專利名稱：：利用sampl技術(shù)進行不結(jié)球白菜分子標記的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種農(nóng)作物育種
技術(shù)領(lǐng)域：
的分子標記方法，具體是一種利用SAMPL(選擇性擴增多態(tài)微衛(wèi)星位點)技術(shù)進行不結(jié)球白菜分子標記的方法。技術(shù)背景基于PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)的第二代分子標記，如AFLP(擴增片段長度多態(tài)性)和SSR(簡單序列重復(fù))，都已成為當(dāng)前分子標記輔助選擇的重要技術(shù)手段。分子標記輔助選擇技術(shù)作為現(xiàn)代分子生物學(xué)與傳統(tǒng)遺傳育種的結(jié)合點，借助分子標記可以對育種材料從脫氧核糖核酸水平上進行選擇，加快選擇進度，增強選擇的準確性，從而顯著提高育種效率，所以第二代分子標記技術(shù)己經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于育種工作中。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，SAMPL是MorganteM.在美國專利Compoundmicrosatelliteprimersforthedetectionofgeneticpolymorphisms(專利號US5955276)的基礎(chǔ)上由AFLP技術(shù)發(fā)展而來的，被WitsenboerH.等人首次運用于萵苣的研究，發(fā)表在《Genome》(基因組)1998年第40巻第6期的923頁至936頁，題目為Identification,geneticlocalization,andallelicdiversityofselectivelyamplifiedmicrosatellitepolymorphiclociinlettuceandwildrelatives(Lactucas卯.)(選擇性擴增多態(tài)微衛(wèi)星位點在萵苣和野生品種的鑒定、遺傳定位和等位基因多樣性研究中的應(yīng)用)。SAMPL結(jié)合了AFLP和SSR兩種技術(shù)的優(yōu)點，不需要SSR中的克隆和序列分析，也克服了AFLP顯性條帶過多的不足，被RoyJ.K.等人(2002年)認為是僅次于SNPs(單核苷酸多態(tài)性分型技術(shù))的最有效的分子標記體系，RoyJ.K.等人(2004年)和SinghA.等人(2002年)分別證明了SAMPL技術(shù)比AFLP和SSR技術(shù)都更有效。在植物遺傳多樣性分析、連鎖圖譜構(gòu)建和品種鑒定等方面有非常廣闊的應(yīng)用前景。SAMPL已被應(yīng)用在針葉樹、印度楝、印度人參、萵苣、普通小麥、甘藍等植6物上，但在不結(jié)球白菜上還未有應(yīng)用。由于AFLP技術(shù)包括酶切和連接、預(yù)擴增、選擇性擴增以及電泳等步驟，其體系相對于其他分子標記技術(shù)復(fù)雜，需要在不同的物種上選擇不同的反應(yīng)體系，尤其是引物不具有通用性，需要根據(jù)研究對象的基因序列進行設(shè)計和開發(fā)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用SAMPL技術(shù)進行不結(jié)球白菜分子標記的方法，使其基于SM1PL技術(shù)的通用性原理，根據(jù)不結(jié)球白菜的特點，對SAMPL的復(fù)雜體系進行優(yōu)化和引物設(shè)計，構(gòu)建了適用于不結(jié)球白菜的SAMPL反應(yīng)體系，從而實現(xiàn)不結(jié)球白菜分子標記。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明包括步驟如下①DNA(脫氧核糖核酸)提取；②DNA酶切-連接體系的優(yōu)化；③SAMPL預(yù)擴增體系的優(yōu)化；④S扁PL擴增體系的優(yōu)化、電泳、銀染顯色；⑤聚類分析。所述DNA提取，具體為選取兩葉期不結(jié)球白菜的一片真葉，利用CTAB法提取DNA，提取的DNA稀釋到50-250ng、4。C保存?zhèn)溆?。所述DNA酶切-連接體系的優(yōu)化，具體為對DNA樣品使用EcoRI、Msel或Pstl酶中的一種進行酶切，并用T4-DNA連接酶把相對應(yīng)的EcoRI、Msel或Pstl的接頭連接上去。采用26叱(微升)反應(yīng)體系，分成兩步①13.5叱酶切反應(yīng)體系包括2-5U(單位)的酶和50-250ng(納克)的DNA，在37。C水浴3-8小時；②連接反應(yīng)體系包括13.5化酶切液、l-4pmo1(皮摩)的EcoRI接頭或Pstl接頭或者10-40pmol的Msel接頭、0.2-1U的T4-DNA連接酶、2-8Mmo1(微摩)的ATP，在室溫下(20。C左右)過夜。產(chǎn)物稀釋一倍，-2(TC保存?zhèn)溆?。所述SAMPL預(yù)擴增體系的優(yōu)化，具體為采用IOPL反應(yīng)體系進行SAMPL預(yù)擴增1-5腿o1.1/1(毫摩爾每升)MgCl2(氯化鎂)，0.1-0.5畫1L、NTPs(脫氧核糖核苷三磷酸)，10-80ng的預(yù)擴引物，0.1-1UTaq聚合酶，0.2_2A酶切連接產(chǎn)物。預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋20倍，-20。C保存?zhèn)溆?。PCR擴增程序采用94。C預(yù)變性2分鐘；94'C變性30秒，56。