專利名稱：密碼子優(yōu)化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種按大腸桿菌密碼子偏愛性優(yōu)化的的7α-羥基類固醇脫氫酶(7a-HSDH)基因。
背景技術(shù)：
熊膽是名貴的中藥材，用于治療膽結(jié)石疾病以及各種急性、慢性肝病，具有良好的治療效果。熊去氧膽酸(3 α -7 β - 二羥基-5 β -膽烷酸，以下簡(jiǎn)稱UDCA)以及牛磺/甘氨熊去氧膽酸(T/GUDCA)是中藥材熊膽的主要有效成份。然而，由于中藥熊膽粉主要的獲取方式為“活熊引流取膽”，這有違野生動(dòng)物保護(hù)法。并且被認(rèn)為是非常不人道的獲取方式。另外，化學(xué)合成法過程復(fù)雜、得率較低。然而動(dòng)物膽汁中存在眾多膽酸類物質(zhì)，如牛、羊膽酸、鵝去氧膽酸、熊膽酸、豬膽酸、豬去氧膽酸等，這些物質(zhì)可以通過適當(dāng)?shù)纳锱嘤D(zhuǎn)化成UDCA及其衍生物，其中在雞膽汁中鵝去氧膽酸(CDCA)以及?；?甘氨鵝去氧膽酸(Τ/ G⑶CA)含量豐富。⑶CA與UDCA的差別僅在于7位羥基的差向異構(gòu)，利用7 α、7 β -羥基類固醇脫氫酶(7 α、7 β -HSDH)可以將CDCA、T/GCDCA轉(zhuǎn)化為UDCA、T/GUDCA。來自撒丁島梭菌(Clostridium sardiniense，DSM599/ATCC27555)的 7 α、7 β-HSDH 酶可以實(shí)現(xiàn)上述轉(zhuǎn)化過程。因此，為了快速獲取大量的和高純度的7 a -HSDH酶，本發(fā)明提出通過密碼子優(yōu)化的7a-HSDH酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。原核表達(dá)在短時(shí)間內(nèi)可以得到大量產(chǎn)物，而為了得到有活性、結(jié)構(gòu)完整的目的蛋白，分析基因中使用頻率較低的密碼子并進(jìn)行替換從而得到優(yōu)化的基因序列是十分必要的。另外，原核表達(dá)時(shí)采用原核表達(dá)載體pGEX-6p-l與目的基因進(jìn)行GST融合表達(dá)，得到的融合表達(dá)蛋白往往具有正確的空間結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的酶活，并且GST融合蛋白純化方法簡(jiǎn)單快速，從而能夠快速得到有活性的目的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于此，本發(fā)明的目的之一是提供密碼子經(jīng)過改造且mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的密碼子優(yōu)化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示。該優(yōu)化基因在不改變蛋白質(zhì)氨基酸序列的前提下，綜合考慮密碼子使用頻率，按照大腸桿菌的偏愛性進(jìn)行優(yōu)化，使其在宿主細(xì)胞中的表達(dá)量和純度顯著提高；本發(fā)明的目的之二是提供含密碼子優(yōu)化的7 α -羥基類固醇脫氫酶基因的重組表達(dá)載體 pGEX-6p-l-7 a -HSDH ；本發(fā)明的目的之三是提供含密碼子優(yōu)化的7 α -羥基類固醇脫氫酶基因的重組表達(dá)載體的大腸桿菌。本發(fā)明采用密碼子優(yōu)化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因與原核表達(dá)載體pGEX-6p-l在大腸桿菌中GST融合表達(dá)，在短時(shí)間內(nèi)可以生成大量有活性、結(jié)構(gòu)完整的目的蛋白，而且GST融合蛋白純化方法簡(jiǎn)單快速，從而能夠快速得到有活性的目的蛋白。


圖I為本發(fā)明優(yōu)化前后7 a -HSDH基因序列比較圖2Α為本發(fā)明7 a -HSDH基因優(yōu)化前表達(dá)的7 α -羥基類固醇脫氫酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳2Β為本發(fā)明7 a -HSDH基因優(yōu)化后表達(dá)的7 α -羥基類固醇脫氫酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳3為本發(fā)明不同pH條件下優(yōu)化的7 a -HSDH催化⑶CA氧化的酶活比較
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例和附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明，這些實(shí)施例和附圖僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍。本發(fā)明不限于下述實(shí)施方式或?qū)嵤├?，凡不違背本發(fā)明精神所做出的修改及變形，均應(yīng)包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。 實(shí)施例1:7α-羥基類固醇脫氫酶基因的優(yōu)化設(shè)計(jì)和合成稀有密碼子的分析稀有密碼子主要通過軟件Ε. coli Codon Usage Analysis2. O(Morris Maduro,參考Analysis and Predictions from Escherichia coli sequencesin:Escherichia coli and Salmonella, Vol. 2，Ch. 114:2047-2066，1996，Neidhardt FCed.，ASM press, Washington, D. C.)分析得到在大腸桿菌中的使用相對(duì)頻率低于閾值(10%。)的密碼子。優(yōu)化稀有密碼子根據(jù)不同密碼子在大腸桿菌中的使用頻率將使用頻率低于閾值的密碼子進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果如下本發(fā)明所用的優(yōu)化密碼子
