專利名稱：提高長鏈二元酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化工產(chǎn)品制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高長鏈二元酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法。
背景技術(shù)：
長鏈二元酸是一種重要的精細化工原料，可用于合成香料、熱熔膠、工程塑料和液晶等，應(yīng)用非常廣泛。目前，長鏈二元酸主要利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，利用微生物雙末端氧化的特殊功能發(fā)酵正構(gòu)烷烴制取長鏈二元酸。由微生物氧化烷烴生成長鏈二元酸的機理研究可知，其主反應(yīng)是α，ω-氧化，副反應(yīng)是α-氧化脫羧和β _氧化，生成的產(chǎn)物長鏈二元酸可被進一步氧化降解。雖然目前國內(nèi)外生產(chǎn)菌株的α，ω-氧化能力較強，產(chǎn)酸最高可達150g /L，但在生產(chǎn)長鏈二元酸過程中面臨的一個首要問題是發(fā)酵烷烴轉(zhuǎn)化率低，一般烷烴對長鏈二元酸的摩爾轉(zhuǎn)化率只有35%，因此造成了原材料的大量消耗，生產(chǎn)成本過高。由于高生產(chǎn) 成本已成為高檔熱熔膠、高級航空潤滑油和特性工程塑料等下游產(chǎn)品開發(fā)的限制因素。如何減弱菌種的α-氧化脫羧和β —氧化能力，阻斷或緩解長鏈二元酸進一步降解是提高發(fā)酵烷烴轉(zhuǎn)化率、減少烷烴消耗、降低生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。中國專利CN1233658A公開了一種生產(chǎn)長鏈二元酸的熱帶假絲酵母菌的篩選方法。該方法能快速而高效的獲得α，ω-氧化增強的假絲酵母突變株，為提高產(chǎn)酸量和轉(zhuǎn)化率打下基礎(chǔ)。中國專利CN1257126A公開了一種利用一株難以利用正構(gòu)烷烴作生長碳源的熱帶假絲酵母突變株FP — UV — 56氧化CltTC18正構(gòu)烷烴生產(chǎn)α，ω -長鏈二元酸的方法，同時采用雙底物發(fā)酵使產(chǎn)酸量和轉(zhuǎn)化率均有提高。中國專利CN1130685A、CN 1162644Α、CN1369564A、CN1092108A、CN1034579A、CN1046757A分別公開了通過硝基胍、亞硝酸和紫外線多次反復(fù)誘變，選育出ω-氧化能力更強的熱帶假絲酵母突變菌株，并以烷烴作生長碳源，氧化正構(gòu)烷烴生產(chǎn)長鏈二元酸的方法。這些菌株對應(yīng)十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十八碳二元酸有一定效果。上述方法主要從菌種改良方面來提高發(fā)酵產(chǎn)率，而菌種改良的工作量大，不確定因素多，不易操作掌握，發(fā)酵產(chǎn)率仍然較低，一般達到35% (摩爾轉(zhuǎn)化率)，仍有待于進一步提聞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高長鏈二元酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法，加入的抑制劑可以有效減弱菌株的α-氧化脫羧和β —氧化能力，烷烴消耗低、發(fā)酵烷烴轉(zhuǎn)化率較高、產(chǎn)酸量高且發(fā)酵產(chǎn)率高。本發(fā)明所述的提高長鏈二元酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法，以CltTC18正構(gòu)烷烴為原料，用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，其特點是在發(fā)酵生產(chǎn)過程中加入α-氧化脫羧抑制劑和/或β-氧化抑制劑來減弱菌株的Ct-氧化脫羧和β -氧化能力，α -氧化脫羧抑制劑為鹽酸氯丙嗪、苯巴比妥鈉、丙烯酸或聚丙烯酸中的一種或幾種混合，濃度O. Orimmol/L, β -氧化抑制劑為巰基乙酸、巰基乙酸鈉、雷諾嗪、鹽酸雷諾嗪或米曲肼中的一種或幾種混合,濃度O. Oflmmol/L0所述的米曲肼亦稱米屈肼、咪曲肼、咪屈肼。所述的抑制劑在菌種培養(yǎng)初期加入或在轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸期時補加。α -氧化脫羧抑制劑或氧化抑制劑也可以同時加入。所述的微生物發(fā)酵法制取長鏈二元酸包括以下步驟(I)取接種環(huán)生產(chǎn)二元酸的熱帶假絲酵母，涂布在無菌的Yro斜面培養(yǎng)基上，于29 30°C培養(yǎng)40 48小時；
