專利名稱：一株高產(chǎn)天然蝦青素的紅法夫酵母菌株及其選育方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー株高產(chǎn)天然蝦青素的紅法夫酵母菌株及其選育方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蝦青素(3，3' -ニ羥基-4，4' ニ酮基-β，β'胡蘿卜素)是ー種酮式類胡蘿卜素，天然呈紅色。蝦青素最初被用做水產(chǎn)業(yè)的飼料添加剤，后來藥理學(xué)和生理學(xué)研究表明蝦青素有極強的抗氧化、淬滅自由基的功能，井能促進抗體的產(chǎn)生，增強宿主的免疫功能，在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景，具有很高的經(jīng)濟價值。
紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)是卩隹一天然可產(chǎn)奸青素的酵母,其反式奸青素已于2000年獲得FDA批準(zhǔn)，用于食品添加剤。它是真菌界、真菌門、半知菌亞門、隱球酵母科、紅法夫酵母屬的唯一種。作為蝦青素的生產(chǎn)菌，紅法夫酵母具有許多優(yōu)勢可利用多種糖進行快速異養(yǎng)代謝，培養(yǎng)時間短，不需光照及可以實現(xiàn)高密度培養(yǎng)等。但野生型紅法夫酵母(DCW)的蝦青素含量低(300 450 μ g/g干細(xì)胞)，發(fā)酵成本高，無法與化學(xué)合成競爭，無法滿足エ業(yè)化生產(chǎn)，因此需要對蝦青素產(chǎn)菌株進行選育和改良，以提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低成本。由于紅法夫酵母的遺傳背景并不清楚，蝦青素的合成路徑也很復(fù)雜。因此，目前多采用傳統(tǒng)的誘變和原生質(zhì)體融合等方法對其進行改造。申請?zhí)枮?00910188300. 6的中國發(fā)明專利文獻公開ー種紅法夫酵母菌株的復(fù)合誘變方法，首先將紅法夫酵母菌株進行兩次紫外誘變，得到一株五代內(nèi)遺傳性狀穩(wěn)定的突變株，然后又將此突變株低溫處理，經(jīng)低溫處理的突變株，又經(jīng)過單線態(tài)氧誘變處理，得到一株在10代內(nèi)有良好遺傳穩(wěn)定性的突變株，將突變株進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定器生物量和色素含量，均高于原始菌株。申請?zhí)枮?1105886. 9的專利文獻公開了ー種紅法夫酵母細(xì)胞的球狀體融合技術(shù)及由球狀體融合得到的幾株新的紅法夫酵母菌株，比親本菌株的蝦青素產(chǎn)量聞。但是誘變育種具有盲目性、隨機性，導(dǎo)致工程量巨大，時間漫長，菌株突變面臨回復(fù)現(xiàn)象的難題。原生質(zhì)體融合技術(shù)可以扮演類似于有性生殖途徑基因信息交流的作用，但是有性生殖途徑只能允許在雙親本之間的基因重組。因此，尋找ー種簡單、高效的育種方法尤為重要。目前，國外已有利用紅法夫酵母進行蝦青素生產(chǎn)的企業(yè)，如美國的紅星公司、Igene生物有限公司、Tate&Lyle發(fā)酵產(chǎn)品有限公司和Igene生物技術(shù)有限公司合資エ廠等。但國內(nèi)還沒有蝦青素的生產(chǎn)企業(yè)，因此研究一種適于エ業(yè)生產(chǎn)的蝦青素生產(chǎn)途徑具有很好的研究意義和很大的發(fā)展空間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株高產(chǎn)天然蝦青素的紅法夫酵母菌株及其選育方法和應(yīng)用。以紅法夫酵母為親本菌株，采用基因組重排技術(shù)，選育出一株高產(chǎn)蝦青素的紅法夫酵母菌株，無需了解其基因組學(xué)、代謝組學(xué)等具體背景，操作簡單，見效快，適于エ業(yè)生產(chǎn)。一株紅法夫酵母菌株,命名為紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZ10,保藏號為CGMCC No. 6355。本發(fā)明所選育出的紅法夫酵母菌株于2012 年7月12日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,命名為紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)CZ10，保藏號為CGMCC No. 6355。本發(fā)明還提供了ー種利用所述的紅法夫酵母菌株生產(chǎn)蝦青素的方法，包括將所述的紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZlO接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng),發(fā)酵完成后，提取所述蝦青素。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) :10. O葡萄糖，5. O蛋白胨，5. O濃縮酵母浸出粉，