C復(fù)性30秒，72。C延伸60秒，共24個循環(huán)；最后72。C延伸30分鐘。預(yù)擴引物為一個，是與酶切中所選擇的酶所對應(yīng)的引物，其序列為EOO5'-GACTGCGTACCAATTC-3'MOO5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'POO5'-GACTGCGTACATGCAG-3'。所述SAMPL擴增體系的優(yōu)化，具體為采用20叱反應(yīng)體系進行SAMPL擴增1-5rnmo1I/1MgCl"0.1-0.5,1L-1dNTPs，30-150ng的引物，0.2-2UTaq聚合酶，2-6叱預(yù)擴增產(chǎn)物。PCR擴增程序采用94。C預(yù)變性2分鐘；94。C變性30秒，65-56。C復(fù)性30秒(每個循環(huán)降低0.7°C)，72。C延伸60秒，共12個循環(huán)；94。C變性30秒，56。C復(fù)性30秒，72'C延伸60秒，共24個循環(huán)；最后72i:延伸30分鐘。選擇擴增引物有兩個，一個是與預(yù)擴增引物相對應(yīng)的引物，在EOO、MOO或POO序列后增加1-3個堿基，另一個引物為SAMPL引物。本發(fā)明根據(jù)SAMPL技術(shù)特點和不結(jié)球白菜的基因序列，通過在www.ukcrop.net網(wǎng)上查詢蕓苔屬的微衛(wèi)星引物序列，設(shè)計相應(yīng)的引物，進行篩選，選擇多態(tài)性好的引物組合，凡是適用于不結(jié)球白菜的SSR引物都能用于本發(fā)明。所述電泳，具體為PCR擴增產(chǎn)物與上樣緩沖液1:0.5體積混合，95。C變性4.5分鐘，變性后通過6%的變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進行分離。所述銀染顯色，具體為①固定；②水洗；③銀染；事先配制2L1.5%氫氧化鈉和0.5%甲醛的顯影液，搖勻待用；(D再水洗；⑥顯影水洗后迅速將膠板放入顯影液中顯影，直至出現(xiàn)清晰的條帶；⑦定影、清水沖洗。所述聚類分析，具體為在電泳圖譜上同一SAMPL位點上有電泳帶記錄為1，無電泳帶記錄為0，作0，1矩陣圖輸入計算機。采用DPS或NTSYS-PC數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，根據(jù)UPGMA(非加權(quán)配對算術(shù)平均法)構(gòu)建聚類樹狀圖，或則采用MapMaker軟件構(gòu)建遺傳圖譜或特定基因定位圖譜。本發(fā)明以不結(jié)球白菜為材料，對SAMPL技術(shù)的部分環(huán)節(jié)進行了優(yōu)化，使其能適用于不結(jié)球白菜的DNA水平分子研究。在優(yōu)化過程中，不僅對反應(yīng)體系中的各主要因素的量進行了篩選，更重要的是設(shè)計和驗證了SAMPL選擇擴增引物，從而使本發(fā)明能夠適用于不結(jié)球白菜親緣關(guān)系分析、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源檢測、品種指紋鑒定、抗性基因篩選和定位等等分子水平上的分析研究，為不結(jié)球白菜的育種研究及生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。圖1為本發(fā)明實施例20份不結(jié)球白菜材料親緣關(guān)系的聚類分析2為本發(fā)明實施例8份抗病性不同的不結(jié)球白菜的遺傳距離分析3為本發(fā)明實施例5份不結(jié)球白菜材料親緣關(guān)系的精細聚類分析圖具體實施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1材料的培養(yǎng)以來自國家重點實驗室種質(zhì)資源上海分室的20份不結(jié)球白菜為試驗材料(表1)，挑選飽滿的種子，播到由草炭、蛭石及有機肥(體積比4:4:1)混合的基質(zhì)中，繞透水后打0.5厘米深的孔，將種子播到孔中，然后覆0.5厘米厚的草炭。用黑色膜封嚴后置于3(TC左右的苗床上3-4天，待發(fā)芽出土后，轉(zhuǎn)到日溫25°C，夜溫18。C的人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)2周，在兩葉期剪取真葉用于DNA提取。DNA的提取采用CTAB方法提取DNA，具體操作步驟如下1、葉片清洗選取幼葉3-5片，2g(克)左右，純凈水洗干凈；2、葉片研磨冷凍，加入液氮，研磨，轉(zhuǎn)入1.5或2ml(毫升)離心管；3、預(yù)先配備CTAB提取液稱取CTAB20g和氯化鈉81.9g溶解于100ml蒸餾水中，加入O.5mol乂摩爾每升)的EDTA40ml和lmol4/1的Tris-HCl100ml，最后用蒸餾水定容至1000ml，4。C保存?zhèn)溆?。使用前按體積100比1加入巰基乙醇；4、CTAB液提取加入60。C預(yù)熱的CTAB提取液500^，60。C水浴30-60分鐘，每10分鐘混勻一次；5、去蛋白力卩-2(TC冰浴的酚氯仿異戊醇(體積比25:24:1)500叱混勻，4。C條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；6、沉淀力口-2(TC冰浴的異丙醇500ul，混勻沉淀30分鐘以上，4'C條件9下8000轉(zhuǎn)離心IO分鐘，去上清液，晾干；7、預(yù)先配制RNA酶液吸取0.5molL—1的EDTA0.2ml和lmol1的Tris-HCllml，用蒸餾水定容至100ml，制備TE緩沖液，再按體積比為993比7加入10g4/1的RNA酶；8、去RNA(核糖核酸)加RNA酶液300叱，37。