專利名稱：一種油桐殼生產(chǎn)生物丁醇的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種油桐殼生產(chǎn)生物丁醇的方法。
背景技術：
油桐(Vernicia fordii Hemsley)屬于大戟科油桐屬，為中亞熱帶落葉喬木,是原產(chǎn)我國且栽培利用悠久的重要工業(yè)油料樹種。在湖南、湖北、貴州、重慶、四川、廣西、廣東、云南、陜西、河南、安徽、江蘇、浙江、江西、福建、臺灣等地區(qū)均有栽培分布，其中以湖南、重慶、貴州、湖北的毗鄰地區(qū)為中心產(chǎn)區(qū)。油桐的主要產(chǎn)品是桐油，為最佳干性油之一，在工業(yè)上具有廣泛用途。油桐殼是油桐果加工桐油的副產(chǎn)物，占油桐果鮮重的40-55%。長期以來，油桐殼大多被人們丟棄浪費，被丟棄的油桐殼在降解過程中產(chǎn)生的異味氣體污染空氣，產(chǎn)生的液體和固體污染水源。2011年我國原油進口依存度高達55. 3%，預計到2015我國原油進口依存度將超過65.0%。對化石能源，特別是石油資源的高依賴程度正制約著我國經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展，影響著國家的戰(zhàn)略安全。隨著石油資源的耗竭和溫室效應等環(huán)境問題的日益突出，高效利用可再生原料生產(chǎn)能源和化學品已成為全球關注的重點之一。醇類是一類重要的平臺化學品，其中大部分醇可以通過微生物發(fā)酵轉化而得，因此，醇類被認為是極具發(fā)展?jié)摿Φ纳锶剂虾蜕锘瘜W品。丁醇是一種重要的平臺化學品，主要用于制造增塑劑或用作溶齊U、萃取劑等。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)丁醇的熱值、辛烷值與汽油相當，其含氧量與汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不會腐蝕管道，不易吸水，便于管道輸送；蒸汽壓低，安全性高，且能與汽油以任意比混合。所以，丁醇已成為被世界各國企業(yè)和研究機構強烈關注的一種極具潛力的新型生物燃料[Durre, P.，Biobutanol: an attractive biofuel. Biotechnol.J. 2007，2，(12)，1525-34. ]。丁醇燃料的使用可以有效地減少化石燃料的消耗和溫室氣體的排放。目前，丁醇主要通過化學合成法生產(chǎn)，其原料來源于石化產(chǎn)品。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇在很多方面有化學合成法不可比擬的優(yōu)點，微生物發(fā)酵為丁醇的工業(yè)化生產(chǎn)開辟了新的道路，有名的ABE發(fā)酵法(丙酮-丁醇-乙醇)曾經(jīng)是世界上第二大生物發(fā)酵工程。ABE發(fā)酵法則是以糧食為原料，經(jīng)發(fā)酵獲得丙酮、丁醇、乙醇(質(zhì)量比3:6:1)，再經(jīng)精餾后分別制得丙酮、丁醇和乙醇產(chǎn)品。近年來隨著石油價格的不斷上漲，丁醇發(fā)酵工業(yè)已迎來復蘇產(chǎn)業(yè)的大好時機。由于第一代生物能源的發(fā)展是基于糧食為原料的，這會帶來生物能源與糧爭地、與人爭糧的問題。因此，目前迫切需要開發(fā)利用其它原料來生產(chǎn)生物能源的技術，即第二代生物能源技術。第二代生物能源技術的特點是利用 非糧作物即纖維素類等生物質(zhì)來生產(chǎn)大宗的能源產(chǎn)品(如生物乙醇、生物丁醇等)。目前，已經(jīng)有國內(nèi)外研究者報道了利用各種生物質(zhì)來生產(chǎn)丁醇的嘗試，報道的生物質(zhì)大多是農(nóng)業(yè)廢棄物，如大、小麥秸桿、玉米秸桿、玉米皮、玉米芯等。然而，利用林業(yè)廢棄物來生產(chǎn)生物丁醇的報道非常少見。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提高一種油桐殼生產(chǎn)生物丁醇的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種油桐殼生產(chǎn)生物丁醇的方法，包括以下步驟
(1)油桐殼收集和預處理將油桐殼收集后，曬干或烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后，過>100目篩，得過篩物油桐殼粉末；
(2)油桐殼水解按過篩物油桐殼粉末質(zhì)量稀硫酸體積=1:5-9(優(yōu)選1:6)的比例向過篩物油桐殼粉末中加入質(zhì)量濃度為1-5%的稀硫酸(優(yōu)選質(zhì)量濃度為2%的稀硫酸)，在120-180°C水解1-3小時，得油桐殼水解液，控制油桐殼水解液中總糖濃度為35-45g/L ；
