專利名稱：一種計算機圖像識別細胞分離方法及系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物細胞分離技術(shù)，具體涉及其一種基于細胞顏色對細胞進行分離的技術(shù)。
背景技術(shù)：
生物細胞分離在生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)上具有廣泛的應(yīng)用和重要價值，如臨床血液分析疾病診斷、細菌分析、單細胞基因診斷、藥物注射等。目前，已有的細胞分離方法有多種，常用的細胞分離技術(shù)以流式細胞儀為主，但是流式細胞儀設(shè)備昂貴、體積龐大、需要專人操作、細胞用量大，難以在實驗室和醫(yī)院得到廣泛應(yīng)用。還有根據(jù)細胞物理或化學(xué)特性產(chǎn)生的其它分離方法，如離心法，利用不同細胞的密度物理特性，采用離心技術(shù)，使細胞分層，從而達到分離的目的，由于細胞種類繁多，密度特性非常接近，離心技術(shù)很難把它們徹底分離，存在分辨能力差、分離不徹底等缺點。還有 使用細胞對激光散射原理分離細胞，這種分離方法需要采集微弱的散射光作為區(qū)分不同的細胞，所以，對檢測環(huán)境、設(shè)備精度要求很高，以至于設(shè)備龐大、成本高、抗干擾能力差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出一種計算機圖像識別細胞分離方法及系統(tǒng)，以期達到簡化分離系統(tǒng)，具有自動化程度高、效率高、應(yīng)用面廣、潔凈度高，細胞污染小、設(shè)備簡單，成本低廉等優(yōu)點。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的思路是應(yīng)用細胞染色原理，對不同細胞添加不同的染色質(zhì)后，由于細胞種類不同，使得染出來的細胞具有不同的顏色，如顏色A、顏色B，顏色C，顏色D等，這就可以利用計算機圖像顏色識別技術(shù)，分離出不同種類細胞。本發(fā)明提出以下技術(shù)方案
一種計算機圖像識別細胞分離方法，所述方法包括以下步驟
(1)針對細胞懸液中包含的不同種類細胞，用不同的染料對細胞進行染色；
(2)將染色的細胞懸液注入細胞分離芯片中，通過鞘流方法，使細胞流在芯片的細胞溶液通道中為單細胞流動，在細胞溶液通道上設(shè)置有多個分叉通道，每一個分叉位置設(shè)置有一對微電極，在細胞懸液流動過程中，用計算機圖像自動識別裝置在每一個分叉通道位置實時識別流經(jīng)細胞的顏色；
(3)在通道分叉位置，當計算機識別到細胞顏色不是顏色A時，便發(fā)出指令，通過信號發(fā)生器給位于該分叉通道位置的微電極對施加脈沖電壓信號，使不是顏色A的細胞在電泳力作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn)，沿著分叉通道向前流動；而當計算機識別出細胞是顏色A時，計算機不發(fā)出指令，細胞沿此處的直行通道向前流動，從而分離出顏色A的細胞；
(4)按步驟(2)的過程，當細胞溶液到達下一分叉通道位置時，計算機又進行識別，當識別出細胞顏色不是顏色B時，則發(fā)出指令，對該位置的微電極對施加脈沖電壓，使不是顏色B的細胞在電泳力作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn)，沿這一位置的分叉通道流出；而當計算機識別出細胞是顏色B時，計算機不發(fā)出指令，細胞沿此處的直行通道向前流動，從而分離出顏色B的細胞；
(5)以此類推，分別分離出第三種、第四種以及更多種顏色的細胞，直至將待分離細胞懸液中需要分離的不同顏色的細胞分離完全為止。本發(fā)明進一步提出了實現(xiàn)上述方法的計算機圖像識別細胞分離系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括計算機圖像識別系統(tǒng)和細胞分離芯片，細胞分離芯片的細胞溶液通道上設(shè)置多條分叉通道，在每一個分叉通道的分叉位置設(shè)置微電極；所述計算機圖像識別系統(tǒng)的圖像采集裝置對準細胞分離芯片，用于采集細胞圖像，計算機圖像識別系統(tǒng)內(nèi)的分析軟件用于識別制定區(qū)域內(nèi)細胞的顏色，所述計算機圖像識別系統(tǒng)控制細胞分離芯片的信號發(fā)生器，信號發(fā)生器與細胞分離芯片上的微電極進行電信號連接，根據(jù)計算機的指令給微電極施加電信號。本發(fā)明提出的以上方法和系統(tǒng)具有以下明顯的優(yōu)點