0.2CaCl2 · 2H20, 2. 75MgS04 · 7H20,1. 5KH2P04, 3. 0 (NH4)2S04, pH 5. 0所述發(fā)酵條件為22±1で，1501'/11^11，培養(yǎng)48-7211。蝦青素提取的方法有很多種，本發(fā)明中所述提取蝦青素的方法為取發(fā)酵液，第一次離心、收集菌體，將菌體破碎，萃取、第二次離心，獲得蝦青素。優(yōu)選地，所述萃取采用的萃取劑為丙酮；所述第二次離心的轉(zhuǎn)速為4500 5000r/m ;所述菌體破碎的方法為將所述菌體懸浮在預(yù)熱后的ニ甲基亞砜中，振蕩。具體操作步驟為取5mL發(fā)酵液于5000r/m下離心IOmin,去離子水洗漆兩次，收集菌體，加入ImL 55°C預(yù)熱的ニ甲基亞砜(DMSO)，振蕩懸浮，加入丙酮4mL，漩渦震蕩20_30s, 4°C, 5000r/m 離心 IOmin 去沉淀。采用紫外分光光度方法檢測蝦青素的產(chǎn)量，本發(fā)明選育出的紅法夫酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)生蝦青素，其蝦青素的產(chǎn)量可達到68mg/L。本發(fā)明還提供了一種所述的紅法夫酵母菌株的選育方法，包括(I)選取親本菌株，分為兩組，分別進行LiCl-紫外復(fù)合誘變和6tlCo-Y射線誘變，篩選后分別得到經(jīng)LiCl-紫外復(fù)合誘變的若干株誘變株I和經(jīng)6tlCo- Y射線誘變的若干誘變株II。所述的LiCl-紫外復(fù)合誘變的條件為菌懸液中加入10% LiCl溶液，30cm、15W紫外燈照射。所述的菌懸液濃度為IO6個/mL，所述的LiCl溶液與菌懸液的體積比為3 50。具體操作過程為將親本菌株用無菌生理鹽水配制成菌懸液，菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至一定濃度，優(yōu)選為IO6個/mL,然后取5ml菌懸液于帶磁力轉(zhuǎn)子的培養(yǎng)皿中,加入300 μ L 10% LiCl混勻后開蓋進行紫外線照射。誘變條件30cm，15W紫外燈。照射7min，黑暗處理后適當(dāng)稀釋涂板，在22°C恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)4-6d。同時，以未經(jīng)誘變的菌懸液同樣操作作為對照，計算致死率。致死率的計算方法如下
未經(jīng)誘變平板上的菌落數(shù)-經(jīng)誘變后平板上的菌落數(shù)
未經(jīng)誘變平板上的菌落數(shù)060Co-Y射線誘變可采用現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的方法，本發(fā)明中送至浙江省農(nóng)科院鈷室進行誘變，誘變的條件為菌懸液濃度為IO6個/mL，誘變劑量為3500Gy。
(2)將所述的誘變株I和誘變株II進行原生質(zhì)體融合、再生和篩選，得到若干株蝦青素產(chǎn)量高于誘變株I和誘變株II的F-I代融合菌株。(3)將步驟(2)所得的F-I融合菌株進行遞歸式原生質(zhì)體融合，至少進行5輪，得到所述的紅法夫酵母菌株。遞歸式原生質(zhì)體融合(recursive protoplast fusion),也稱多輪循環(huán)原生質(zhì)體融合技術(shù)，即將各種親本制成原生質(zhì)體-融合-再生-再制成原生質(zhì)體-融合-再生的技木。本發(fā)明中通過LiCl-紫外復(fù)合誘變和6tlCo-Y射線誘變分別篩選出其蝦青素產(chǎn)量高于親本菌株的誘變株。將上述分別經(jīng)過LiCl-紫外復(fù)合誘變和6ciCo-Y射線誘變的誘變株脫去細(xì)胞壁，進行原生質(zhì)體融合、再生，得到第一輪融合后的融合菌株。通過現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的篩選方法篩選出蝦青素產(chǎn)量高于所述誘變株的融合菌株進入下ー輪融合，每ー輪融合結(jié)束后篩選出蝦青素產(chǎn)量高于該輪融合的親本菌株的融合菌株進入下ー輪融合，如此進行遞歸式原生質(zhì)體融合，至少進行5輪，得到所述的紅法夫酵母菌株。 