專利名稱：一種鑒定或輔助鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒定或輔助鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系的方法。
背景技術(shù)：
快速準(zhǔn)確地鑒定品種對(duì)于品種審定、假種鑒別和產(chǎn)權(quán)糾紛均有重要作用。然而，我國很多品種真?zhèn)蔚蔫b定大多依靠田間表現(xiàn)鑒定，此法依賴于品種表現(xiàn)型差異，雖然鑒定方法直觀簡單，但是作物的表現(xiàn)型容易受到栽培措施和環(huán)境條件的影響。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從DNA水平上進(jìn)行鑒定使得結(jié)果更客觀、準(zhǔn)確。目前，用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)品種進(jìn)行鑒定的方法已經(jīng)在各種作物中進(jìn)行應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系的引物組。本發(fā)明提供的引物組，由如下10個(gè)引物對(duì)組成I)由序列表中序列I所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子組成的引物對(duì)；2)由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子組成的引物對(duì)；3)由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子組成的引物對(duì)；4)由序列表中序列I所示的DNA分子和序列表中序列8所示的DNA分子組成的引物對(duì)；5)由序列表中序列9所示的DNA分子和序列表中序列10所示的DNA分子組成的引物對(duì)；6)由序列表中序列11所示的DNA分子和序列表中序列12所示的DNA分子組成的引物對(duì)；7)由序列表中序列13所示的DNA分子和序列表中序列14所示的DNA分子組成的引物對(duì)；8)由序列表中序列15所示的DNA分子和序列表中序列16所示的DNA分子組成的引物對(duì)；9)由序列表中序列17所示的DNA分子和序列表中序列18所示的DNA分子組成的引物對(duì)；10)由序列表中序列19所示的DNA分子和序列表中序列20所示的DNA分子組成的引物對(duì)。
上述的引物組中，所述芽黃標(biāo)記光敏不育系為陸地棉(Gossypium hirsutum)CGMCCNo.5262。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系的PCR試劑組。本發(fā)明提供的PCR試劑組，由如下10個(gè)PCR試劑組成I)由上述的引物組中的I)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP和DNA聚合酶組成；2)由上述的引物組中的2)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP和DNA聚合酶組成；3)由上述的引物組中的3)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP和DNA聚合酶組成；4)由上述的引物組中的4)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP和DNA聚合酶組成；5)由上述的引物組中的5)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP和DNA聚合酶組成；6)由上述的引物組中的6)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP、DNA聚合酶組成；7)由上述的引物組中的7)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP和DNA聚合酶組成；8)由上述的引物組中的8)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP和DNA聚合酶組成；9)由上述的引物組中的9)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP和DNA聚合酶組成；10)由上述的引物組中的10)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP、DNA聚合酶組成。上述各個(gè)PCR試劑中的每條引物在各自PCR試劑中的終濃度均為0. 5 ii M ;上述芽黃標(biāo)記光敏不育系為陸地棉(Gossypium hirsutum) CGMCC No. 5262。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的引物組或上述的PCR試劑組。上述的引物組或上述的PCR試劑組或上述的試劑盒在鑒定或輔助鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。在上述應(yīng)用中，所述芽黃標(biāo)記光敏不育系具體為陸地棉(Gossypium hirsutum)CGMCCNo. 5262。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系的方法。本發(fā)明提供的方法，包括分子鑒定的步驟；所述分子鑒定為用上述的引物組或上述的PCR試劑組或上述的試劑盒中的10個(gè)引物對(duì)分別對(duì)待測樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；若擴(kuò)增產(chǎn)物為如下A-J全部所示，則所述待測樣本為或候選為芽黃標(biāo)記光敏不育系；若擴(kuò)增產(chǎn)物不為如下A-J全部所示，則所述待測樣本不為或候選不為芽黃標(biāo)記光敏不育系；、
A :1)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有150bp_160bp大小的片段；B 2)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有175bp_185bp大小的片段；