(3)水解液發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將油桐殼水解液冷卻至室溫，過濾去除固形物，配制成發(fā)酵培養(yǎng)基；
(4)油桐殼水解液發(fā)酵將步驟(3)中配制好的培養(yǎng)基轉入發(fā)酵罐中，然后接種預先培養(yǎng)好的菌種，菌種的接種量為發(fā)酵水解液培養(yǎng)基體積的5%-10%，在35-40°C厭氧發(fā)酵72-120 小時；
發(fā)酵所用菌種可為丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum DSM 792,購自德國微生物菌種保存中心)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052，購自英國食品工業(yè)與海洋細菌菌種保藏中心)，或丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌的等體積混合物。進一步，步驟(3)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配制向油桐殼水解液中加入乙酸鈉直至乙酸鈉濃度為3. 0-5. Og/L (優(yōu)選4. Og/L),加入磷酸二氫鉀直至磷酸二氫鉀濃度為0. 75-0. 95g/L (優(yōu)選0. 85g/L)，加入磷酸氫二鉀直至磷酸氫二鉀濃度為0. 75-0. 95g/L (優(yōu)選0. 85g/L)，加入硫酸鎂直至硫酸鎂濃度為0. 20-0. 30g/L (優(yōu)選0. 25g/L)，加入硫酸錳直至硫酸錳濃度為0. 01-0. 03g/L (優(yōu)選0. 02g/L)，加入硫酸鐵直至硫酸鐵濃度為0. 01-0. 03g/L (優(yōu)選 0. 02g/L)，用氨水調(diào)節(jié) pH 值為 6. 5-7. 0，在 110_120°C滅菌 15-25 分鐘。研究表明，梭菌屬中丙酮丁醇梭菌(CZo1S tridium ace tobutylicum)、拜氏梭舊(Clostridium bei jerinckii)能發(fā)酵生產(chǎn)丁醇S. ; Shaheen, R. ; Jones,R T.，Emended descriptions of Clostridium ace tobu tyli cum and Cl os tri di umbei jerinckii, and descriptions of Cl os tri di um saccharoperbu tylace toni cumsp. nov. and Cl os tri di um saccharobutyl icum sp. nov [J]. In t. J. Sys t.EvoL Microbiol. 2001，51， (Pt 6)，2095-103. T7。丙酮丁醇梭舊(Clostridiumacetobutylicum)是低GC含量的，能形成孢子的,一種嚴格厭氧的革蘭氏陽性細菌,它能以各種各樣的糖(如葡糖糖、半乳糖、纖維二糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖)為底物進行發(fā)酵產(chǎn)酸(乙酸和丁酸)和溶劑(丙酮、丁醇和乙醇)\_Ezeji, T. ; Qureshi, N. ; Blaschek,H. P.，Butanol production from agricultural residues: Impact of degradationproducts on Clostridium beijerinckii growth and butanol fermentation.BiotechnoL Bioeng. 2007，97， (6)，1460-1469.];而拜氏梭 KClostridiumbeijerinckii)的底物譜和pH適宜范圍更寬，在發(fā)酵上比丙酮丁醇梭菌
