然氣息，香氣純正而留長(zhǎng)，具有煙膏香，起增補(bǔ)煙香，增強(qiáng)口感提高品質(zhì)的作用；葫蘆巴提取物浸膏，具有焦糖樣烤香；甜椒、西紅柿提取物，增加甜潤(rùn)感、豐富煙香；但同時(shí)，也具有增加刺激性、增加殘留的負(fù)面效果。微生物在增殖過程中可產(chǎn)生龐大的高活性酶系，如多糖水解酶類、蛋白酶類、酯化酶類、氧化還原酶類及裂合酶類等，在酶促作用、化學(xué)作用及微生物體內(nèi)復(fù)雜代謝的協(xié)同作用下，以煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合提取液為原料發(fā)生分解、降解、氧化、還原、聚合、偶聯(lián)、轉(zhuǎn)化等作用，形成復(fù)雜的低分子化合物，其中包括各種香味化合物，如醇類、醛類、酮類、酸類、脂類、酚類、吡喃類、吡啶類和萜烯類等，這些香氣物質(zhì)是煙草或用于煙草的添加劑的香氣組分，對(duì)重組煙葉煙氣進(jìn)行特征強(qiáng)化、改善口感。采用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)天然煙用生物香料，天然綠色環(huán)保無害，工藝過程簡(jiǎn)單易操作，不產(chǎn)生有毒副產(chǎn)品、無污染等。將煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿提取后通過微生物發(fā)酵技術(shù)制備能提升煙氣質(zhì)、豐富煙香、增加甜潤(rùn)感、掩蓋雜氣、減小刺激的天然復(fù)合發(fā)酵香料及其在重組煙葉中的應(yīng)用，還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)目前重組煙葉存在雜氣重、刺激性大、煙氣薄弱和口感不適等吸味缺陷，提供了一種煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合發(fā)酵香料及其在重組煙葉中的應(yīng)用。本發(fā)明制成的由植生拉烏爾菌生物轉(zhuǎn)化生成煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合發(fā)酵香料，從而改善了重組煙葉刺激大、口感不適的吸味缺陷，能與其它煙用香精香料混合調(diào)配使用。本發(fā)明提供一種植生拉烏爾菌,該菌株名為Raoultella planticola VP4- 4,于2012年I月11日保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2012005，植生拉烏爾菌Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005的生物學(xué)特征是革蘭氏陰性菌，能產(chǎn)酸、使牛奶液化并生成吲哚產(chǎn)生、賴氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)呈陽性；鳥氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)、H2S產(chǎn)生、明膠液化呈陰性；能以單糖，多糖、酯類和氨基酸為唯一碳源生長(zhǎng)，所述植生拉烏爾菌Raoultella planticola VP4-4的分子鑒定特征為其16SrRNA 序列全長(zhǎng) 1408bp, 16S rRNA 序列與 Raoultella planticola 的相似度達(dá)到99.563%。本發(fā)明提供了一種煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合發(fā)酵香料的制備方法，包括以下步驟I)煙葉提取液的制備將煙葉粉碎至5(Γ100目，再將煙末和水按質(zhì)量比I 3(Γ50混合，回流提取廣3h后過濾，重復(fù)f 3次回流提取濾液，合并濾液，即得煙葉提取液，并滅菌備用；2)葫蘆巴提取液的制備將葫蘆巴粉與水按質(zhì)量比I : 2(Γ40混合，磁力攪拌、回流提取f3h后過濾，重復(fù)回流提取f 3次，過濾后合并濾液，即得葫蘆巴提取液，并滅菌備用；3)西紅柿、甜椒混合提取液的制備將西紅柿、甜椒切片，按質(zhì)量比I : 0.5 2混合，再與水按質(zhì)量比I : 2(Γ40混合，回流提取f3h過濾，重復(fù)廣3次回流提取濾液，合并濾液，即得西紅柿、甜椒混合提取液，并滅菌備用；4)將步驟I)、步驟2)和步驟3)中得到的煙葉提取液、葫蘆巴提取液和西紅柿、甜椒混合提取液按I : 0.5 1 O. 5 1的體積比進(jìn)行混合，即得煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿混合提取液；5)菌種活化將植生拉烏爾菌 Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005接種到斜面培養(yǎng)基上，在25 38°C，靜置培養(yǎng)24 72h后得到活化菌種，置于冰箱中；6)制備種子培養(yǎng)液將步驟5)中所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在25 