C消化30分鐘；9、二次去蛋白力卩-2(TC冰浴的氯仿異戊醇(體積比24:1)300PL混勻，4。C條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；10、去離子力卩-20。C冰浴的7.5mo1*L—'醋酸銨100叱混勻，(TC冰浴20分鐘，4'C條件下10000轉(zhuǎn)離心20分鐘，取上清液；11、DNA沉淀力n-20。C冰浴的無水乙醇90(^L，(TC冰浴20分鐘，4。C條件下8000轉(zhuǎn)離心20分鐘，去上清液，獲得DNA沉淀；12、DNA洗滌對DNA沉淀用-20'C冰浴的70%乙醇洗兩遍，晾干；13、溶解加TE溶解和稀釋，DNA濃度稀釋至50-250ng叱—、放4T:冰箱保存。DNA的酶切-連接采用26叱反應(yīng)體系，分成兩步，13.酶切反應(yīng)體系包括0.24U的EcoRI酶、1.35叱緩沖液和100ng的DNA，在37。C水浴6小時；連接反應(yīng)體系包括13.5PL酶切液、2.5pmo1的EcoRI接頭、0.5U的T4-DNA連接酶、2Wno1的ATP和2.6叱的緩沖液，在室溫下(20'C左右)過夜。產(chǎn)物稀釋1倍，-20。C保存。SAMPL預(yù)擴增采用10叱反應(yīng)體系進行AFLP預(yù)擴增2.5mmolL—1MgCl2，0.2腿o1'L—!dNTPs，60ng的預(yù)擴引物，0.3UTaq聚合酶，l叱lOXPCRBuffer(緩沖液)，2.0化酶切連接產(chǎn)物。預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋20倍，-2(rc保存。預(yù)擴引物為一個，序列是EOO5'-GACTGCGTACCAATTC-3'PCR擴增程序采用94。C預(yù)變性2分鐘；94。C變性30秒，56。C復(fù)性30秒，72。C延伸60秒，共24個循環(huán)；最后72。C延伸30分鐘。SAMPL擴增采用20PL反應(yīng)體系，2.5,1L-1MgCl"0.2,1L—MNTPs，100ng引物，1.5UTaq聚合酶，2叱lOXPCRBuffer(緩沖液)，預(yù)擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物與上樣緩沖液(甲酰胺98ml、0.5M的乙二胺四乙酸2ml、溴酚藍0.25g、二甲苯腈0.25g)l:0.5體積混合變性，-4°。保存待電泳。引物為三個組合，E1S1、E2S1和E3S2，它們分別序列是El5'-GACTGCGTACCAATTCAAG-3'SI5'-GTGTTAGGGAGCTGGAGAAT-3'E25'-GACTGCGTACCAATTCACT-3'515'-GTGTTAGGGAGCTGGAGAAT-3'E35'-GACTGCGTACCAATTCAGG-3'525'-GATCAAATAACGAACGGAGAGA-3'PCR擴增程序采用94i:預(yù)變性2分鐘；94'C變性30秒，65-56。C復(fù)性30秒(每個循環(huán)降低0.7。C)，72。C延伸60秒，共12個循環(huán)；94。C變性30秒，56°C復(fù)性30秒，72。C延伸60秒，共24個循環(huán)；最后72。C延伸30分鐘。電泳通過6%的變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進行分離，擴增產(chǎn)物吸取5化點樣后，在50W的恒功率下電泳。銀染顯色①固定將帶膠的玻璃板放入盛有2L新配制的0.5%的冰醋酸和10%無水乙醇混合液的固定盒中，在搖床上輕搖20分鐘，直至膠面上二甲苯腈顏色全部褪掉。②水洗放到盛有蒸餾水的水洗盒中，輕搖3分鐘。③銀染放入盛有2L0.2%的硝酸銀染色液的染色盒中，輕搖30分鐘。④再水洗從染色盒中取出膠板，放到水洗盒中清洗5-10秒。⑤顯影迅速將膠板放入2L1.5%氫氧化鈉和0.5%甲醛的顯影液中顯影，直至出現(xiàn)清晰的條帶。⑥定影2L0.75%無水碳酸鈉定影液定影。⑦取出膠板，清水沖洗，銀染結(jié)束。聚類分析統(tǒng)計電泳條帶，以0和1記錄，有帶記為1，無帶記為0。采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，根據(jù)UPGMA構(gòu)建聚類樹狀圖用統(tǒng)計軟件處理(圖l)。表l供試20份不結(jié)球白菜品系<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>菜屬)CHANGCAI字花科)var.co瞧unis(白菜)2白葉油塌菜V02B0519Brassica(云量屬)BAIYEYOUTACAICrucifer36(十字花科)Brassicacampestrisssp.chinensisvar.communis(白菜)3605青菜V02B0520Brassica(蕓薹屬)605QINGCAICrucife字花科)BrassicacampestrisLssp.chinensisvar.communis(白菜)4黃烏菘V02B0521Brassica(蕓薹屬)HUANGWUSONGCrucifera_6(十字花科)BmssicacampestrisLssp.chinensisvar.communis(白菜)5黑葉白菜V02B0522Brassica(蕓薹屬)服IYEBAICAICrucife(十字花科)Brassicacampestrisssp.chinensisvax.communis(白菜)6寒江陰V02B0523Brassica(蕓薹屬)麗I緒GYINCrucifera6計字花科)BrassicacampestrisLssp.chinensisvar.communis(白菜)7青邊黃心烏菘菜V02B0524Brassica(蕓薹屬)QINGBIANHUANGXINWUSONGCAICrucife(十字花科)BrassicacampestrisLssp.chinensisvar.communis(白菜)8春江陰V02B0525Brassica(蕓薹屬)CHUNJIANGYINCrucifer犯(十字花科)BrassicacampestrisL.ssp.chinensisvar.communis(白菜)9矮箕青菜V02B0526Brassica(蕓薹屬)AI了IQINGCAICrucife計字花科)BrassicacampestrisLssp.chinensisvax.communis(白菜)10黑葉油塌菜V02B0527Brassica(蕓薹屬)HEIYEYOUTACAICrucifer86(十字花科)BrassicacampestrisL.ssp.chinensisvar.communis(白菜)11《5條V02B0528Brassica(蕓薹屬)Z應(yīng)GBAYETACAICrucifeT￡L6(十字花科)BrassicacampestrisLssp，chinensisvar.communis(白菜)12矮抗青E78-04V02B0529Brassica(蕓薹屬)AIKANGQINGE78-04Crucifer服(十字花科)BrassicacampestrisLssp.chinensisvar.communis(白菜)13J78-09(冬常青)V02B0530Brassica(蕓薹屬)J78-09(DONGCH認GQING)Crucifer犯(十字花科)Brassicacampestrisssp.chinensisvar.communis(白菜)14黑葉二月慢V02B0532Brassica(蕓薹屬)HEIYEERYUE廳Crucifera6計字花科)BrassicacampestrisLssp.chinensisvar.communis(白菜)15白葉V02B053BrassicBAIYECrucifeBrassicacampestris12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結(jié)果:供試的20份不結(jié)球白菜通過E1+S1、E2+S1、E3+S2三組選擇性擴增引物組合擴增，共有120條帶，其中99條多態(tài)性帶用于作圖，結(jié)果如圖l。由圖l和表1可知遺傳距離最近的是13和16，差異為0.3，相似性為70%;遺傳距離最遠的是17與其他19個樣品，差異為0.67，相似性為33%。根據(jù)遺傳相似性可以知道在親緣關(guān)系中，13和16差異最小，相似性最高；9和15、19和20、8和12、3和5差異較小，相似性較高；17與其他樣品差異最大，相似性最低；其次是2和4。根據(jù)聚類情況可以知道l、3、5、18、19、20為一類與11、13、14、16的一類聚為一個大類，再與9、10、15聚為更大的類，6、7、8、12這一類與以上大類相差0.6和有40%的相似性，這些可以非常清晰和直觀地說明各樣品之間的親緣關(guān)系遠近，為樣品作為試驗材料的選擇提供依據(jù)。實施例2材料的培養(yǎng)以來自國家重點實驗室種質(zhì)資源上海分室的8份抗病強弱不同的不結(jié)球白菜為試驗材料(表2)，挑選飽滿的種子，播到由草炭、蛭石及有機肥(體積比4:4:1)混合的基質(zhì)中，澆透水后打0.5cm深的孔，將種子播到孔中，然后覆0.5cm厚的草炭。用黑色膜封嚴后置于3(TC左右的苗床上3-4天，種子發(fā)芽出土后，轉(zhuǎn)到日溫25'C，夜溫18'C的人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)2周，在兩葉期剪取真葉用于DNA提取。DNA的提取采用CTAB方法提取DNA，具體操作步驟如下1、葉片清洗選取幼葉3-5片，2g左右，純凈水洗干凈；2、葉片研磨冷凍，加入液氮，研磨，轉(zhuǎn)入1.5或2ml離心管；3、CTAB液提取加入60。C預(yù)熱的CTAB提取液500吣，60。C水浴30-60分鐘，每10分鐘混勻一次；4、去蛋白力口-2(TC冰浴的酚氯仿異戊醇(體積比25:24:1)500化混勻，4。C條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；5、沉淀力n-2(TC冰浴的異丙醇500ul，混勻沉淀30分鐘以上，4。C條件下8000轉(zhuǎn)離心IO分鐘，去上清液，晾干；6、去RNA:加RNA酶液300叱，37。C消化30分鐘；7、二次去蛋白力口-20。C冰浴的氯仿異戊醇(體積比24:1)300PL混勻，4。C條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；8、去離子力B-20。C冰浴的7.5mo1L—'醋酸銨IOO叱混勻，O'C冰浴20分鐘，4"C條件下10000轉(zhuǎn)離心20分鐘，取上清液；9、DNA沉淀力卩-20。C冰浴的無水乙醇900叱，(TC冰浴20分鐘，4。C條件下8000轉(zhuǎn)離心20分鐘，去上清液，獲得DNA沉淀；10、DNA洗滌對DNA沉淀用-20。C冰浴的70%乙醇洗兩遍，晾干；11、溶解加TE溶解和稀釋，DNA濃度稀釋至50-250ng'化—'，放4"C冰箱保存。DNA的酶切-連接采用26化反應(yīng)體系，分成兩步，13.5叱酶切反應(yīng)體系包括0.24U的EcoRI酶、1.35叱緩沖液和100ng的DNA，在37。C水浴6小時；連接反應(yīng)體系包括13.5叱酶切液、2.5pmo1的EcoRI接頭、0.5U的T4-DNA連接酶、2Mmo1的ATP和2.6叱的緩沖液，在室溫下(20。