況應」更具有工業(yè)應用潛力 \_Ezeji，T. C. ; Qureshi, N. ; Blaschek, KP.，Butanol fermentation research: upstream and downstream manipulations. TheChemical Record 2004，4，(5), 305-314.]。對本發(fā)明所得油桐殼水解液中的糖類(木糖、葡萄糖和阿拉伯糖)和發(fā)酵后的代謝產(chǎn)物(乙酸、丁酸、丙酮、丁醇、乙醇等)使用高效液相色譜(High performance LiquidChromatography, HPLC)分離鑒定,采用外標法進行定量分析。具體方法如下取出發(fā)酵過程中的樣品，進行離心取上清液；上清液用Millipore Millex-GP PES (SLGP033RB)0. 22 iim針頭式過濾器過濾；過濾后的上清液全自動進樣，進入Agilentl200 HPLC(AgilentTechnologies公司)系統(tǒng),用0. 05mM稀H2SO4作為流動相,流速0. 5mL/min,使用Bio-RadAminex HPX-87H離子交換柱(7.8X300 mm，Bio-Rad公司)，上樣量5 y L，柱溫控制在15°C,在30°C下使用示差折光檢測器(Refractive index (RI) detector)進行信號檢測。本發(fā)明之油桐殼生產(chǎn)生物丁醇的方法，為丁醇微生物發(fā)酵提供一條新的途徑，不但可解決我國能源短缺的問題，還可避免因傳統(tǒng)丁醇發(fā)酵生產(chǎn)所帶來的與人爭糧的問題。此外，隨著桐油在國民經(jīng)濟中的用途日益廣泛，產(chǎn)量的不斷增長，每年將有大量的副產(chǎn)物油桐殼產(chǎn)出。利用本發(fā)明，可充分開發(fā)和利用這些油桐殼資源，在提高油桐副產(chǎn)物利用率的同時，減少資源浪費和環(huán)境污染。
具體實施例方式以下結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例I
本實施例包括以下步驟
(1)油桐殼的收集和預處理將油桐殼收集后，曬干，經(jīng)粉碎機粉碎后，過100目篩，稱取過篩油桐殼粉末I. Okg ；
(2)油桐殼的水解向油桐殼粉末中加入6L質(zhì)量濃度為2%的稀硫酸，混勻后裝入帶有冷卻裝置的高壓反應釜中，在160°C水解I小時，得油桐殼水解液；經(jīng)檢測，油桐殼水解液中總糖含量為40. 6g/L ；
(3)水解液發(fā)酵培養(yǎng)基的配制待步驟(2)中油桐殼水解液冷卻至室溫后，過濾去除固形物，再向水解液中加入乙酸鈉直至水解液中乙酸鈉含量為4. 0g/L，加入磷酸二氫鉀至水解液中磷酸二氫鉀含量為0. 85g/L，加入磷酸氫二鉀直至水解液中磷酸氫二鉀含量為0. 85g/L，加入硫酸鎂直至水解液中硫酸鎂含量為0. 25g/L，加入硫酸錳直至水解液中硫酸錳含量為0. 02g/L，加入硫酸鐵直至水解液中硫酸鐵含量為0. 02g/L，用氨水調(diào)節(jié)pH值為
6.8，在115°C滅菌20分鐘，制成發(fā)酵培養(yǎng)基；
(4)油桐殼水解液發(fā)酵將步驟(3)中配制好的培養(yǎng)基轉入發(fā)酵罐中，無菌操作接種預先培養(yǎng)好的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum DSM 792,購自德國微生物菌種保存中心)，菌種的接種量為發(fā)酵水解液培養(yǎng)基體積的5%，在37°C厭氧發(fā)酵120小時，即成。本實施例所得發(fā)酵產(chǎn)物中溶劑(丁醇、乙醇和丙酮)的含量測定取出發(fā)酵過程中的樣品，進行離心取上清液；上清液用Millipore Mi llex-GP PES (SLGP033RB) 0. 22 u m針頭式過濾器過濾；過濾后的上清液全自動進樣，進入Agilent 1200 HPLC (AgilentTechnologies公司)系統(tǒng)，用0. 05mM稀H2SO4作為流動相，流速0. 5mL/min,使用Bio-RadAminex HPX-87H離子交換柱(7. 8 X 300mm，Bio-Rad公司)，上樣量5 y L，柱溫控制在15°C，在30°C使用示差折光檢測器(Refractive index (RI) detector)進行信號檢測,采用外標法進行定量分析。發(fā)酵結果經(jīng)120小時發(fā)酵后，產(chǎn)生丁醇7. 6g/L，乙醇I. 3g/L，丙酮3. 2g/L，總溶劑12. lg/L ;其中丁醇的比例達到62. 8%。實施例2 本實施例與實施例I的區(qū)別在于步驟(4),所用發(fā)酵菌種為拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii NCIMB 8052，購自英國食品工業(yè)與海洋細菌菌種保藏中心)。發(fā)酵結果經(jīng)120小時發(fā)酵后，產(chǎn)生丁醇8. 3 g/L，乙醇I. lg/L,丙酮2. 9g/L，總溶劑12. 3g/L ;其中丁醇的比例達到67. 5%。實施例3