(1)自動化程度高。由于是計算機自動識別，自動控制細胞分離，無需人工干預(yù)，能從細胞注入到自動分離過程全自動化；
(2)效率高。計算機高速識別與控制，能夠快速識別和分離不同種類細胞，有利于保持細胞活性；另一方面，隨著芯片分離通道數(shù)量的增加，可以同時對多種不同的細胞進行一次性分離，大大提高混有多種細胞的一次性分離效率；
(3 )應(yīng)用面廣。所有細胞均能實現(xiàn)染色和電泳，所以，凡是不同種類細胞混雜在一起均可以采用該發(fā)明技術(shù)予以分離；
(4)潔凈度高，細胞污染小。由于采用微芯片系統(tǒng)，細胞在封閉的狹小空間受微電極周圍電場控制，芯片消毒方便，工作環(huán)境潔凈度高，細胞受到污染??；
(5)設(shè)備簡單，成本低廉。系統(tǒng)組成簡單，分離芯片、信號發(fā)生器等設(shè)備造價低廉，制造技術(shù)要求不高。


圖I是實現(xiàn)本發(fā)明的系統(tǒng)原理 圖2是細胞分離芯片的局部示意圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖進一步說明本發(fā)明
本方法是應(yīng)用生物學(xué)上細胞染色原理，對不同細胞添加不同的染料后，由于細胞種類不同，使得染出來的細胞具有不同的顏色，利用計算機圖像顏色識別技術(shù)，達到分離不同種類細胞的目的。參見圖1，計算機圖像識別細胞分離系統(tǒng)包括計算機圖像識別系統(tǒng)和細胞分離芯片2。如圖2所示，細胞分離芯片利用鞘流方法，使細胞在芯片的細胞溶液通道內(nèi)為單 細胞流動，并采用在細胞溶液通道上順序設(shè)置多條分叉通道的形式，在每一個分叉通道的分叉位置的通道兩側(cè)設(shè)置微電極A1-K1、A2-K2。計算機圖像識別系統(tǒng)的圖像采集裝置1(包括顯微鏡和CCD攝像頭)對準細胞分離芯片2，用于采集細胞圖像，計算機4內(nèi)的圖像識別分析軟件用于根據(jù)圖像分析出細胞的顏色，計算機圖像識別系統(tǒng)的計算機4與細胞分離芯片的信號發(fā)生器3連接，信號發(fā)生器3與細胞分離芯片2上的介電電泳電極Al-Kl、A2-K2進行電信號連接，根據(jù)計算機4的指令給電極施加電信號。細胞分離的方法如下
I、細胞染色
以分離人外周血淋巴細胞為例。我們知道，在人外周血中，主要存在有諸如T細胞、B細胞、自然殺傷(NK)細胞等各類淋巴細胞。這些細胞的分類主要由它們的表面抗原決定的，如成熟T細胞表達⑶3抗原，B細胞則是⑶19陽性細胞，剩余部分多數(shù)為NK細胞(外周血中一般認為⑶3-/⑶56+細胞為NK細胞，所以如果需要鑒定分離真正的NK細胞，還需要鑒定CD56抗原)。(I)初級分選。把準備好的FITCX激發(fā)光488nm，發(fā)射光525nm，綠光)標記的⑶3抗體(⑶3-FITC， 綠色)和PE (激發(fā)光488nm，發(fā)射光575nm，橙色光)標記的⑶19 (⑶19-PE，橙色)抗體與外周血混合后，根據(jù)細胞表面自身抗原的特異性，這些抗原就會識別并結(jié)合相應(yīng)的抗體，從而間接的給細胞進行標記染色，如B細胞結(jié)合CD19-PE，顯橙色。把細胞懸液勻速流經(jīng)細胞分離芯片。當成熟T細胞(此時已攜帶綠光)經(jīng)過信號發(fā)生器時，就會直接進入綠色通道。而攜帶紅光標記的B細胞經(jīng)過時，就會發(fā)生偏轉(zhuǎn)，進入另外一個通道。同理，當B細胞進入另外通道的下一個信號檢測器時，就會被正確識別。最后，不經(jīng)標記的細胞就是以NK細胞為主的群體。(2)次級分選。以分選T細胞亞群為例。