38°C條件下，10(Tl50r/min振蕩培養(yǎng)24h 72h，連續(xù)轉(zhuǎn)接I 3次，制得種子培養(yǎng)液；7)發(fā)酵將種子培養(yǎng)液按體積比1(Γ20%接種到上述步驟4)中的滅菌的煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿混合提取液，接種后的濾液的裝罐量為3(Γ40%，ρΗ5 8，溫度3(T38°C，轉(zhuǎn)速15(T200r/min，不避光條件下發(fā)酵3 8天，得到發(fā)酵液；8)將發(fā)酵液和95%乙醇按體積比I : 3 6，沉淀過夜，500(Tl0000r/min離心l(T20min，過濾后減壓濃縮至相對(duì)密度為I. 0859 I. 1241的浸膏，即得煙葉、葫蘆巴、甜椒、
西紅柿提取物復(fù)合發(fā)酵浸膏。作為優(yōu)選方案，所述步驟5)中，所述斜面培養(yǎng)基為麥芽糖120mL，蔗糖20g/L，瓊脂15g/L。作為優(yōu)選方案，所述步驟6)中，所述種子液培養(yǎng)基組成為木糖醇50g/L，黃豆餅粉10g/L，氯化鈉5g/L。本發(fā)明還提供了一種所得煙葉、可可提取物復(fù)合發(fā)酵香料的應(yīng)用，其特征在于所 述煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合發(fā)酵香料作為天然煙草添加劑加入重組煙葉中，加入重組煙葉中該天然復(fù)合發(fā)酵香料的質(zhì)量比為O. Γ0. 3%。微生物在增殖過程中可產(chǎn)生龐大的高活性酶系，如多糖水解酶類、蛋白酶類、酯化酶類、氧化還原酶類及裂合酶類等，在酶促作用、化學(xué)作用及微生物體內(nèi)復(fù)雜代謝的協(xié)同作用下，以煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合提取液為原料發(fā)生分解、降解、氧化、還原、聚合、偶聯(lián)、轉(zhuǎn)化等作用，形成復(fù)雜的低分子化合物，其中包括各種香味化合物，如醇類、醛類、酮類、酸類、脂類、酚類、吡喃類、吡啶類和萜烯類等，這些香氣物質(zhì)無疑也是煙草或用于煙草的添加劑的香氣組分。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是I、本發(fā)明以天然煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合提取液為碳源、氮源、以及底物，營(yíng)養(yǎng)豐富天然，容易讓微生物酶體系利用來復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)香，所得天然復(fù)合發(fā)酵香料具有天然環(huán)保無害優(yōu)點(diǎn)。2、采用植生拉烏爾菌 Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005來發(fā)酵生產(chǎn)使重組煙葉提升煙氣質(zhì)、豐富煙香、增加焦糖樣烤香、余味甜潤(rùn)、掩蓋雜氣、減小刺激的煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合發(fā)酵香料，改善了重組煙葉刺激大、口感不適的吸味缺陷，能與其它煙用香精香料混合調(diào)配使用。3、本發(fā)明方法工藝過程簡(jiǎn)單，原料為卷煙產(chǎn)品本源煙葉、能應(yīng)用于卷煙中的葫蘆巴香料、來源廣泛的甜椒、西紅柿，有工業(yè)化使用前景。
具體實(shí)施例方式下面列舉一部分實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的有關(guān)技術(shù)問題作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，有必要在此指出以下具體實(shí)施例只是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不代表對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明做出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I本發(fā)明的微生物植生拉烏爾菌Raoultella planticolaVP4_4 CCTCC M 2012005生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)煙葉、可可提取物復(fù)合發(fā)酵香料的制備方法如下I)煙葉提取液的制備將煙葉粉碎至100目，再將煙末和水按質(zhì)量比I : 30混合，回流提取3h后過濾，重復(fù)I次回流提取濾液，合并濾液，即得煙葉提取液，并滅菌備用；2)葫蘆巴提取液的制備將葫蘆巴粉與水按質(zhì)量比I : 40混合，磁力攪拌、回流提取3h后過濾，重復(fù)回流提取I次，過濾后合并濾液，即得葫蘆巴提取液，并滅菌備用；3)西紅柿、甜椒混合提取液的制備將西紅柿、甜椒切片至I厘米長(zhǎng)寬，按質(zhì)量比I 2混合，再與水按質(zhì)量比I : 20混合，回流提取3h過濾，重復(fù)I次回流提取濾液，合并濾液，即得西紅柿、甜椒混合提取液，并滅菌備用；4)將步驟I)、步驟2)和步驟3)中得到的煙葉提取液、葫蘆巴提取液和西紅柿、甜椒混合提取液按I : I : I的體積比進(jìn)行混合，即得煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿混合提取液；5)菌種活化將植生拉烏爾菌 Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005接種到斜面培養(yǎng)基上，在25°C，靜置培養(yǎng)72h后得到活化菌種，置于4°C冰箱中；所述斜面培養(yǎng)基為麥芽糖120mL，蔗糖20g/L，瓊脂15g/L。