C:3)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有155bp_165bp大小的片段；D:4)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有195bp_205bp大小的片段；E:5)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有255bp_265bp大小的片段；F:6)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有165bp_175bp大小的片段；G:7)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有165bp_175bp大小的片段；H:8)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有175bp_185bp大小的片段；1:9)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有150bp_160bp大小的片段；J:10)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有165bp_175bp大小的片段和175bp-185bp大小的片段。上述方法還包括光敏不育表型鑒定的步驟；·所述光敏不育表型鑒定包括先進(jìn)行如下A和B處理，再進(jìn)行檢測A為將所述待測樣本在每天光照11小時(shí)-12小時(shí)20分的條件下進(jìn)行培育，B為將所述待測樣本在每天光照13小時(shí)-14小時(shí)40分的條件下進(jìn)行培育，若檢測結(jié)果為所述待測樣本在經(jīng)A處理后得到雄性可育表型植株，且經(jīng)B處理后得到雄性不育表型植株，則所述待測樣本為或候選為芽黃標(biāo)記光敏不育系；若所述待測樣本在經(jīng)A處理后未得到雄性可育表型植株，且經(jīng)B處理后未得到雄性不育表型植株，則所述待測樣本不為或候選不為芽黃標(biāo)記光敏不育系。上述檢測為觀察。上述光敏不育表型鑒定中的A處理中，所述每天光照為11小時(shí)2分-12小時(shí)18分；上述光敏不育表型鑒定中的B處理中，所述每天光照為13小時(shí)-14小時(shí)35分。上述分子鑒定中的PCR擴(kuò)增的模板均為待測樣本的基因組DNA ；所述芽黃標(biāo)記光敏不育系為陸地棉(Gossypium hirsutum) CGMCC No. 5262。上述方法還包括形態(tài)鑒定的步驟所述形態(tài)鑒定為培育所述待測樣本，若所述待測樣本為芽黃性狀，則所述待測樣本為或候選為芽黃標(biāo)記光敏不育系；若所述待測樣本不為芽黃性狀，則所述待測樣本不為或候選不為芽黃標(biāo)記光敏不育系。芽黃性狀指的是種子萌發(fā)后頂葉較野生型表現(xiàn)淡黃色(葉綠素含量低)，至倒五葉時(shí)恢復(fù)正常。 上述野生型為中040029。陸地棉(Gossypium hirsutum)芽黃標(biāo)記光敏雄性不育系已于2011年9月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCCNo. 5262。陸地棉(Gossypium hirsutum)CGMCC No. 5262簡稱芽黃標(biāo)記光敏雄性不育系(又稱中9106)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明篩選出10個(gè)引物對(duì)，用其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這10個(gè)引物對(duì)特異性高，可以根據(jù)10個(gè)引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物大小來鑒定或輔助鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系，再結(jié)合待測樣本的表型特征，從而實(shí)現(xiàn)芽黃標(biāo)記光敏不育系的鑒定。本發(fā)明具體采用了形態(tài)學(xué)鑒定和SSR分子標(biāo)記鑒定相結(jié)合的方法對(duì)光敏核不育系中9106進(jìn)行鑒定和保護(hù)，主要包括光敏核不育系中9106的芽黃標(biāo)記特點(diǎn)；光敏核不育系中9106育性隨光照周期的變化特性；同時(shí)以8個(gè)棉花品系為對(duì)照，通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)，尋找到10引物組合，其中每對(duì)引物在光敏核不育系中9106中相對(duì)其他8個(gè)棉花品系均具有特異條帶。


圖I為真葉期芽黃材料中9106與正常材料中040029葉綠素含量；圖2為芽黃材料中9106不育表型；圖3為芽黃材料中9106光敏可育表型；

圖4為篩選的10對(duì)特異引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。芽黃性狀指的是種子萌發(fā)后頂葉較野生型表現(xiàn)淡黃色(葉綠素含量低)，至倒五葉時(shí)恢復(fù)正常。中040029 :棉花航天誘變敏感材料的篩選及多態(tài)性分析，棉花學(xué)報(bào)，22 (4)312-318，2010 ;公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所獲得。實(shí)施例I、鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系陸地棉(Gossypium hirsutum)芽黃標(biāo)記光敏雄性不育系已于2011年9月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCCNo. 5262。陸地棉(Gossypium hirsutum)CGMCC No. 5262簡稱芽黃標(biāo)記光敏雄性不育系(又稱中9106)。一、芽黃標(biāo)記光敏不育系中9106的形態(tài)特征鑒定I、芽黃表型將陸地棉(Gossypiumhirsutum)CGMCC No. 5262 (中 9106)種子于 2007 年 4 月下旬種植于河南安陽。