C左右)過夜。產(chǎn)物稀釋1倍，-20'C保存。SAMPL預(yù)擴增采用反應(yīng)體系進行AFLP預(yù)擴增2.5mmolL—1MgCl"0.2mmo1!/MNTPs，60ng的預(yù)擴引物，0.3UTaq聚合酶，lPLlOxPCRBuffer(緩沖液)，2.0化酶切連接產(chǎn)物。預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋20倍，-20"保存。預(yù)擴引物為一個，序列是EOO5'-GACTGCGTACCAATTC-3'PCR擴增程序采用94。C預(yù)變性2分鐘；94。C變性30秒，56。C復(fù)性30秒，72。C延伸60秒，共24個循環(huán)；最后72。C延伸30分鐘。SAMPL擴增采用反應(yīng)體系，2.5畫1L_1MgCl2,0.2翻1L—MNTPs，100ng引物，1.5UTaq聚合酶，2叱lOXPC歸fer(緩沖液)，6rt預(yù)擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物與上樣緩沖液(甲酰胺98ml、0.5M的乙二胺四乙酸2ml、溴酚藍0.25g、二甲苯腈0.25g)l:0.5體積混合變性，_4°。保存待電泳。引物為三個組合，E1S1、E2S1和E3S2，它們分別序列是E15'-GACTGCGTACCAATTCAAG-3'S15'-GTGTTAGGGAGCTGGAGAAT-3'E25'-GACTGCGTACCAATTCACT-3'515'-GTGTTAGGGAGCTGGAGAAT-3'E35'-GACTGCGTACCAATTCAGG-3'525'-GATCAAATAACGAACGGAGAGA-3'PCR擴增程序采用94。C預(yù)變性2分鐘；94。C變性30秒，65-56。C復(fù)性30秒(每個循環(huán)降低0.7。C)，72。C延伸60秒，共12個循環(huán)；94。C變性30秒，56°C復(fù)性30秒，72'C延伸60秒，共24個循環(huán)；最后72'C延伸30分鐘。電泳通過6%的變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進行分離，擴增產(chǎn)物吸取5化點樣后，在50W的恒功率下電泳。銀染顯色①固定將帶膠的玻璃板放入盛有2L新配制的0.5%的冰醋酸和10%無水乙醇混合液的固定盒中，在搖床上輕搖20分鐘，直至膠面上二甲苯腈顏色全部褪掉。②水洗放到盛有蒸餾水的水洗盒中，輕搖3分鐘。③銀染放入盛有2L0.2%的硝酸銀染色液的染色盒中，輕搖30分鐘。④再水洗從染色盒中取出膠板，放到水洗盒中清洗5-10秒。⑤顯影迅速將膠板放入2L1.5%氫氧化鈉和0.5%甲醛的顯影液中顯影，直至出現(xiàn)清晰的條帶。⑥定影2L0.75%無水碳酸鈉定影液定影。⑦取出膠板，清水沖洗，銀染結(jié)束。聚類分析統(tǒng)計電泳條帶，以0和1記錄，有帶記為l，無帶記為O。采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，根據(jù)UPG區(qū)構(gòu)建聚類樹狀圖用統(tǒng)計軟件處理(圖2)。表2供試8份抗病性不同的不結(jié)球白菜品系<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>結(jié)果供試的8份不結(jié)球白菜通過E1+S1、E2+Sl、E3+S2三組選擇性擴增引物組合擴增，共有120條帶，其中84條多態(tài)性帶用于作圖，結(jié)果如圖2。由圖2和表2可知，抗病性強的3、6分別與抗病性弱的4、7遺傳距離近，相似性高；而3與7、4與6的遺傳距離遠，相似性低；抗病毒病強的12和13與抗病毒病弱的ll遺傳相似性高，而與10遺傳相似性低，抗病強的3和6與抗病弱的11遺傳相似性低。由分析可知，多樣性分析圖譜可以用于抗感病雜交親本的分子輔助篩選。實施例3材料的培養(yǎng)以來自國家重點實驗室種質(zhì)資源上海分室的5份不結(jié)球白菜為試驗材料(表3)，挑選飽滿的種子，播到由草炭、蛭石及有機肥(體積比4:4:1)混合的基質(zhì)中，澆透水后打0.5cm深的孔，將種子播到孔中，然后覆0.5cm厚的草炭。用黑色膜封嚴后置于3(TC左右的苗床上3-4天，種子發(fā)芽出土后，轉(zhuǎn)到日溫25'C，夜溫18'C的人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)2周，在兩葉期剪取真葉用于DNA提取。DNA的提取采用CTAB方法提取DNA，具體操作步驟如下1、葉片清洗選取幼葉3-5片，2g左右，純凈水洗干凈；2、葉片研磨冷凍，加入液氮，研磨，轉(zhuǎn)入L5或2ml離心管；3、CTAB液提取加入60。C預(yù)熱的CTAB提取液50(￥L，60。C水浴30-60分鐘，每10分鐘混勻一次；4、去蛋白力口-2(TC冰浴的酚:氯仿:異戊醇(體積比25:24:1)500叱混勻，4。C條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；5、沉淀力n-2(TC冰浴的異丙醇500ul，混勻沉淀30分鐘以上，4。C條件下8000轉(zhuǎn)離心IO分鐘，去上清液，晾干；6、去RNA:加RNA酶液300叱，37。C消化30分鐘；7、二次去蛋白力口-2(TC冰浴的氯仿:異戊醇(體積比24:1)300叱混勻，4。C條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；8、去離子力卩-20。