6)制備種子培養(yǎng)液將步驟5)中所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在25°C條件下，100r/min振蕩培養(yǎng)72h，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，制得種子培養(yǎng)液；所述種子液培養(yǎng)基組成為木糖醇50g/L，黃豆餅粉10g/L，氯化鈉5g/L。7)發(fā)酵將種子培養(yǎng)液按體積比10%接種到上述步驟4)中的滅菌的煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿混合提取液，接種后的濾液的裝罐量為40%，pH5，溫度38°C，轉(zhuǎn)速150r/min，不避光條件下發(fā)酵3天，得到發(fā)酵液；8)將發(fā)酵液和95%乙醇按體積比I : 3,沉淀過夜，10000r/min離心IOmin,過濾后減壓濃縮至相對(duì)密度為I. 1241的浸膏，即得煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿提取物復(fù)合發(fā)酵浸膏。實(shí)施例2本發(fā)明的微生物植生拉烏爾菌Raoultella planticolaVP4_4 CCTCC M 2012005生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)煙葉、可可提取物復(fù)合發(fā)酵香料的制備方法如下I)煙葉提取液的制備將煙葉粉碎至50目，再將煙末和水按質(zhì)量比1:50混合，回流提取3h后過濾，重復(fù)3次回流提取濾液，合并濾液，即得煙葉提取液，并滅菌備用；2)葫蘆巴提取液的制備將葫蘆巴粉與水按質(zhì)量比I : 20混合，磁力攪拌、回流提取Ih后過濾，重復(fù)回流提取3次，過濾后合并濾液，即得葫蘆巴提取液，并滅菌備用；3)西紅柿、甜椒混合提取液的制備將西紅柿、甜椒切片至I厘米長(zhǎng)寬，按質(zhì)量比I : O. 5混合，再與水按質(zhì)量比I : 40混合，回流提取Ih過濾，重復(fù)3次回流提取濾液，合并濾液，即得西紅柿、甜椒混合提取液，并滅菌備用；4)將步驟I)、步驟2)和步驟3)中得到的煙葉提取液、葫蘆巴提取液和西紅柿、甜椒混合提取液按I : 0.5 : O. 5的體積比進(jìn)行混合，即得煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿混合提取液；5)菌種活化將植生拉烏爾菌 Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005接種到斜面培養(yǎng)基上，在38°C，靜置培養(yǎng)24h后得到活化菌種，置于4°C冰箱中；所述斜面培養(yǎng)基為麥芽糖120mL，蔗糖20g/L，瓊脂15g/L。6)制備種子培養(yǎng)液將步驟5)中所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在38°C條件下，150r/min振蕩培養(yǎng)24h，連續(xù)轉(zhuǎn)接I次，制得種子培養(yǎng)液；所述種子液培養(yǎng)基組成為木糖醇50g/L，黃豆餅粉10g/L，氯化鈉5g/L。 7)發(fā)酵將種子培養(yǎng)液按體積比20%接種到上述步驟4)中的滅菌的煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿混合提取液，接種后的濾液的裝罐量為30%，pH8，溫度30°C，轉(zhuǎn)速200r/min，不避光條件下發(fā)酵8天，得到發(fā)酵液；8)將發(fā)酵液和95%乙醇按體積比I : 6，沉淀過夜，10000r/min離心20min，過濾后減壓濃縮至相對(duì)密度為1.0859的浸膏，即得煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿提取物復(fù)合發(fā)酵浸膏。