(2)取步驟(I)培養(yǎng)好的斜面菌種，接入經(jīng)120 125°C，15 25min滅菌后裝有20 30ml種子培養(yǎng)基的450 550ml三角瓶中，在160 200轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床上于29 30°C培養(yǎng)40-55小時，作搖瓶種子液；(3)取培養(yǎng)好的無雜菌的種子液接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角搖瓶中，在160 200轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床上于29 30°C培養(yǎng)15 25小時，然后加入正構(gòu)烷烴，轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸期；正烷烴采取每隔20 30小時按4 8% (v/v)分批補加，以發(fā)酵混合液初始體積為準，總加入量為25 35% (v/v)，總培養(yǎng)時間為6 7天。本發(fā)明涉及的發(fā)酵法生產(chǎn)長鏈二元酸的其它條件，如菌體的選育和培養(yǎng)、發(fā)酵過程的原料及條件等，可以與現(xiàn)有技術(shù)相同，下面介紹一種較好的方法。具體步驟是(I)取接種環(huán)生產(chǎn)二元酸的熱帶假絲酵母，涂布在無菌的YPD固體斜面培養(yǎng)基上，于29 30°C培養(yǎng)48小時；(2)取步驟(I)培養(yǎng)好的斜面菌種，接入經(jīng)12rC，20min滅菌后裝有25ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，在180轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床上于29 30°C培養(yǎng)48小時，作搖瓶種子液；(3)取一定體積培養(yǎng)好的無雜菌的種子液接種至含有已加入O. 01mmol/L抑制劑的發(fā)酵培養(yǎng)基的三角搖瓶中，在180轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床上于29 30°C培養(yǎng)20小時，這期間主要消耗糖質(zhì)來迅速繁殖菌體。待糖質(zhì)消耗后，上調(diào)PH7. 2并加入正構(gòu)烷烴，轉(zhuǎn)入發(fā)酵產(chǎn)酸期。在產(chǎn)酸期，根據(jù)發(fā)酵時間延長及二元酸積累量的增加逐漸上調(diào)PH值，其變化范圍為7. 2 8. 5。正構(gòu)烷烴(IiCicTnC18)采取每隔24小時按6% (v/v)分批補加，以發(fā)酵混合液初始體積為準，烷烴總加入量為30% (v/v)，總培養(yǎng)時間為6 7天，采用生長細胞發(fā)酵方式。上述方法所涉及培養(yǎng)基為其中的斜面培養(yǎng)基為固體斜面培養(yǎng)基(g/L):酵母膏3 6、白砂糖5 15、蛋白胨5 15和瓊脂10 20。種子培養(yǎng)基(g/L):糖質(zhì)5、磷酸二氫鉀8、酵母膏I. 5、玉米漿I. 5、尿素I. 8,200#重蠟油30ml/L，自來水配制，自然pH。糖質(zhì)可以是白砂糖。發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖30，KH2PO4S,酵母膏2，玉米漿1，尿素2，NaClO. 8，硝酸鉀7，單一正構(gòu)烷烴(nC12) 100mL/L,自來水配制，自然pH。本發(fā)明的有益效果如下
本發(fā)明從菌種選育、發(fā)酵條件及代謝調(diào)控等方面開展了大量的研究工作，在正構(gòu)烷烴發(fā)酵生產(chǎn)相應(yīng)碳數(shù)二元酸過程中，通過加入抑制劑來減弱菌株的α-氧化脫羧和β氧化能力，降低了烷烴單耗，使發(fā)酵烷烴轉(zhuǎn)化率有較大提高。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有產(chǎn)酸速度快、α -氧化脫羧和β -氧化能力弱、烷烴單耗低、發(fā)酵烷烴轉(zhuǎn)化率高的特點，特別適于制取長鏈二元酸。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步描述。實施例I所述的提高長鏈二元酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法，包括以下步驟 (I)取一接種環(huán)熱帶假絲酵母，涂布在20x200mm的大試管固體斜面培養(yǎng)基上，于30°C培養(yǎng)48小時。斜面培養(yǎng)基為固體斜面培養(yǎng)基(g/L):酵母膏5、白砂糖10、蛋白胨5和瓊脂15。(2)將步驟(I)培養(yǎng)好的菌種接入裝有15mL種子培養(yǎng)基的500mL三角搖瓶中，于30°C在180轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)40小時。種子培養(yǎng)基(g/L):白砂糖5、磷酸二氫鉀8、酵母膏I. 5、玉米漿I. 5、尿素I. 8、200#重蠟油30ml/L，自來水配制，自然pH。(3)在裝有15mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角搖瓶中，接入5ml上述種子液，同時加入O. 