C冰浴的7.5mo1L—'醋酸銨IOO叱混勻，(TC冰浴20分鐘，4'C條件下10000轉(zhuǎn)離心20分鐘，取上清液；9、DNA沉淀力Q-2(TC冰浴的無水乙醇900叱，(TC冰浴20分鐘，4'C條件下8000轉(zhuǎn)離心20分鐘，去上清液，獲得DNA沉淀；10、DNA洗滌對DNA沉淀用-20'C冰浴的70。/。乙醇洗兩遍，晾干；11、溶解加TE溶解和稀釋，DNA濃度稀釋至50-250ng叱—、放4。C冰箱保存。DNA的酶切-連接采用26化反應(yīng)體系，分成兩步，13.酶切反應(yīng)體系包括0.24U的EcoRI酶、1.35禮緩沖液和100ng的DNA，在37。C水浴6小時；連接反應(yīng)體系包括13.5叱酶切液、2.5pmo1的EcoRI接頭、0.5U的T4-DNA連接酶、2Mmo1的ATP和2.6叱的緩沖液，在室溫下(2(TC左右)過夜。產(chǎn)物稀釋1倍，-2(TC保存。SAMPL預(yù)擴增采用10叱反應(yīng)體系進行AFLP預(yù)擴增2.5mmolL—1MgCl2，0.2畫1'L—'dNTPs，60ng的預(yù)擴引物，0.3UTaq聚合酶，肌10xPCRBuffer(緩沖液)，2.0叱酶切連接產(chǎn)物。預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋20倍，-20。C保存。預(yù)擴引物為一個，序列是E005'-GACTGCGTACCAATTC-3'PCR擴增程序采用94。C預(yù)變性2分鐘；94。C變性30秒，56。C復(fù)性30秒，72'C延伸60秒，共24個循環(huán)；最后72'C延伸30分鐘。SAMPL擴增采用20PL反應(yīng)體系，2.5,1L-1MgCl"0.2,1L—MNTPs，100ng引物，1.5UTaq聚合酶，2叱lOxPCRBuffer(緩沖液)，預(yù)擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物與上樣緩沖液(甲酰胺98ml、0.5M的乙二胺四乙酸2ml、溴酚藍0.25g、二甲苯腈0.25g)l:0.5體積混合變性，-4°。保存待電泳。引物為六個組合，包括實例1中E1S1、E2S1和E3S2三個及P1S1、M1S3和E4S4，它們分別序列是El5'-GACTGCGTACCMTTCAAG-3'Sl5'-GTGTTAGGGAGCTGGAGAAT-3'E25'-GACTGCGTACCAATTCACT-3'Sl5'-GTGTTAGGGAGCTGGAGAAT-3'E35'-GACTGCGTACCAATTCAGG-3'S25'-GATCAAATAACGAACGGAGAGA-3'Pl5'-GACTGCGTACATGCAGTA-3'Sl5'-GTGTTAGGGAGCTGGAGAAT-3'Ml5'-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3'S35'-ACACACACACACACATATAA-3'E45'-GACTGCGTACCAATTCAAC-3'S45'-TCGTTGGTCGGTCACTCCTT-3'PCR擴增程序采用94。C預(yù)變性2分鐘；94。C變性30秒，65-56。C復(fù)性30秒(每個循環(huán)降低O.7°C)，72。C延伸60秒，共12個循環(huán)；94。C變性30秒，56°C18復(fù)性30秒，72。C延伸60秒，共24個循環(huán)；最后72。C延伸30分鐘。電泳通過6%的變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進行分離，擴增產(chǎn)物吸取5A點樣后，在50W的恒功率下電泳。銀染顯色①固定將帶膠的玻璃板放入盛有2L新配制的0.5%的冰醋酸和10%無水乙醇混合液的固定盒中，在搖床上輕搖20分鐘，直至膠面上二甲苯腈顏色全部褪掉。②水洗放到盛有蒸餾水的水洗盒中，輕搖3分鐘。③銀染放入盛有2L0.2%的硝酸銀染色液的染色盒中，輕搖30分鐘。④再水洗從染色盒中取出膠板，放到水洗盒中清洗5-10秒。⑤顯影迅速將膠板放入2L1.5%氫氧化鈉和0.5%甲醛的顯影液中顯影，直至出現(xiàn)清晰的條帶。⑥定影2L0.75%無水碳酸鈉定影液定影。⑦取出膠板，清水沖洗，銀染結(jié)束。聚類分析統(tǒng)計電泳條帶，以0和1記錄，有帶記為l，無帶記為O。采用NTSYS-PC數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，根據(jù)UPG區(qū)構(gòu)建聚類樹狀圖用統(tǒng)計軟件處理(圖3)。表3供試5份不結(jié)球白菜品系<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>供試的5份不結(jié)球白菜通過E1+S1、E2+S1、E3+S2、P1+S1、Ml+S3、E4+S4六組選擇性擴增引物組合擴增，其中E1+S1、E2+S1、E3+S2共擴增出97條帶，多態(tài)性帶有72條；P1+S1擴增出102條帶，多態(tài)性帶有101條；Ml+S3擴增出109條帶，多態(tài)性帶有104條；E4+S4擴增出59條帶，多態(tài)性帶有46條。共有367條帶，其中323條多態(tài)性帶用于作圖，結(jié)果如圖3。由圖3和圖1可知1與13在圖1中的遺傳距離差異為0.48，相似性為52%，而在圖3中為0.35，相似性為65%，相似性提高13°/。，精細了27%;15與1和13的遺傳距離差異在圖1中為0.53，相似性為47%，在圖3中為0.4，相似性為60%，相似性提高13%，精細了24.5%;2與15、1、13大類的遺傳距離差異在圖1中為0.66，在圖3中為0.51，相似性提高15%，精細了22.7%;在圖3中的10與1、2、13、15的遺傳距離與圖1中有明顯的不同，是用P1+S1和Ml+S3組合擴增出的條帶較少引起的。