實(shí)施例3本發(fā)明的微生物植生拉烏爾菌Raoultella planticolaVP4_4 CCTCC M 2012005生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)煙葉、可可提取物復(fù)合發(fā)酵香料的制備方法如下I)煙葉提取液的制備將煙葉粉碎至80目，再將煙末和水按質(zhì)量比1:40混合，回流提取3h后過濾，重復(fù)2次回流提取濾液，合并濾液，即得煙葉提取液，并滅菌備用； 2)葫蘆巴提取液的制備將葫蘆巴粉與水按質(zhì)量比I : 30混合，磁力攪拌、回流提取2h后過濾，重復(fù)回流提取3次，過濾后合并濾液，即得葫蘆巴提取液，并滅菌備用；3)西紅柿、甜椒混合提取液的制備將西紅柿、甜椒切片至I厘米長(zhǎng)寬，按質(zhì)量比I I混合，再與水按質(zhì)量比I : 30混合，回流提取Ih過濾，重復(fù)3次回流提取濾液，合并濾液，即得西紅柿、甜椒混合提取液，并滅菌備用；4)將步驟I)、步驟2)和步驟3)中得到的煙葉提取液、葫蘆巴提取液和西紅柿、甜椒混合提取液按I : 0.5 : I的體積比進(jìn)行混合，即得煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿混合提取液；5)菌種活化將植生拉烏爾菌 Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005接種到斜面培養(yǎng)基上，在30°C，靜置培養(yǎng)48h后得到活化菌種，置于4°C冰箱中；所述斜面培養(yǎng)基為麥芽糖120mL，蔗糖20g/L，瓊脂15g/L。6)制備種子培養(yǎng)液將步驟5)中所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在30°C條件下，120r/min振蕩培養(yǎng)36h，連續(xù)轉(zhuǎn)接2次，制得種子培養(yǎng)液；所述種子液培養(yǎng)基組成為木糖醇50g/L，黃豆餅粉10g/L，氯化鈉5g/L。7)發(fā)酵將種子培養(yǎng)液按體積比15%接種到上述步驟4)中的滅菌的煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿混合提取液，接種后的濾液的裝罐量為35%，pH6，溫度33°C，轉(zhuǎn)速180r/min，不避光條件下發(fā)酵8天，得到發(fā)酵液；8)將發(fā)酵液和95%乙醇按體積比I : 5，沉淀過夜，6000r/min離心20min，過濾后減壓濃縮至相對(duì)密度為1.0956的浸膏，即得煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿提取物復(fù)合發(fā)酵浸膏。實(shí)施例4本發(fā)明的微生物植生拉烏爾菌Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)煙葉、可可提取物復(fù)合發(fā)酵香料的制備方法如下I)煙葉提取液的制備將煙葉粉碎至50目，再將煙末和水按質(zhì)量比1:30混合，回流提取3h后過濾，重復(fù)3次回流提取濾液，合并濾液，即得煙葉提取液，并滅菌備用；2)葫蘆巴提取液的制備將葫蘆巴粉與水按質(zhì)量比I : 20混合，磁力攪拌、回流提取2h后過濾，重復(fù)回流提取2次，過濾后合并濾液，即得葫蘆巴提取液，并滅菌備用；3)西紅柿、甜椒混合提取液的制備將西紅柿、甜椒切片至I厘米長(zhǎng)寬，按質(zhì)量比I 2混合，再與水按質(zhì)量比I : 20混合，回流提取3h過濾，重復(fù)3次回流提取濾液，合并濾液，即得西紅柿、甜椒混合提取液，并滅菌備用；4)將步驟I)、步驟2)和步驟3)中得到的煙葉提取液、葫蘆巴提取液和西紅柿、甜椒混合提取液按I : 0.7 : O. 5的體積比進(jìn)行混合，即得煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿混合提取液；5)菌種活化將植生拉烏爾菌 Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005接種到斜面培養(yǎng)基上，在28°C，靜置培養(yǎng)48h后得到活化菌種，置于4°C冰箱中；所述斜面培養(yǎng)基為麥芽糖120mL，蔗糖20g/L，瓊脂15g/L。6)制備種子培養(yǎng)液將步驟5)中所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在30°C條件下，120r/min振蕩培養(yǎng)24h，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，制得種子培養(yǎng)液；所述種子液培養(yǎng)基組成為木糖醇50g/L，黃豆餅粉10g/L，氯化鈉5g/L。7)發(fā)酵將種子培養(yǎng)液按體積比20%接種到上述步驟4)中的滅菌的煙葉、葫蘆巴、·甜椒、西紅柿混合提取液，接種后的濾液的裝罐量為35%，pH5，溫度30°C，轉(zhuǎn)速150r/min，不避光條件下發(fā)酵4天，得到發(fā)酵液；8)將發(fā)酵液和95%乙醇按體積比I : 4，沉淀過夜，7000r/min離心15min，過濾后減壓濃縮至相對(duì)密度為I. 1056的浸膏，即得煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿提取物復(fù)合發(fā)酵浸膏。