所述的篩選為采用含不同濃度梯度的YM- ニ苯胺篩選培養(yǎng)基進行篩選。本發(fā)明所需的親本菌株，沒有特別的要求，一般可獲得的紅法夫酵母菌株都可以，優(yōu)選的親本菌株為紅發(fā)夫酵母(Phaffia rhodozyma) 02,其來源為浙江エ商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院保藏，由梁新樂(浙江杭州)贈送。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的選育方法采用基因組重排技術(shù)，即結(jié)合了傳統(tǒng)誘變技術(shù)和細(xì)胞融合技木，是ー項對整個微生物基因組重排的新型育種技木?；蚪M重排技木通過多親本原生質(zhì)體遞歸融合，可以使工程菌快速獲得多祥復(fù)雜優(yōu)良表型，并且無須了解其基因組學(xué)、代謝組學(xué)等具體背景。此外，基因重組技術(shù)操作簡單，容易推廣，不需要昂貴的試驗儀器，而且見效快。因此，基因組重排育種很適合エ業(yè)菌株的改造，不僅體現(xiàn)成本經(jīng)濟效應(yīng)，還具備高效性。選育出來的新菌株其蝦青素產(chǎn)量比親本菌株高14. 3倍。
具體實施例方式YM培養(yǎng)基(g/L) :10. O葡萄糖，5. O濃縮酵母浸出粉，5. O蛋白胨，pH 5. O0若為固體培養(yǎng)基需加入2. 5%瓊脂粉。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 10. O葡萄糖，5. O蛋白胨，5. O濃縮酵母浸出粉，0. 2CaCl2 · 2H20, 2. 75MgS04 · 7H20,1. 5KH2P04, 3. 0 (NH4)2S04, pH 5. 0。YM- ニ苯胺選擇性培養(yǎng)基待YM培養(yǎng)基冷卻至50°C時加入一定量的無菌ニ苯胺溶液。再生培養(yǎng)基KT溶液配置的YM固體培養(yǎng)基。選擇性再生培養(yǎng)基待再生培養(yǎng)基冷卻至50°C加入一定劑量的無菌ニ苯胺溶液。PTC溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取70g PEG-4000,0. 22g無水CaCl2, KT溶液溶解并定容至200mL。KT 緩沖液的配制0. 8mol/L KCl,0. 01mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 7. 4)配制。溶壁酶混合液分別稱取0. 6g溶菌酶，0. 6g蝸牛酶，I. 2g纖維素酶，分別溶于30mLKT緩沖液中，分別用0.2μπι的無機微孔膜過濾滅菌，4°C保存，使用時按纖維素酶溶菌酶蝸牛酶=2:1:1混合。
實施例I(I) LiCl-紫外復(fù)合誘變育種親本菌株為紅發(fā)夫酵母(Phaffia rhodozyma) 02,其來源為浙江エ商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院保藏，由梁新樂(浙江杭州)贈送，活化后用無菌生理鹽水配制成菌懸液，菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至IO6個/mL，取5mL菌懸液于帶磁力轉(zhuǎn)子的培養(yǎng)皿中，加入300 μ L 10% LiCl混勻后開蓋進行紫外線照射。誘變條件30cm，15W紫外燈。照射時間為7min,黑暗處理后稀釋IO3倍，YM培養(yǎng)基涂板，在22°C恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)4_6d。同吋，以未經(jīng)誘變的菌懸液同樣操作作為對照，計算致死率為83%。(2) 60Co- Y射線誘變育種將制備好的菌懸液濃度調(diào)整為IO6個/mL，取菌懸液于無菌試管中，送浙江省農(nóng)科院鈷室進行6ciCo-Y射線誘變，誘變劑量為3500Gy。 (3)原生質(zhì)體制備對經(jīng)過步驟(I)和步驟(2)誘變后的誘變株進行劃板篩選(篩選方法同步驟(5))，分別篩選出蝦青素產(chǎn)量高于親本菌株的若干誘變株，然后分別在新鮮液體培養(yǎng)基(YM培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，從培養(yǎng)成熟的新鮮液體培養(yǎng)基中取細(xì)胞懸液10mL，5000r/m離心lOmin，棄上清液。細(xì)胞沉淀物用無菌生理鹽水洗滌兩次，離心后即得菌體。將親本細(xì)胞(即經(jīng)過誘變得到的產(chǎn)量較高的菌株)懸浮于IOmL溶液(25mL