以中040029 (野生型)為對(duì)照。觀察結(jié)果，與對(duì)照相比，中9106子葉期苗期開始表現(xiàn)芽黃，至真葉期頂葉表現(xiàn)芽黃，相對(duì)于對(duì)照呈淡黃色。隨植株生長葉片的葉綠素含量逐漸增多，至倒五葉葉綠素含量與野生型植株相近。用APAD-502 Plus葉綠素測定儀測得的芽黃材料中9106和中040029 (野生型)的倒五葉、倒四葉、倒三葉、倒二葉、倒一葉、頂葉的葉綠素含量，結(jié)果如圖I所示，可以看出，芽黃材料中9106的葉綠素含量均低于中040029 (野生型)，頂葉的葉綠素含量較野生型材料低10個(gè)點(diǎn)左右，且至倒五葉期恢復(fù)正常。2、光敏雄性不育表型I)、在河南安陽培育河南處于東經(jīng)110° 2T 116° 39;，北緯31° 23' 36° 22'之間。安陽處于東經(jīng)113° 37'至114° 58'、北緯35° 12'至36° 22'之間。將85粒芽黃標(biāo)記光敏雄性不育系中9106 (種子)于2010年4月種植于河南安陽，萌發(fā)得到85株幼苗，均具有芽黃性狀，繼續(xù)培養(yǎng)幼苗，直至8月份結(jié)束所有植株均沒有花粉粒產(chǎn)生(見圖2)，表現(xiàn)為不育。從棉花的生長周期來看，對(duì)于4月種植的棉花而言，自7月份開始環(huán)境中的溫度變化和光照周期與花粉發(fā)育相關(guān)，所以對(duì)7月份和8月份的溫度和光照周期進(jìn)行記錄。自7月I日至8月31日河南安陽的光照時(shí)間變化區(qū)間為13小時(shí)至14小時(shí)35分。自7月I日至8月31日河南安陽的溫度變化見表I。表I 7月I日至8月31日河南安陽的溫度變化
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系的引物組，由如下10個(gè)引物對(duì)組成 1)由序列表中序列I所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子組成的引物對(duì)； 2)由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子組成的引物對(duì)； 3)由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子組成的引物對(duì)； 4)由序列表中序列7所示的DNA分子和序列表中序列8所示的DNA分子組成的引物對(duì)； 5)由序列表中序列9所示的DNA分子和序列表中序列10所示的DNA分子組成的引物對(duì)； 6)由序列表中序列11所示的DNA分子和序列表中序列12所示的DNA分子組成的引物對(duì)； 7)由序列表中序列13所示的DNA分子和序列表中序列14所示的DNA分子組成的引物對(duì)； 8)由序列表中序列15所示的DNA分子和序列表中序列16所示的DNA分子組成的引物對(duì)； 9)由序列表中序列17所示的DNA分子和序列表中序列18所示的DNA分子組成的引物對(duì)； 10)由序列表中序列19所示的DNA分子和序列表中序列20所示的DNA分子組成的引物對(duì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的引物組，其特征在于所述芽黃標(biāo)記光敏不育系為陸地棉(Gossypium hirsutum) CGMCC No. 5262。
3.一種用于鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系的PCR試劑組，由如下10個(gè)PCR試劑組成 1)由權(quán)利要求I或2所述的引物組中的I)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP、DNA聚合酶組成； 2)由權(quán)利要求I或2所述的引物組中的2)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP、DNA聚合酶組成； 3)由權(quán)利要求I或2所述的引物組中的3)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP、DNA聚合酶組成； 4)由權(quán)利要求I或2所述的引物組中的4)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP、DNA聚合酶組成； 5)由權(quán)利要求I或2所述的引物組中的5)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP、DNA聚合酶組成； 6)由權(quán)利要求I或2所述的引物組中的6)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP、DNA聚合酶組成； 7)由權(quán)利要求I或2所述的引物組中的7)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP、DNA聚合酶組成； 8)由權(quán)利要求I或2所述的引物組中的8)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP、DNA聚合酶組成； 9)由權(quán)利要求I或2所述的引物組中的9)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP、DNA聚合酶組成； 10)由權(quán)利要求I或2所述的引物組中的10)所示的引物對(duì)、PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTP、DNA聚合酶組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的PCR試劑組，其特征在于各個(gè)PCR試劑中的各條引物在各自PCR試劑中的終濃度均為0. 5 ii M ; 所述芽黃標(biāo)記光敏不育系為陸地棉(Gossypium hirsutum) CGMCC No. 5262。
5.一種用于鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系的試劑盒，包括權(quán)利要求I或2所述的引物組或權(quán)利要求3或4所述的PCR試劑組。