5mmol/L的抑制劑鹽酸氯丙嗪，并且做3個平行樣，在180轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上于30°C發(fā)酵6天。發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖30，KH2PO4S,酵母膏2，玉米漿1，尿素2，NaClO. 8，硝酸鉀7，單一正構(gòu)烷烴(nC12) 100mL/L,自來水配制，自然pH。在121 °C下滅菌30分鐘。發(fā)酵期間每12小時用30%Na0H調(diào)pH值至7. 8。發(fā)酵基質(zhì)為nC12，初始加入和補加總加入量為3ml。殘烴為O發(fā)酵結(jié)束，破乳，取2mL發(fā)酵清液以經(jīng)酸化、乙醚萃取、去乙醚、分兩份用酸堿滴定測含酸量和用氣相色譜分析單酸含量。計算得出發(fā)酵烷烴轉(zhuǎn)化率，結(jié)果產(chǎn)酸量158. 2g/L，提取得到十二烷二酸I. 8833g，單酸含量(GC)達到97. Iwt. %，總酸含量(中和滴定)為99. 3wt. %，烷烴摩爾轉(zhuǎn)化率達到62. 0%。實施例2按實施例I的方法，以抑制劑苯巴比妥鈉替代鹽酸氯丙嗪，在搖瓶接種時加入，濃度為lmmol/L，發(fā)酵基質(zhì)為nC13，加入量為3ml。殘烴為O發(fā)酵結(jié)束，用實施例I方法測定二元酸，經(jīng)計算得出發(fā)酵烷烴轉(zhuǎn)化率，結(jié)果產(chǎn)酸量146. 5g/L，提取得到十三烷二酸I. 7397g，單酸含量(GC)達到96. 8wt. %，總酸含量(中和滴定)為99. Iwt. %，烷烴摩爾轉(zhuǎn)化率達到58. 0%。實施例3按實施例I的方法，以抑制劑丙烯酸替代鹽酸氯丙嗪，并在菌體培養(yǎng)28小時時加入，濃度為0.05mmol/L，發(fā)酵基質(zhì)為nC14，加入量為3ml。殘烴為O發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后，用實施例I方法測定二元酸，經(jīng)計算得出發(fā)酵烷烴轉(zhuǎn)化率，結(jié)果產(chǎn)酸量162. 5g/L，提取得到十四烷二酸I. 9013g，單酸含量(GC)達到97. 5wt. %，總酸含量(中和滴定)為99. 4wt. %，烷烴摩爾轉(zhuǎn)化率達到64%。實施例4
按實施例I的方法，以抑制劑巰基乙酸鈉替代鹽酸氯丙嗪，并在菌體培養(yǎng)O小時時加入，濃度為O. 08mmol/L，發(fā)酵基質(zhì)為nC15，加入量為3ml。殘烴為O發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后，用實施例I方法測定二元酸，經(jīng)計算得出發(fā)酵烷烴轉(zhuǎn)化率，結(jié)果產(chǎn)酸量171. 2g/L，提取得到十四烷二酸I. 9264g，單酸含量(GC)達到97. 2wt. %，總酸含量(中和滴定)為99. Iwt. %，烷烴摩爾轉(zhuǎn)化率達到65%。實施例5按實施例I的方法，以抑制劑鹽酸雷諾嗪替代鹽酸氯丙嗪，并在菌體培養(yǎng)28小時時加入，濃度為O. 09mmol/L，發(fā)酵基質(zhì)為nC16，加入量為3ml。殘烴為O發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后，用實施例I方法測定二元酸，經(jīng)計算得出發(fā)酵烷烴轉(zhuǎn)化率，結(jié)果產(chǎn)酸量175. lg/L，提 取得到十四烷二酸I. 9543g，單酸含量(GC)達到97. 5wt. %，總酸含量(中和滴定)為99. 4wt. %，烷烴摩爾轉(zhuǎn)化率達到66%。實施例6按實施例I的方法，以抑制劑米曲肼替代鹽酸氯丙嗪，并在菌體培養(yǎng)48小時時加入，濃度為l.Ommol/L，發(fā)酵基質(zhì)為nC14，加入量為3ml。殘烴為O發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后，用實施例I方法測定二元酸，經(jīng)計算得出發(fā)酵烷烴轉(zhuǎn)化率，結(jié)果產(chǎn)酸量156. 2g/L，提取得到十四烷二酸I. 8419g，單酸含量(GC)達到97. 4wt. %，總酸含量(中和滴定)為99. 2wt. %，烷烴摩爾轉(zhuǎn)化率達到62%。實施例7按實施例I的方法，以抑制劑鹽酸雷諾嗪和米屈肼兩種替代鹽酸氯丙嗪，并在菌體培養(yǎng)36小時時加入，濃度為O. 09mmol/L，發(fā)酵基質(zhì)為nC12，加入量為3ml。殘烴為O發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后，用實施例I方法測定二元酸，經(jīng)計算得出發(fā)酵烷烴轉(zhuǎn)化率，結(jié)果產(chǎn)酸量160g/L，提取得到十四烷二酸I. 9136g，單酸含量(GC)達到97. 5wt. %，總酸含量(中和滴定)為99. 4wt. %，烷烴摩爾轉(zhuǎn)化率達到63%。
權(quán)利要求