優(yōu)化前I優(yōu)化后I氨基酸I優(yōu)化前I優(yōu)化后I氨基酸 AAGAAACTACTG
ACAACCThrCTCCTG
AGACGCAriGGAGGCGl^
AGGCGCAriGTAGTGV^l
AGTAGCS^rTCAAGCS^r
ATAATT Τ^TCCAGCS^r
CAACAGGinTGTTGC
CCACCGProTTACTGΠ
CCTCCGPro優(yōu)化前后的7 a -HSDH基因序列如圖I所示，紅色部分為優(yōu)化前后變化的核苷酸序列，點(diǎn)“......”表示優(yōu)化前后未改變的核苷酸序列。優(yōu)化后的7 a -HSDH的序列與優(yōu)化前
的序列的同源性為81%。優(yōu)化后的7 a -HSDH基因序列如SEQ ID NO. I所示。密碼子優(yōu)化后7 a-HSDH基因進(jìn)行全基因合成，且在基因前后兩端分別添加了BamHI和Not I酶切位點(diǎn)。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。實(shí)施例2 :優(yōu)化的7 α -羥基類固醇脫氫酶基因的重組表達(dá)載體pGEX-6p-l-7 a -HSDH的構(gòu)建和含該重組表達(dá)載體的大腸桿菌的獲得⑴菌株和質(zhì)粒大腸桿菌BL21菌株，購(gòu)自天津博美科生物技術(shù)有限公司。表達(dá)載體pGEX_6p_l :購(gòu)自 GE 公司(GE Healthcare)。
⑵重組表達(dá)載體的構(gòu)建和含該重組表達(dá)載體的大腸桿菌的獲得利用限制性內(nèi)切酶BamH I /Not I雙酶切優(yōu)化后的基因并回收目的基因片段；用限制性內(nèi)切酶BamH I /Not I雙酶切原核表達(dá)載體pGEX_6p-l并回收目的載體片段；連接，利用熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌；PCR篩選陽(yáng)性克隆，再進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，得到序列完全正確的重組表達(dá)載體pGEX-6p-l-7 a -HSDH及含該重組表達(dá)載體的大腸桿菌。實(shí)施例3 :優(yōu)化的7 α -羥基類固醇脫氫酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)將轉(zhuǎn)入成功的大腸桿菌重組菌株按5%的添加量加入LB液體培養(yǎng)基中，220rpm、37°C培養(yǎng)。待0D600為O. 5時(shí)，16°C IPTG誘導(dǎo)12小時(shí)，使大腸桿菌產(chǎn)生GST融合蛋白。將誘導(dǎo)完成的大腸桿菌IOOOOrpm離心3min收集菌體，300W超聲破壁菌液5min至澄清；4°C 14000rpm離心15min收集上清液；上清液與谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B(Glutathione Sepharose 4B medium,購(gòu)自 GE healthcare 公司)4°C 結(jié)合 2h 使 GST 融合蛋白結(jié)合于谷胱甘肽瓊脂糖凝膠中，再利用預(yù)冷的五倍體積O. 25%吐溫20的PBS (IOOmM)溶液沖洗三次，利用預(yù)冷的五倍體積PBS (IOOmM)沖洗三次。再利用PreScission Protease酶4°C直接酶切含GST融合蛋白的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠12h，離心得到目的蛋白。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE )鑒定。優(yōu)化前后表達(dá)的7α-羥基類固醇脫氫酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定結(jié)果如圖2Α和圖2Β所示，圖2Α為優(yōu)化前的電泳圖，圖2Β為優(yōu)化后的電泳圖，圖中“酶切前”的電泳條帶為直接將含有GST融合蛋白的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠切取小部分電泳獲得，圖中“酶切后”的電泳條帶為用PreScission Protease酶酶切GST融合蛋白且離心得到的目的蛋白進(jìn)行電泳而獲得，圖中箭頭所指為7 α -羥基類固醇脫氫酶的蛋白條帶，大小約26kDa，與理論值一致。通過BandScan軟件分析凝膠圖中箭頭所指的目的蛋白條帶的灰度，計(jì)算目的蛋白7 α -羥基類固醇脫氫酶的含量，結(jié)果顯示優(yōu)化后7 a -HSDH的純度由89. 4%提高到了95. 6%。實(shí)施例4 :不同pH條件下優(yōu)化的7 a -HSDH催化⑶CA氧化酶活的測(cè)定將PreScission Protease酶酶切后離心得到的優(yōu)化的目的蛋白通過二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid, BCA)(Thermo Scientific 公司)法測(cè)定蛋白濃度為 2mg/mL。按 1:1加入無菌甘油，混勻并分裝。-80°C保存。酶活測(cè)定原理7 a -HSDH可以催化⑶CA氧化生成7_酮石膽酸(7-KLCA)，同時(shí)將氧化型輔酶II (NADP+)轉(zhuǎn)化成為還原型輔酶II (NADPH)，后者在340nm處有特異的光吸收，所以通過測(cè)定反應(yīng)體系在340nm處光吸收在單位時(shí)間內(nèi)的增加量可以計(jì)算出7-KLCA在單位時(shí)間內(nèi)的生成量，進(jìn)而得到7 a -HSDH催化⑶CA的酶活力。NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定:取O. IM NADPH母液稀釋得到濃度為O. 005,0. 01,0. I、