本實施例與實施例I的區(qū)別在于步驟(4)，所用發(fā)酵菌種為丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum DSM 792,購自德國微生物菌種保存中心)和拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052,購自英國食品工業(yè)與海洋細菌菌種保藏中心)等體積混合物。發(fā)酵結果經(jīng)120小時發(fā)酵后，產(chǎn)生丁醇9. 8g/L，乙醇I. lg/L，丙酮3.4g/L，總溶劑14. 3g/L ;其中丁醇的比例達到68. 5%。
權利要求
1.一種油桐殼生產(chǎn)生物丁醇的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)油桐殼收集和預處理將油桐殼收集后，曬干或烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后，過>100目篩，得過篩物油桐殼粉末； (2)油桐殼水解按過篩物油桐殼粉末質(zhì)量稀硫酸體積=1:5-9的比例向過篩物油桐殼粉末中加入質(zhì)量濃度為1-5%的稀硫酸，120-180°C水解1-3小時，得油桐殼水解液，控制油桐殼水解液中總糖濃度為35-45g/L ； (3)水解液發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將油桐殼水解液冷卻至室溫，過濾，去除固形物，配制成發(fā)酵培養(yǎng)基； (4)油桐殼水解液發(fā)酵將步驟(3)中配制好的培養(yǎng)基轉入發(fā)酵罐中，然后接種預先培養(yǎng)好的菌種，菌種的接種量為發(fā)酵水解液培養(yǎng)基體積的5%-10%，在35-40°C厭氧發(fā)酵72-120 小時； 發(fā)酵所用菌種為丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum DSM 792)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii NCIMB 8052),或丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌的等體積混合物。
2.根據(jù)權利要求I所述的油桐殼生產(chǎn)生物丁醇的方法，其特征在于步驟(3)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配制向油桐殼水解液中加入乙酸鈉直至乙酸鈉濃度為3. 5-4. 5g/L，加入磷酸二氫鉀直至磷酸二氫鉀濃度為0. 75-0. 95g/L，加入磷酸氫二鉀直至磷酸氫二鉀濃度為0. 75-0. 95 g/L，加入硫酸鎂直至硫酸鎂濃度為0. 20-0. 30g/L,加入硫酸錳直至硫酸錳濃度為0. 01-0. 03g/L,加入硫酸鐵直至硫酸鐵濃度為0. 01-0. 03g/L，用氨水調(diào)節(jié)pH值為6. 5-7. 0，在 110-120°C滅菌 15-25 分鐘。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的油桐殼生產(chǎn)生物丁醇的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配制向油桐殼水解液中加入乙酸鈉直至乙酸鈉濃度為4. Og/L，加入磷酸二氫鉀直至磷酸二氫鉀濃度為0. 85g/L，加入磷酸氫二鉀直至磷酸氫二鉀濃度為0. 85g/L，加入硫酸鎂直至硫酸鎂濃度為0. 25g/L，加入硫酸錳直至硫酸錳濃度為0. 02g/L，加入硫酸鐵直至硫酸鐵濃度為0. 02g/L，用氨水調(diào)節(jié)pH值為6. 8，在115°C滅菌20分鐘。
全文摘要
一種油桐殼生產(chǎn)生物丁醇的方法，包括以下步驟(1)油桐殼收集和預處理；(2)油桐殼水解按過篩物油桐殼粉末質(zhì)量:稀硫酸體積=1:5-9的比例向過篩物油桐殼粉末中加入質(zhì)量濃度為1-5%的稀硫酸，在120-180℃水解1-3小時，得桐殼水解液，控制水解液中總糖濃度為35-45g/L；(3)水解液發(fā)酵培養(yǎng)基的配制；(4)油桐殼水解液發(fā)酵將步驟(3)中配制好的培養(yǎng)基轉入發(fā)酵罐中，然后接種預先培養(yǎng)好的菌種，菌種的接種量為發(fā)酵水解液培養(yǎng)基體積的5%-10%，在35-40℃厭氧發(fā)酵72-120小時，即成。利用本發(fā)明，可提高油桐殼的利用率，減少資源浪費和環(huán)境污染。
文檔編號C12R1/145GK102618586SQ201210077110
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月22日 優(yōu)先權日2012年3月22日
發(fā)明者毛紹名, 章懷云 申請人:中南林業(yè)科技大學