因為成熟T細胞只能表達⑶4或⑶8分子，所以在⑶3+的成熟T細胞中又可按照⑶4、⑶8抗原差異分為輔助性T細胞(Th)和殺傷性T細胞(Ts)兩個亞型。以PE-Cy5(激發(fā)光488nm，發(fā)射光670nm，呈紅光)標記的CD4抗體(記為CD4_PE_Cy5，紅色)。同理，PE標記的⑶8抗體記為⑶8-PE(橙色)。注意，因為此時再分選的⑶3+細胞已帶FITC標記的綠色熒光，不能再用FITC標記的抗體進行標記。根據(jù)細胞表面自身抗原的特異性，這些抗原就會識別并結(jié)合相應(yīng)的抗體，從而間接的給細胞進行標記染色。當這些不同熒光標記的抗體加入到上述分離好的CD3+細胞懸液后，混勻，流經(jīng)細胞分離芯片。在⑶3+細胞中，再根據(jù)⑶4和⑶8的表達差異分選Th細胞(⑶3+/⑶4+，此時細胞呈紅綠色)和Ts細胞(CD3+/CD8+，黃綠色)；當細胞經(jīng)過信號檢測器時，就會識別紅色與橙色，進行篩選。同理，在⑶3-細胞中，又可以根據(jù)⑶16和⑶56的差異進一步分選。⑶16表達于大多NK細胞上，但也表達于中性粒細胞上。這種抗原在NK細胞的表達比較弱并在NK細胞活化時丟失。⑶56表達于大多數(shù)的(但并不是全部)NK細胞上，也表達于一些T淋巴細胞上。與⑶3聯(lián)合使用，可以區(qū)分⑶3+/⑶56+ T淋巴細胞和⑶3-/⑶56+NK細胞。聯(lián)合使用三種單抗能最完全的鑒定所有的NK細胞。NK細胞或表達⑶16，或表達⑶56，但它們不表達CD30CD16和CD56聯(lián)合使用，根據(jù)熒光強度可將NK細胞從雙陰性細胞中區(qū)分出來。這樣運用該組試劑，NK細胞可形成獨立的群體與其他細胞相區(qū)分。2、將細胞懸液注入細胞分離芯片中，細胞懸液從第I區(qū)域處流入，當細胞懸液要進入到第II區(qū)域時(即圖中虛線內(nèi)所示的圖像識別區(qū)域)，即將要進入到第一個分叉通道位置時，計算機的圖像采集裝置I采集細胞圖像，由圖像識別分析軟件根據(jù)圖像分析出細胞的顏色，當識別出細胞為非綠色時，計算機發(fā)出指令，使信號發(fā)生器給Al-Kl這對電極施加脈沖電壓信號，細胞在電泳力作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn)，沿著第一個分叉通道CH2向前流動；當計算機識別出進入此處的細胞是綠色時，計算機不發(fā)出指令，信號發(fā)生器不給Al-Kl施加電壓信號，綠色細胞通過第一個直行通道CHl沿直線方向向前流動，從而分離出綠色細胞。3、同上述原理，當細胞溶液進入第III區(qū)域時(即圖中虛線內(nèi)所示的第二個圖像識別區(qū)域)，計算機識別出細胞顏色非紅色時，則發(fā)出指令給信號發(fā)生器，對A2-K2施加脈沖電壓，使非紅色細胞在電泳力作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn)，沿下一個分叉通道CH3流出。否則，計算機不發(fā)出指令，紅色細胞通過第二個直行通道CH4沿直線方向向前流出，即分離出紅色細胞。
以此類推，可以實現(xiàn)不同顏色的細胞分離。本發(fā)明的細胞分離芯片的結(jié)構(gòu)包括PDMS通道層和底部電極層。PDMS通道層可以采用微加工技術(shù)制作而成，PDMS通道層和底部電極層采用顯微配準方式進行配準鍵合，PDMS通道層在配準前可進行等離子表面處理，以提高PDMS通道層和底部電極層的鍵合牢固度。
芯片的PDMS通道層的具體加工工藝流程可采用如下形式
A.選取硅片或玻璃片為基底；
B.懸涂SU-8光刻膠于基底表面；
C.經(jīng)前烘、光刻、后烘、顯影、硬烘形成通道所需的陽模；
D.將所得陽模固定于一培養(yǎng)皿上；
E.倒入混合好的PDMS混合膠，靜止后抽真空；
F.置于加熱臺上75°C固化；
G.揭下固化后PDMS，根據(jù)底層結(jié)構(gòu)形狀剪裁，并去除進樣口、出樣口的膠即可。細胞分離芯片的底部電極層采用腐蝕等方式制作，具體加工工藝流程如下
A.選取表面氧化硅片或石英玻璃片為基底；
B.濺射金或鉬在基底表面形成導(dǎo)電層，為提高金鉬與基底的粘附性，可先濺射鉻或鈦在基底層表面；