實(shí)施例5本發(fā)明的微生物植生拉烏爾菌Raoultella planticolaVP4_4 CCTCC M 2012005生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)煙葉、可可提取物復(fù)合發(fā)酵香料的制備方法如下I)煙葉提取液的制備將煙葉粉碎至700目，再將煙末和水按質(zhì)量比1:40混合，回流提取2h后過濾，重復(fù)3次回流提取濾液，合并濾液，即得煙葉提取液，并滅菌備用；2)葫蘆巴提取液的制備將葫蘆巴粉與水按質(zhì)量比I : 40混合，磁力攪拌、回流提取3h后過濾，重復(fù)回流提取3次，過濾后合并濾液，即得葫蘆巴提取液，并滅菌備用；3)西紅柿、甜椒混合提取液的制備將西紅柿、甜椒切片至I厘米長(zhǎng)寬，按質(zhì)量比I 2混合，再與水按質(zhì)量比I : 30混合，回流提取3h過濾，重復(fù)3次回流提取濾液，合并濾液，即得西紅柿、甜椒混合提取液，并滅菌備用；4)將步驟I)、步驟2)和步驟3)中得到的煙葉提取液、葫蘆巴提取液和西紅柿、甜椒混合提取液按I : I : O. 6的體積比進(jìn)行混合，即得煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿混合提取液；5)菌種活化將植生拉烏爾菌 Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005接種到斜面培養(yǎng)基上，在35°C，靜置培養(yǎng)48h后得到活化菌種，置于4°C冰箱中；6)制備種子培養(yǎng)液將步驟5)中所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在32°C條件下，150r/min振蕩培養(yǎng)72h，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，制得種子培養(yǎng)液；所述種子液培養(yǎng)基組成為木糖醇50g/L，黃豆餅粉10g/L，氯化鈉5g/L。7)發(fā)酵將種子培養(yǎng)液按體積比15%接種到上述步驟4)中的滅菌的煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿混合提取液，接種后的濾液的裝罐量為30%，pH7，溫度35°C，轉(zhuǎn)速200r/min，不避光條件下發(fā)酵5天，得到發(fā)酵液；8)將發(fā)酵液和95%乙醇按體積比I : 5,沉淀過夜，10000r/min離心IOmin,過濾后減壓濃縮至相對(duì)密度為I. 1139的浸膏，即得煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿提取物復(fù)合發(fā)酵浸膏。實(shí)施例6 煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合發(fā)酵香料感官評(píng)吸發(fā)明人將上述煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合發(fā)酵香料按重組煙葉量O. 1%、0. 2%、
O.3%，分別添加到重組煙葉上。將重組煙葉裝入密封袋中，放置烘箱中80°C恒溫30 min，至重組煙葉水分合適，卷制成煙支，放入恒溫恒濕箱內(nèi)22°C +1、相對(duì)濕度為60%+2%平衡48h，請(qǐng)專家評(píng)吸小組評(píng)吸。對(duì)照為噴加相同量由煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合提取物的重組煙葉卷制的卷煙。經(jīng)專家評(píng)吸小組反復(fù)評(píng)吸，認(rèn)為本煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合發(fā)酵香料，與重組煙葉量比例為O. 1%、0. 2%時(shí)，具有使重組煙葉煙氣質(zhì)提升，提升煙氣質(zhì)、豐富煙香、增加焦糖樣烤香、余味甜潤(rùn)、掩蓋雜氣、減小刺激的優(yōu)點(diǎn)，改善了重組煙葉刺激大、口感不適的吸味缺陷。表I.煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合發(fā)酵香料添加到重組煙葉中的感官評(píng)吸
權(quán)利要求
1.一種植生拉烏爾菌，該菌株名為Raoultella planticola VP4-4，保藏號(hào)為CCTCCM 2012005，植生拉烏爾菌 Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005 的生物學(xué)特征是革蘭氏陰性菌，能產(chǎn)酸、使牛奶液化并生成吲哚產(chǎn)生、賴氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)呈陽性；鳥氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)、H2S產(chǎn)生、明膠液化呈陰性；能以單糖，多糖、酯類和氨基酸為唯一碳源生長(zhǎng),其16SrRNA序列全長(zhǎng)1408bp,其16S rRNA序列與Raoultella planticola的相似度達(dá)到 99. 563%。
