專利名稱：新的7α-羥類固醇脫氫酶敲除突變體及其用途的制作方法
新的 α-羥類固醇脫氫酶敲除突變體及其用途本發(fā)明涉及新的微生物7α-羥類固醇脫氫酶(7C1-HSDH)敲除突變體，和將其用于產(chǎn)生不同功能性的其他的HSDHs (例如3 α -、7 β -或者12 a -HSDH)的用途，以及由此產(chǎn)生的HSDH酶在膽酸化合物的酶促反應(yīng)中，并且特別是在熊去氧膽酸(UDCA)的產(chǎn)生中的用途；本發(fā)明尤其涉及合成UDCA的新方法。發(fā)明背景:活性物質(zhì)熊去氧膽酸(UDCA)和相關(guān)的非對映異構(gòu)體鵝去氧膽酸(⑶CA)已經(jīng)多年被應(yīng)用于膽結(jié)石的藥物治療。這兩種化合物僅在第7位的C原子上的羥基的構(gòu)型不同(UDCA: β-構(gòu)型，⑶CA: α-構(gòu)型)。在現(xiàn)有技術(shù)中，描述了產(chǎn)生TOCA的多種方法，其完全用化學(xué)方法進行或者由化學(xué)和酶處理步驟的組合組成。在每種情況下，起點是膽酸(CA)或者從膽酸生成的⑶CA。因此產(chǎn)生UDCA的經(jīng)典的化學(xué)方法可以以圖示表示如下:
權(quán)利要求
1.重組微生物，其中抑制了7α-羥類固醇脫氫酶(7C1-HSDH)的酶活性，同時可表達地含有功能不同的羥類固醇脫氫酶(例如，3 α -、3 β -、7 β _、11 α -、11 β -、12 α -、12 β _、17 α -、17 β -、20 α -或 20 β -HSDH,尤其 3α-、7β -或 12 α -HSDH)的酶活性。
2.權(quán)利要求1要求保護的重組微生物，其中通過同源重組或者通過基因破壞(特別是通過插入抑制編碼的基因產(chǎn)物的酶功能的核酸序列)敲除編碼7 a -HSDH的核酸序列。
3.前面權(quán)利要求的一個要求保護的重組微生物，其來源于表達7a -HSDH的前體微生物，特別是內(nèi)源表達7 a -HSDH的前體微生物，特別是埃希氏菌屬細菌，尤其大腸桿菌。
4.前面權(quán)利要求的一個要求保護的重組微生物，其重組表達在功能上不同于7 a -HSDH 的 HSDH,特別是如 3 α -、7 β -和 / 或 12 a -HSDH0
5.前面權(quán)利要求的一個要求保護的重組微生物，其中所述被敲除的7a -HSDH具有根據(jù)SEQ ID NO: 10的氨基酸序列或者由根據(jù)SEQ ID ΝΟ:9的核酸序列編碼。
6.前面權(quán)利要求的一個要求保護的重組微生物，其中所述表達的功能上不同于7 a -HSDH的HSDH含有以下的氨基酸序列的一個: a)3 a -HSDH 序列，其選自 SEQIDNO: 29 和 31 b)7 β -HSDH 序列，其選自 SEQIDNO: 25 和 c)12 a-HSDH 序列，其選自 SEQIDNO: 12，14，16 ;或 d)從上述衍生的氨基酸序列，其編碼與a)，b)和c)下的序列的一個具有至少50%的同一性程度的HSDH。
7.用于重組產(chǎn)生功能上不同于7a -HSDH的所希望的HSDH的方法，其中在表達所希望的HSDH的條件下培養(yǎng)7 a -HSDH酶活性受抑制的如前述權(quán)利要求之一要求保護的重組微生物，并且分離由此表達的HSDH，其中在所述分離的HSDH中基本上檢測不到功能性的7 a -HSDH0
8.重組HSDH，其選自 3α-、3β-、7β-、11α-、11β-、12α-、12β_、17α-、17β-、20 α -或20 β -HSDH,特別地選自3 α -、7 β -和12 a -HSDH,所述重組HSDH不被7 a -HSDH酶或酶活性污染，可從權(quán)利要求1至6的一個要求保護的重組微生物獲得。