O.05mol/L EDTA和ImL O. 5mol/L β-疏基こ醇混合液)中，22°C振蕩處理lOmin。離心收集菌體，用KT緩沖液洗滌2次，離心后再次得菌體。將所得菌體中加入SmL溶壁酶混合液之后放于22°C下90r/m的搖床中輕微振蕩，以使菌體充分懸浮在酶液中。隨時使用ImL槍頭反復(fù)吸取酶解液促使原生質(zhì)體的釋放，同時用顯微鏡觀察細(xì)胞形成原生質(zhì)體的情況。酶解結(jié)束后5000rpm離心lOmin，用KT緩沖液洗滌2次收集菌體后，用KT緩沖液配置成IO7個/mL原生質(zhì)體懸液I (LiCl-紫外復(fù)合誘變株)。對6tlCo- Y射線誘變的誘變株進行相同的操作，配制成IO7個/mL原生質(zhì)體懸液II (60Co- Y射線誘變株)。(4)原生質(zhì)體融合與再生實驗中采用PEG誘導(dǎo)融合法，即原生質(zhì)體懸液I和原生質(zhì)體懸液II中各取2mL濃度為IO7個/mL的原生質(zhì)體懸浮液,混勻后,3000r/m離心IOmin,棄上清。在原生質(zhì)體沉淀中加入4mL PTC溶液后，用移液槍吸吹混勻，22°C保溫15min后，3000r/m離心lOmin，棄上清，之后KT緩沖液洗滌兩次。最后重懸于2mL KT緩沖液中，稀釋104后涂布于再生培養(yǎng)基選擇平板上。22°C在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d。原生質(zhì)體形成率和再生率的計算
原生質(zhì)體形成率=hxioo%
原生質(zhì)體再生率=·^χ οο%
A-BA :酶解前菌落總數(shù)；B :酶解后未脫壁細(xì)胞形成的菌落數(shù)；C :酶解后未脫壁細(xì)胞形成的菌落數(shù)加上原生質(zhì)體再生細(xì)胞菌落數(shù)。本實施例中原生質(zhì)體形成率和再生率分別為90. 41%和4. 93%。
(5)篩選將融合菌株分別劃線于含有不同濃度的ニ苯胺的YM- ニ苯胺選擇性培養(yǎng)基平板上，22°C培養(yǎng)后觀察不同平板上菌落的生長情況，記錄顔色由紅到淺黃或無色菌落的ニ苯胺濃度，即為ニ苯胺對該菌的最小抑制濃度(MIC)，同時以親本菌株(步驟(I)中所用的親本菌株)做對照，最小抑制濃度(MIC)相對親本菌株增加較大的幾株即為我們需要的菌株。(6)遞歸融合將步驟(5)中篩選出的蝦青素產(chǎn)量相對高的幾株融合株菌株繼續(xù)進行步驟(3) (5)的操作，每ー輪操作結(jié)束后篩選出蝦青素產(chǎn)量相對較高的融合菌株重復(fù)步驟(3)
(5)，進行5輪遞歸融合，最后篩選出蝦青素產(chǎn)量相對較高的幾株，進行穩(wěn)定性測試。(7)穩(wěn)定性測試 將步驟(6)選育出的蝦青素產(chǎn)量較高的幾株，進行穩(wěn)定性試驗，在裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中連續(xù)搖瓶發(fā)酵3次得發(fā)酵液，發(fā)酵條件22 土 1°C，150r/m，培養(yǎng)48h。每次均以出發(fā)菌株(步驟(I)中的親本菌株)作為對照，提取發(fā)酵液中的蝦青素，測定其蝦青素產(chǎn)量，蝦青素產(chǎn)量較穩(wěn)定。編號為CZlO的融合菌株其蝦青素產(chǎn)量提高到68mg/L，而親本菌株的蝦青素產(chǎn)量僅為4. 75mg/L。該菌株即為我們需要的的蝦青素高產(chǎn)菌株。將該蝦青素高產(chǎn)菌株于于2012年7月12日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，命名為，紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZ10，保藏號為 CGMCC No. 6355。蝦青素的提取及測定方法紫外分光光度測定法測定蝦青素含量。取5mL發(fā)酵液于5000rpm下離心lOmin，去離子水洗滌兩次，收集菌體，用濾紙吸干管壁水滴，加入ImL 55°C預(yù)熱的ニ甲亞砜(DMSO)，振蕩懸浮，加入丙酮4mL，漩渦振蕩20-30s，4°C，5000r/m離心lOmin，上清液用分光光度計測0D474。如菌泥仍有色可重復(fù)抽提至白色為止，蝦青素含量計算公式如下
(P(10000)
蝦青素 Ungl L) = ~^--
2150K式中A——OD474mm值V1——有機溶劑的總體積(L)；2150——比消光系數(shù)V2——發(fā)酵液體積(L)；100 :單位換算后的作數(shù)(mg/L)實施例2利用實施例I選育出的紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZlO進行發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)