C.懸涂AZ4620等光刻膠于導(dǎo)電層表面；
D.光刻顯影獲得微電極相同的圖形；
E.采用濕法腐蝕方法去除光刻膠圖像之外的導(dǎo)電層；
F.利用丙酮去除光刻膠，獲得微電極結(jié)構(gòu)。
權(quán)利要求
1.一種計算機圖像識別細胞分離方法，其是應(yīng)用細胞染色原理，針對不同待分離目標細胞選取添加不同的染料，由于細胞種類不同，使得染出來的細胞呈現(xiàn)不同的顏色，利用計算機圖像顏色識別技術(shù)，辨別不同顏色的細胞，并結(jié)合電泳分離技術(shù)達到分離不同種類細胞的目的；所述方法包括以下步驟 (1)針對細胞懸液中包含的不同種類細胞，用不同的染料對細胞進行染色； (2)將染色的細胞懸液一起注入細胞分離芯片中，通過鞘流方法，使細胞流在芯片的細胞溶液通道中形成單細胞流動；細胞溶液通道上設(shè)置有多個分叉通道，每一個分叉位置設(shè)置有一對微電極，在細胞懸液流動過程中，用計算機圖像自動識別裝置在每一個分叉通道位置前實時識別流經(jīng)細胞的顏色； (3)在通道分叉位置，當計算機識別到流經(jīng)該位置的細胞不是顏色A時，便發(fā)出指令，通過信號發(fā)生器給位于該分叉通道位置的微電極對施加脈沖電壓信號，使不是顏色A的細胞在電泳力作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn)，沿著分叉通道向前流動；而當計算機識別出細胞是顏色A時， 計算機不發(fā)出指令，細胞沿此處的直行通道向前流動，從而分離出顏色A的細胞； (4)按步驟(2)的過程，當細胞溶液到達下一分叉通道位置前，計算機又進行識別，當識別出細胞顏色不是顏色B時，則發(fā)出指令，對該位置的微電極對施加脈沖電壓，使不是顏色B的細胞在電泳力作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn)，沿這一位置的分叉通道流出；而當計算機識別出細胞是顏色B時，計算機不發(fā)出指令，細胞沿此處的直行通道向前流動，從而分離出顏色B的細胞； (5)以此類推，分別分離出第三種、第四種以及更多種顏色的細胞，直至將待分離細胞懸液中需要分離的不同顏色的細胞分離完全為止。
2.一種實現(xiàn)權(quán)利要求I所述方法的計算機圖像識別細胞分離系統(tǒng)，其包括計算機圖像識別系統(tǒng)和細胞分離芯片，其特征在于所述細胞分離芯片中有細胞溶液通道，在細胞溶液通道上設(shè)置多條分叉通道，在每一個分叉通道的分叉位置對應(yīng)設(shè)置微電極；所述計算機圖像識別系統(tǒng)的圖像采集裝置對準細胞分離芯片，用于采集細胞圖像，計算機圖像識別系統(tǒng)內(nèi)的分析軟件用于根據(jù)圖像分析出細胞的顏色，所述計算機圖像識別系統(tǒng)連接并控制細胞分離芯片的信號發(fā)生器，信號發(fā)生器與細胞分離芯片上的微電極進行電信號連接，根據(jù)計算機的指令給電極施加電信號，實現(xiàn)待分離細胞的偏轉(zhuǎn)操作。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的計算機圖像識別細胞分離系統(tǒng)，其特征在于所述微電極設(shè) 置在分叉位置的通道兩側(cè)。
全文摘要
一種計算機圖像識別細胞分離方法及系統(tǒng)，其是應(yīng)用細胞染色原理，針對不同待分離目標細胞選取添加不同的染料，由于細胞種類不同，使得染出來的細胞呈現(xiàn)不同的顏色，利用計算機圖像顏色識別技術(shù)，辨別不同顏色的細胞，并結(jié)合電泳分離技術(shù)，達到分離不同種類細胞的目的。本發(fā)明具有具有自動化程度高、效率高、應(yīng)用面廣、潔凈度高，細胞污染小、設(shè)備簡單，成本低廉等優(yōu)點。
文檔編號C12M1/00GK102703373SQ20121021233
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月26日
發(fā)明者曹毅, 楊軍, 胡寧, 蔣麗華, 鄭小林 申請人:重慶城市管理職業(yè)學(xué)院