O.2,0. 3,0. 4mM NADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液，檢測(cè)340nm處的光吸收值。以NADPH濃度為X軸、340nm處的光吸收值為Y軸繪制NADPH的標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活測(cè)定具體步驟室溫條件下，向比色皿中加入196 μ L 10mg/mL⑶CA甲醇溶液，將甲醇揮發(fā)完全；加入2mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，充分吹打混勻(⑶CA終濃度為2. 5mM)；加入4 μ L O. IM NADP+溶液(NADP+終濃度為O. 2mM);加入10 μ L上述保存的7 a -HSDH0混勻后立即置于分光光度計(jì)中調(diào)零。開始計(jì)時(shí)，每分鐘讀取一次340nm處光吸收的變化值。光吸收的變化值通過NADPH的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程換算成底物在單位時(shí)間內(nèi)的增加量。進(jìn)而計(jì)算出酶的活力。酶活力單位(U)定義在上述反應(yīng)條件下，催化每分鐘生成I μ mol7-酮石膽酸(7-KLCA)所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位。 不同pH (6. 5-9)環(huán)境下，優(yōu)化的7 a -HSDH的相對(duì)活性比較如圖3所示，橫坐標(biāo)為PH值，縱坐標(biāo)為7 a -HSDH催化⑶CA氧化的相對(duì)活性，則PH為8. O時(shí)7 a -HSDH的活性最高，PH為7. 5時(shí)次之。上述實(shí)施例說明通過密碼子優(yōu)化的7 a -HSDH基因在大腸桿菌中經(jīng)融合表達(dá)和酶切得到了純度更高的且有活性的目的蛋白，純度高相應(yīng)地說明了有活性的目的蛋白的量的提聞。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。附本發(fā)明設(shè)計(jì)的DNA序列SEQ ID NO. I密碼子優(yōu)化的7 α -羥基類固醇脫氫酶基因核苷酸序列
ATGAAACGCCTGGAAGGCAAAGTGGCAATTGTGACCAGCTCTACTCGTGGCATTGGCCGTGCATCTGCAGAAGCACTGGCAAAAGAAGGTGCTCTGGTGTATCTGGCAGCACGTAGCGAGGAACTGGCTAATGAAGTTATTGCAGATATTAAAAAACAGGGTGGCGTGGCTAAATTTGTTTACTTTAATGCTCGTGAAGAAGAAACTTACACTAGCATGGTGGAAAAAGTTGCTGAAGCTGAAGGCCGCATTGATATTCTGGTTAATAACTACGGTGGCACCAATGTTAATCTGGATAAAAACCTGACTGCTGGCGATACCGATGAATTCTTTCGCATTCTGAAAGATAACGTTCAGAGCGTGTACCTGCCGGCAAAAGCTGCTATTCCGCATATGGAAAAAGTGGGCGGTGGCAGCATTGTTAATATCAGCACTATTGGCAGCGTTGTTCCGGATATTAGCCGCATTGCTTACTGCGTGAGCAAAAGCGCTATTAACTCTCTGACTC
AGAACATTGCACTGCAGTATGCACGCAAAAATATCCGCTGCAATGCAGTGCTGCCGGGTCTGATTGGCACTCGCGCAGCACTGGAAAATATGACTGATGAATTTCGCGACAGCTTCCTGGGCCATGTTCCGCTGAATCGCGTGGGCCGCCCGGAAGATATTGCAAATGCAGTTCTGTACTATGCCTCTGATGATAGCGGTTATGTGACCGGCATGATTCATGAAGTTGCAGGCGGTTTTGCACTGGGCACTCCGC
AGTATAGCGAATACTGCCCGCGCTAA
權(quán)利要求
1.密碼子優(yōu)化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQIDNO. I所示。
2.含權(quán)利要求I所述密碼子優(yōu)化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因的重組表達(dá)載體pGEX-6p-l-7a -HSDH。
3.含權(quán)利要求2所述重組表達(dá)載體的大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了密碼子優(yōu)化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因、含所述優(yōu)化基因的重組表達(dá)載體pGEX-6p-1-7α-HSDH和含所述重組表達(dá)載體的大腸桿菌。本發(fā)明采用密碼子優(yōu)化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因與原核表達(dá)載體pGEX-6p-1在大腸桿菌中GST融合表達(dá)，在短時(shí)間內(nèi)可以生成大量有活性、結(jié)構(gòu)完整的目的蛋白，而且GST融合蛋白純化方法簡(jiǎn)單快速，從而能夠快速得到有活性的目的蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/53GK102827848SQ20121026049
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月25日
發(fā)明者王伯初, 婁德帥, 譚君, 祝連彩, 季慶治, 岑小惜, 劉紹勇 申請(qǐng)人:上海凱寶藥業(yè)股份有限公司