蝦青素。取實施例I中選育的紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZlO接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中連續(xù)搖瓶發(fā)酵3次，22± I°C，150r/m,培養(yǎng)48h，提取發(fā)酵液中的蝦青素，測定蝦青素的含量，重復(fù)試驗，其蝦青素產(chǎn)量均穩(wěn)定在68mg/L(每L發(fā)酵液產(chǎn)蝦青素的量)。發(fā)酵液中蝦青素的提取和測定方法同實施例I。
權(quán)利要求
1.一株紅法夫酵母菌株,其特征在于,命名為紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)CZ10,保藏號為 CGMCC No. 6355。
2.ー種利用如權(quán)利要求I所述的紅法夫酵母菌株生產(chǎn)蝦青素的方法，其特征在于，包括將所述的紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZlO接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵完成后，提取所述蝦青素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基以IL計含有以下組分.10.Og 葡萄糖，5. Og 蛋白胨，5. Og 濃縮酵母浸出粉，O. 2g CaCl2 · 2H20，2.75g MgSO4 · 7H20，I.5g KH2PO4, 3. 0g(NH4)2504, pH 5.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為21 23°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)的時間為48-72h。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取蝦青素的方法為取發(fā)酵液，第一次離心、收集菌體，將菌體破碎，萃取、第二次離心，獲得蝦青素。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述萃取采用的萃取劑為丙酮。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述第二次離心的轉(zhuǎn)速為4500 5000r/m0
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述菌體破碎的方法為將所述菌體懸浮在預(yù)熱后的ニ甲基亞砜中，振蕩。
10.一種如權(quán)利要求I所述的紅法夫酵母菌株的選育方法，其特征在于，包括 (1)選取親本菌株，分為兩組，分別進行LiCl-紫外復(fù)合誘變和6tlCo-Y射線誘變，篩選后分別得到經(jīng)LiCl-紫外復(fù)合誘變的若干株誘變株I和經(jīng)6ciCo- Y射線誘變的若干誘變株II; (2)將所述的誘變株I和誘變株II進行原生質(zhì)體融合、再生和篩選，得到若干株蝦青素產(chǎn)量高于誘變株I和誘變株II的F-I代融合菌株； (3)將步驟(2)所得的F-I融合菌株進行遞歸式原生質(zhì)體融合，至少進行5輪，得到所述的紅法夫酵母菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株高產(chǎn)天然蝦青素的紅法夫酵母菌株及其選育方法和應(yīng)用，該菌株命名為紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)CZ10，保藏號為CGMCC No.6355。通過如下方法選育選取親本菌株，分為兩組，分別進行LiCl-紫外復(fù)合誘變和60Co-γ射線誘變，篩選后若干株誘變株I和若干誘變株II；將誘變株I和誘變株II進行原生質(zhì)體融合、再生和篩選，得到若干株蝦青素產(chǎn)量高于誘變株I和誘變株II的融合菌株；將步驟(2)所得的融合菌株進行遞歸式原生質(zhì)體融合，至少進行5輪，得到所述的紅法夫酵母菌株。本發(fā)明的菌株應(yīng)用于工業(yè)上生產(chǎn)蝦青素，其蝦青素產(chǎn)量達到68mg/L，相對選育前的親本菌株提高了14.3倍。
文檔編號C12P23/00GK102864087SQ201210321949
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月3日
發(fā)明者胡向東, 朱靜, 梁新樂 申請人:浙江皇冠科技有限公司