實例3進一步證實了EcoRI酶和引物、Msel酶和引物和Pstl酶和引物都適用于SAMPL擴增，也同時證明DPS和NTSYS-PC數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，都能用來處理數(shù)據(jù)以構(gòu)建聚類樹狀圖。權(quán)利要求id="icf0001"file="S2008100368427C00011.gif"wi="3"he="4"top="44"left="33"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>一種利用SAMPL技術(shù)進行不結(jié)球白菜分子標記的方法，其特征在于，包括步驟如下①DNA提取，②DNA酶切-連接體系的優(yōu)化，③SAMPL預(yù)擴增體系的優(yōu)化，④SAMPL擴增體系的優(yōu)化、電泳、銀染顯色，⑤聚類分析；其中所述DNA酶切-連接體系的優(yōu)化，具體為對DNA樣品使用EcoRI、MseI或PstI酶中的一種進行酶切，并用T4-DNA連接酶把相對應(yīng)的EcoRI、MseI或PstI的接頭連接上去，采用26μL反應(yīng)體系，分成兩步第一，13.5μL酶切反應(yīng)體系包括2-5U的酶和50-250ng的DNA，在37℃水浴3-8小時；第二，連接反應(yīng)體系包括13.5μL酶切液、1-4pmol的EcoRI接頭或PstI接頭或者10-40pmol的MseI接頭、0.2-1U的T4-DNA連接酶、2-8μmol的ATP，在室溫下過夜，產(chǎn)物稀釋一倍，-20℃保存?zhèn)溆茫凰鯯AMPL預(yù)擴增體系的優(yōu)化，具體為采用10μL反應(yīng)體系進行SAMPL預(yù)擴增，其中1-5mmol·L-1MgCl2，0.1-0.5mmol·L-1dNTPs，10-80ng的預(yù)擴引物，0.1-1UTaq聚合酶，0.2-2μL酶切連接產(chǎn)物；預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋20倍，-20℃保存?zhèn)溆?；PCR擴增程序采用94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性30秒，56℃復(fù)性30秒，72℃延伸60秒，共24個循環(huán)，最后72℃延伸30分鐘；預(yù)擴引物為一個，是與酶切中所選擇的酶所對應(yīng)的引物，其序列為E005′-GACTGCGTACCAATTC-3′M005′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′P005′-GACTGCGTACATGCAG-3′；所述SAMPL擴增體系的優(yōu)化，具體為采用20μL反應(yīng)體系進行SAMPL擴增1-5mmol·L-1MgCl2，0.1-0.5mmol·L-1dNTPs，30-150ng的引物，0.2-2UTaq聚合酶，2-6μL預(yù)擴增產(chǎn)物；PCR擴增程序采用94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性30秒，65-56℃復(fù)性30秒，每個循環(huán)降低0.7℃，72℃延伸60秒，共12個循環(huán)；94℃變性30秒，56℃復(fù)性30秒，72℃延伸60秒，共24個循環(huán)，最后72℃延伸30分鐘；選擇擴增引物有兩個，一個是與預(yù)擴增引物相對應(yīng)的引物，在E00、M00或P00序列后增加1-3個堿基，另一個引物為SAMPL引物。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用SAMPL技術(shù)進行不結(jié)球白菜分子標記的方法，其特征是，所述DNA提取，具體為選取兩葉期不結(jié)球白菜的一片真葉，利用CTAB法提取DNA，提取的DNA稀釋到50-250ng、4。C保存?zhèn)溆谩?、根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用SAMPL技術(shù)進行不結(jié)球白菜分子標記的方法，其特征是，所述利用溴代十六垸基三甲胺法提取DNA，具體為①葉片清洗選取幼葉3-5片，2g左右，純凈水洗干凈；②葉片研磨冷凍，加入液氮，研磨，轉(zhuǎn)入1.5或2ml離心管；③CTAB液提取加入60。C預(yù)熱的CTAB提取液5(K^L，6(TC水浴30-60分鐘，每10分鐘混勻一次；其中CTAB提取液，其配備為稱取CTAB20g和氯化鈉81.9g溶解于100ml蒸餾水中，加入0.5mol'L—1的EDTA40ml和lmol'L—1的Tris-HCl100ml，最后用蒸餾水定容至1000ml，使用前按體積100比1加入巰基乙醇；④去蛋白力口-2(TC冰浴的酚、氯仿和異戊醇混合液500化混勻，4r條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；其中酚、氯仿和異戊醇混合液，其配備為先吸取體積比為24份的氯仿和1份的異戊醇，制成氯仿異戊醇混合液，再與25份的酚混合待用；⑤沉淀力B-20。C冰浴的異丙醇500y1，混勻沉淀30分鐘以上，4。C條件下8000轉(zhuǎn)離心10分鐘，去上清液，晾干；⑥去RNA:加RNA酶300叱，37。C消化30分鐘；其中RNA酶的制備為先配制TE緩沖液，吸取0.5mo1「1的EDTA0.2ml和lmolL-1的Tris-HC1lml，用蒸餾水定容至100ml，再按體積比為993比7加入10gL—1的RNA酶；⑦二次去蛋白力口-2(TC冰浴的氯仿異戊醇混合液300A混勻，4t:條件下12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液；⑧去離子力B-20。