1.一種提高長鏈二元酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法，以CltTc18正構(gòu)烷烴為原料，用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，其特征在于在發(fā)酵生產(chǎn)過程中加入a-氧化脫羧抑制劑和/或3-氧化抑制劑來減弱菌株的a-氧化脫羧和￠-氧化能力，a-氧化脫羧抑制劑為鹽酸氯丙嗪、苯巴比妥鈉或聚丙烯酸中的一種或幾種混合，3 -氧化抑制劑為巰基乙酸、巰基乙酸鈉、雷諾嗪、鹽酸雷諾嗪或米曲肼中的一種或幾種混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高長鏈二元酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法，其特征在于所述的a-氧化脫羧抑制劑濃度為0. 01 lmmol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高長鏈二元酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法，其特征在于所述的￠-氧化抑制劑濃度為0. 0rimmol/Lo
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高長鏈二元酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法，其特征在于所述的抑制劑在菌種培養(yǎng)初期加入或在轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸期時補加。
5.根據(jù)權(quán)利要求r4任一所述的提高長鏈二元酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法，其特征在于所述的微生物發(fā)酵法制取長鏈二元酸包括以下步驟 (1)取接種環(huán)生產(chǎn)二元酸的熱帶假絲酵母，涂布在無菌的YPD斜面培養(yǎng)基上，于29 30°C培養(yǎng)40 48小時； (2)取步驟(I)培養(yǎng)好的斜面菌種，接入經(jīng)120 125°C，15 25min滅菌后裝有20 30ml種子培養(yǎng)基的450 550ml三角瓶中，在160 200轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床上于29 30°C培養(yǎng)40-55小時,作搖瓶種子液； (3)取培養(yǎng)好的無雜菌的種子液接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角搖瓶中，在160 200轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床上于29 30°C培養(yǎng)15 25小時，然后加入正構(gòu)烷烴，轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸期；正烷烴采取每隔20 30小時按4 8%分批補加，以發(fā)酵混合液初始體積為準，總加入量為25 35%，總培養(yǎng)時間為6 7天。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提高長鏈二元酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法，其特征在于所述的斜面培養(yǎng)基為固體斜面培養(yǎng)基，重量百分含量為酵母膏0. 3 0.6%、白砂糖0. 5 I. 5%、蛋白胨·0.5 I. 5%和瓊脂I. 0 2. 0%。
全文摘要
本發(fā)明屬于化工產(chǎn)品制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高長鏈二元酸發(fā)酵產(chǎn)率的方法。本發(fā)明方法以C10~C18正構(gòu)烷烴為原料，用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，其特點是在發(fā)酵生產(chǎn)過程中加入α-氧化脫羧抑制劑或β-氧化抑制劑來減弱菌株的α-氧化脫羧和β-氧化能力，α-氧化脫羧抑制劑為鹽酸氯丙嗪、苯巴比妥鈉、丙烯酸或聚丙烯酸中的一種或幾種混合，濃度為0.01~1mmol/L，β-氧化抑制劑為巰基乙酸、巰基乙酸鈉、雷諾嗪、鹽酸雷諾嗪或米曲肼中的一種或幾種混合，濃度為0.01~1mmol/L。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有產(chǎn)酸速度快、α-氧化脫羧和β-氧化能力弱、烷烴單耗低、發(fā)酵烷烴轉(zhuǎn)化率高的特點，特別適于制取長鏈二元酸。
文檔編號C12P7/64GK102808004SQ201210310939
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月28日
發(fā)明者蘇慶旺, 尹海順, 劉 文 申請人:淄博廣通化工有限責任公司