2.一種煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合發(fā)酵香料的制備方法，包括以下步驟 1)煙葉提取液的制備將煙葉粉碎至5(Γ100目，再將煙末和水按質(zhì)量比I: 3(Γ50混合，回流提取f 3h后過濾，重復(fù)f 3次回流提取濾液，合并濾液，即得煙葉提取液，并滅菌備用； 2)葫蘆巴提取液的制備將葫蘆巴粉與水按質(zhì)量比I: 2(Γ40混合，磁力攪拌、回流提取f 3h后過濾，重復(fù)回流提取f 3次，過濾后合并濾液，即得葫蘆巴提取液，并滅菌備用； 3)西紅柿、甜椒混合提取液的制備將西紅柿、甜椒切片，按質(zhì)量比I: 0.5 2混合，再與水按質(zhì)量比I : 2(Γ40混合，回流提取廣3h過濾，重復(fù)f 3次回流提取濾液，合并濾液，即得西紅柿、甜椒混合提取液，并滅菌備用； 4)將步驟I)、步驟2)和步驟3)中得到的煙葉提取液、葫蘆巴提取液和西紅柿、甜椒混合提取液按I : 0.5 1 O. 5 1的體積比進(jìn)行混合，即得煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿混合提取液； 5)菌種活化將植生拉烏爾菌Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005接種到斜面培養(yǎng)基上，在25 38°C，靜置培養(yǎng)24 72h后得到活化菌種，置于冰箱中； 6)制備種子培養(yǎng)液將步驟5)中所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在25 38°C條件下，10(Tl50r/min振蕩培養(yǎng)24tT72h，連續(xù)轉(zhuǎn)接I 3次，制得種子培養(yǎng)液； 7)發(fā)酵將種子培養(yǎng)液按體積比1(Γ20%接種到上述步驟4)中的滅菌的煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿混合提取液，接種后的濾液的裝罐量為3(Γ40%，ρΗ5 8，溫度3(T38°C，轉(zhuǎn)速15(T200r/min，不避光條件下發(fā)酵3 8天，得到發(fā)酵液； 8)將發(fā)酵液和95%乙醇按體積比I: 3 6，沉淀過夜，500(Tl0000r/min離心l(T20min，過濾后減壓濃縮至相對(duì)密度為1.085 Γ . 1241的浸膏，即得煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿提取物復(fù)合發(fā)酵浸膏。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合發(fā)酵香料的制備方法，其特征在于所述步驟5)中，所述斜面培養(yǎng)基為麥芽糖120mL，蔗糖20g/L，瓊脂15g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合發(fā)酵香料的制備方法，其特征在于所述步驟6)中，所述種子液培養(yǎng)基組成為木糖醇50g/L，黃豆餅粉10g/L，氯化鈉5g/L。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求2所得煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合發(fā)酵香料的應(yīng)用，其特征在于所述煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合發(fā)酵香料作為天然煙草添加劑加入重組煙葉中，加入重組煙葉中該天然復(fù)合發(fā)酵香料的質(zhì)量比為O. Γ0. 3%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿復(fù)合發(fā)酵香料及其在重組煙葉中的應(yīng)用。該植生拉烏爾菌菌株名為Raoultella planticola VP4-4，保藏號(hào)為CCTCC M 2012005，其16SrRNA序列全長(zhǎng)1408bp，其16S rRNA序列與Raoultella planticola的相似度達(dá)到99.563%。該方法是利用該菌株，通過菌種活化、制備種子培養(yǎng)液、發(fā)酵培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化發(fā)酵液，以得到煙葉、葫蘆巴、甜椒、西紅柿提取物復(fù)合發(fā)酵浸膏。原料為卷煙產(chǎn)品本源煙葉、能應(yīng)用于卷煙中的葫蘆巴香料、來源廣泛的甜椒、西紅柿，有工業(yè)化使用前景。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102864103SQ20121032486
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月5日
發(fā)明者羅誠(chéng)浩, 魏敏, 陳義坤, 宋旭艷, 李冉 申請(qǐng)人:湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司