C冰浴的7.5mol*L—i醋酸銨100pL混勻，(TC冰浴20分鐘，4。C條件下10000轉(zhuǎn)離心20分鐘，取上清液；⑨DNA沉淀力n-20。C冰浴的無水乙醇900叱，(TC冰浴20分鐘，4。C條件下8000轉(zhuǎn)離心20分鐘，去上清液，獲得DNA沉淀；⑩DNA洗滌對DNA沉淀用-2(TC冰浴的70%乙醇洗兩遍，晾干；溶解加TE溶解和稀釋，DNA濃度稀釋至50-250ng化—1，放4'C冰箱保存。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用SAMPL技術(shù)進行不結(jié)球白菜分子標記的方法，其特征是，所述DNA酶切-連接體系的優(yōu)化，具體為13.5化酶切反應(yīng)體系包括2.4U的酶、1.35叱緩沖液和100ng的DNA，在37。C水浴6小時；連接反應(yīng)體系包括13.5叱酶切液、2.5pmol的EcoRI接頭或Pstl接頭或者25pmol的Msel接頭、0.5U的T4-DNA連接酶、2陶ol的ATP和2.6叱緩沖液。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用SAMPL技術(shù)進行不結(jié)球白菜分子標記的方法，其特征是，所述SAMPL預(yù)擴增體系的優(yōu)化，具體為10化反應(yīng)體系包括2.5,1'L—1MgCl"0.2腸1'l/'d酵s，60ng的預(yù)擴引物，0.3UTaq聚合酶，2.0叱酶切連接產(chǎn)物。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用S扁PL技術(shù)進行不結(jié)球白菜分子標記的方法，其特征是，所述SAMPL擴增體系的優(yōu)化，具體為20叱反應(yīng)體系包括2.5mmo1'L—1MgCl"0.2鵬o1L-1dNTPs，100ng引物，1.5UTaq聚合酶，6^1預(yù)擴增產(chǎn)物。7、根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的利用SAMPL技術(shù)進行不結(jié)球白菜分子標記的方法，其特征是，所述SAMPL擴增體系的優(yōu)化，其中擴增引物包括AFLP的E系列、P系列或M系列選擇擴增引物與SAMPL或SSR的擴增引物組成的組合。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用SAMPL技術(shù)進行不結(jié)球白菜分子標記的方法，其特征是，所述電泳，具體為PCR擴增產(chǎn)物與上樣緩沖液1:0.5體積混合，95'C變性4.5分鐘，變性后通過6%的變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進行分離。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用SAMPL技術(shù)進行不結(jié)球白菜分子標記的方法，其特征是，所述銀染顯色，具體為①固定將帶膠的玻璃板放入盛有2L新配制的0.5%的冰醋酸和10%無水乙醇混合液的固定盒中，在搖床上輕搖20分鐘，直至膠面上二甲苯腈顏色全部褪掉；②水洗放到盛有蒸餾水的水洗盒中，輕搖3分鐘；③銀染放入盛有2L0.2%的硝酸銀染色液的染色盒中，輕搖30分鐘；再水洗從染色盒中取出膠板，放到水洗盒中清洗5-IO秒；⑤顯影迅速將膠板放入2L1.5%氫氧化鈉和0.5%甲醛的顯影液中顯影，直至出現(xiàn)清晰的條帶；⑥定影2L0.75%無水碳酸鈉定影液定影；⑦取出膠板，清水沖洗，銀染結(jié)束。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用SAMPL技術(shù)進行不結(jié)球白菜分子標記的方法，其特征是，所述聚類分析，具體為在電泳圖譜上同一SAMPL位點上有電泳帶記錄為1，無電泳帶記錄為0，作0，1矩陣圖輸入計算機，采用DPS或NTSYS-PC數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，根據(jù)UPGMA構(gòu)建聚類樹狀圖，或則采用MapMaker軟件構(gòu)建遺傳圖譜或特定基因定位圖譜。全文摘要一種利用SAMPL技術(shù)進行不結(jié)球白菜分子標記的方法，包括DNA提取、DNA酶切-連接體系的優(yōu)化、SAMPL預(yù)擴增體系的優(yōu)化、SAMPL擴增體系的優(yōu)化、電泳、銀染顯色和聚類分析，其中對DNA樣品使用EcoRI、MseI或PstI酶中進行酶切，并用T4-DNA連接酶把相對應(yīng)的EcoRI、MseI或PstI的接頭連接上去；采用10μL反應(yīng)體系進行SAMPL預(yù)擴增；預(yù)擴引物是與酶切中所選擇的酶所對應(yīng)的引物；采用20μL反應(yīng)體系進行SAMPL擴增，擴增引物一個是與預(yù)擴增引物相對應(yīng)的引物，另一個為SAMPL引物。本發(fā)明對SAMPL的復(fù)雜體系進行優(yōu)化和引物設(shè)計，構(gòu)建了適用于不結(jié)球白菜的SAMPL反應(yīng)體系，實現(xiàn)不結(jié)球白菜分子標記。文檔編號C12Q1/68GK101260433SQ20081003684公開日2008年9月10日申請日期2008年4月29日優(yōu)先權(quán)日2008年4月29日發(fā)明者楊劉,王新華,陳火英申請人:上海交通大學(xué)