6.權(quán)利要求I或2所述的引物組或權(quán)利要求3或4所述的PCR試劑組或權(quán)利要求5所述的試劑盒在鑒定或輔助鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系中的應(yīng)用；所述芽黃標(biāo)記光敏不育系具體為陸地棉(Gossypium hirsutum) CGMCC No. 5262。
7.一種鑒定或輔助鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系的方法，包括分子鑒定的步驟； 所述分子鑒定為用權(quán)利要求I或2所述的引物組或權(quán)利要求3或4所述的PCR試劑組或權(quán)利要求5所述的試劑盒中的10個(gè)弓I物對(duì)分別對(duì)待測樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 若擴(kuò)增產(chǎn)物為如下A-J全部所示，則所述待測樣本為或候選為芽黃標(biāo)記光敏不育系；若擴(kuò)增產(chǎn)物不為如下A-J全部所示，則所述待測樣本不為或候選不為芽黃標(biāo)記光敏不育系; A :1)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有150bp-160bp大小的片段； B 2)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有175bp-185bp大小的片段； C 3)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有155bp-165bp大小的片段； D:4)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有195bp-205bp大小的片段； E:5)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有255bp-265bp大小的片段； F:6)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有165bp-175bp大小的片段； G:7)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有165bp-175bp大小的片段； H:8)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有175bp-185bp大小的片段； 1:9)所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有150bp-160bp大小的片段； J: 10 )所示的引物對(duì)擴(kuò)增得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有165bp-175bp大小的片段和175bp-185bp大小的片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法還包括光敏不育表型鑒定的步驟； 所述光敏不育表型鑒定包括先進(jìn)行如下A和B處理，再進(jìn)行檢測 A為將所述待測樣本在每天光照11小時(shí)-12小時(shí)20分的條件下進(jìn)行培育， B為將所述待測樣本在每天光照13小時(shí)-14小時(shí)40分的條件下進(jìn)行培育， 若檢測結(jié)果為所述待測樣本在經(jīng)A處理后得到雄性可育表型植株，且經(jīng)B處理后得到雄性不育表型植株，則所述待測樣本為或候選為芽黃標(biāo)記光敏不育系；若所述待測樣本在經(jīng)A處理后未得到雄性可育表型植株，且經(jīng)B處理后未得到雄性不育表型植株，則所述待測樣本不為或候選不為芽黃標(biāo)記光敏不育系。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于 所述光敏不育表型鑒定中的A處理中，所述每天光照為11小時(shí)2分-12小時(shí)18分； 所述光敏不育表型鑒定中的B處理中，所述每天光照為13小時(shí)-14小時(shí)35分。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于 所述分子鑒定中的PCR擴(kuò)增的模板均為待測樣本的基因組DNA ； 所述芽黃標(biāo)記光敏不育系為陸地棉(Gossypium hirsutum) CGMCC No. 5262。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定或輔助鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系的方法。本發(fā)明提供了用于鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系的引物組、PCR試劑組和試劑盒，還提供了鑒定或輔助鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系的方法。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明篩選出10個(gè)引物對(duì)，用其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這10個(gè)引物對(duì)特異性高，可以根據(jù)10個(gè)引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物大小來鑒定或輔助鑒定芽黃標(biāo)記光敏不育系，再結(jié)合待測樣本的表型特征，從而實(shí)現(xiàn)芽黃標(biāo)記光敏不育系的鑒定。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102676679SQ20121015823
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月21日
發(fā)明者劉計(jì), 喻樹迅, 宋美珍, 龐朝友, 范術(shù)麗, 馬建輝, 魏恒玲 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所