9.權(quán)利要求8要求保護的重組HSDH，其包含選自下組的氨基酸序列: a)3 a -HSDH 序列，其選自 SEQIDNO: 29 和 31 b)7 β -HSDH 序列，其選自 SEQIDNO: 25 和 c)12 a-HSDH 序列，其選自 SEQIDNO: 12，14，16 ;和 d)從上述衍生的氨基酸序列，其與a)，b)和c)下的序列的一個具有至少50%的同一性程度。
10.選擇性地酶促氧化羥類固醇的方法，所述羥類固醇除了在類固醇結(jié)構(gòu)的3α-、3β _、11 α -、11 β -、12 α -、12 β _、17 α -、17 β -、20 α -或 20 β -位的至少一個，特別是在類固醇結(jié)構(gòu)的12α-位上含有羥基外，還在類固醇結(jié)構(gòu)的7α-位上含有至少一個另外的羥基，其中在 3 α -、3β _、11 α -、11 β -、12 α -、12 β -、17 α -、17 β -、20 α -或 20 β -HSDH 的存在下，特別是在權(quán)利要求8或9要求保護的12 a -HSDH的存在下，或者在權(quán)利要求1至6的一個要求保護的重組微生物的存在下，羥類固醇被反應(yīng)，并且任選地從反應(yīng)批次分離所形成的至少一種氧化產(chǎn)物。
11.權(quán)利要求10要求保護的方法，其中所述羥類固醇是膽酸(CA)或膽酸衍生物，如，特別是膽酸的鹽、酰胺或者烷基酯。
12.權(quán)利要求11要求保護的方法，其中所述CA或其衍生物反應(yīng)產(chǎn)生12-酮鵝去氧膽酸(12-酮-⑶CA)或者產(chǎn)生相應(yīng)的衍生物。
13.用于產(chǎn)生通式(I)的熊去氧膽酸(UDCA)的方法
14.選擇性地酶促還原酮類固醇的方法，所述酮類固醇除了在類固醇結(jié)構(gòu)的3、11、12、17或20位，特別是在類固醇結(jié)構(gòu)的12位和/或3位上具有至少一個酮基外，還在類固醇結(jié)構(gòu)的7位上具有至少一個另外的酮基，其中在3 α -、3 β _、7 β -Ul α -、11 β -、12 α -、12 β -、17 α -、17 β-、20 α -或20 β -HSDH的存在下，特別是在權(quán)利要求8或9要求保護的7 β -HSDH和/或3 a -HSDH和/或12 a -HSDH的存在下，或者在權(quán)利要求1至6的一個要求保護的重組微生物的存在下，酮類固醇被反應(yīng)，并且任選地從反應(yīng)批次分離所形成的至少一種還原產(chǎn)物。
15.權(quán)利要求10至14的一個要求保護的方法，其中所述催化所希望的反應(yīng)的至少一種HSDH (如，特別是7 β -HSDH,3 a -HSDH和/或12 a -HSDH)以溶解的、分散的或者固定化形式使用；或者其中所述方法在權(quán)利要求1至6的一個要求保護的重組微生物的全細胞，任選地固定化細胞的存在下進行。
16.產(chǎn)生通式(I)的熊去氧膽酸(UDCA)的方法
17.權(quán)利要求10至16的一個要求保護的方法，其中將所述酶促氧化還原步驟與(特別是酶促)輔因子再生步驟偶聯(lián)。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的微生物7α-羥類固醇脫氫酶(7α-HSDH)敲除突變體，和將其用于產(chǎn)生具有不同功能性的其他的HSDHs(例如3α-、7β-或者12α-HSDH)的用途，以及由此產(chǎn)生的HSDH酶在膽酸化合物的酶促反應(yīng)中，并且特別是在熊去氧膽酸(UDCA)的產(chǎn)生中的用途。本發(fā)明尤其涉及合成UDCA的新方法。
文檔編號C07K14/245GK103097400SQ201180036506
公開日2013年5月8日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者R·施密德, M·布勞恩, L·劉, A·艾格納, D·沃伊斯特－博茨 申請人:細胞制藥有限公司