一種自由控制丙丁梭菌abe發(fā)酵丙酮產(chǎn)量與丙酮/丁醇比的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提高和自由控制ABE發(fā)酵丙酮/丁醇比的方法，尤其是利用丙丁梭 菌生產(chǎn)丙酮和丁醇、強(qiáng)化生物丙酮合成的新型發(fā)酵方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 丁醇和丙酮都是重要的平臺(tái)化合物，在化工、塑料、醫(yī)藥、有機(jī)合成、涂料和印染等 行業(yè)具有廣泛用途。同時(shí)，生物丁醇是一種極具潛力、清潔可再生的新型液態(tài)燃料，可作為 化石燃料的替代品；而丙酮?jiǎng)t是優(yōu)良的柴油助燃劑，它可以提高柴油的燃燒性能、減少有害 氣體(N〇x、S〇x等）的排放，環(huán)境效益明顯（Wu H，Nithyanandan K,Zhang J，et al. Impacts of acetone-butanol-ethanol(ABE)ratio on spray and combustion characteristics ofABE-diesel blends .Appl · Energy，2015，149:367-378)。發(fā)展生物燃料和高效燃料添加 劑已成為世界各國(guó)應(yīng)對(duì)能源危機(jī)、減少溫室氣體排放、改善氣候環(huán)境的重要措施。丙酮-丁 醇-丁醇發(fā)酵也稱為ABE (Acetone-Butanol-Ethanol)發(fā)酵，其主產(chǎn)品是丁醇，丙酮是主要副 產(chǎn)品，發(fā)酵產(chǎn)物中的丁醇/丙酮/乙醇的摩爾比率大約為6:3:1(質(zhì)量比約為67:26:7)。目前， 人們更為看中的是丁醇發(fā)酵生產(chǎn)，幾乎所有研究都集中在高效生產(chǎn)丁醇、抑制丙酮合成，增 加丁醇在總?cè)軇┲兴加械谋嚷?等同于降低丙酮/ 丁醇比），提高原料對(duì)丁醇的轉(zhuǎn)化率等 方面。
[0003] 2014年，我國(guó)丙酮消費(fèi)量達(dá)130萬(wàn)噸，年增加率逾10%。目前，由于沒(méi)有專一性發(fā)酵 生產(chǎn)丙酮的微生物菌株，丙酮基本上完全(90%以上)依靠不可再生的、化石原料合成生產(chǎn)， 其可持續(xù)發(fā)展和碳排放存在很大問(wèn)題。ABE發(fā)酵可以生產(chǎn)少量丙酮，但是，多年來(lái)，丙酮生物 合成并不受重視。其原因在于：1)發(fā)酵濃度太低(一般只有5g/L左右）；2)與主產(chǎn)品（丁醇)搶 奪發(fā)酵原料、降低原料的目標(biāo)轉(zhuǎn)化率。但是，即便丙酮發(fā)酵濃度很低，它畢竟也是一個(gè)副產(chǎn) 品、而不能簡(jiǎn)單地拋棄，其產(chǎn)量仍舊要統(tǒng)計(jì)到ABE發(fā)酵的原料利用報(bào)表中去。目前，發(fā)酵法生 產(chǎn)丙酮仍利用傳統(tǒng)丙丁發(fā)酵菌種(丙丁梭菌、拜式梭菌、糖型梭菌等)進(jìn)行，生產(chǎn)效率低。生 命周期評(píng)價(jià)(life cycle assessment，LCA)法是一種對(duì)多重產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行經(jīng)濟(jì)評(píng)價(jià)的 有效方法。它通過(guò)對(duì)某一過(guò)程的產(chǎn)品多樣性、產(chǎn)品價(jià)格、溫室氣體排放，以及生產(chǎn)原料的物 性和能量特征進(jìn)行評(píng)估，找出過(guò)程經(jīng)濟(jì)性、環(huán)境效益和產(chǎn)品多樣性的最佳切入點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn) 生產(chǎn)過(guò)程性能的整體最優(yōu)。有研究報(bào)道指出，ABE發(fā)酵的LCA和經(jīng)濟(jì)性依賴于將丙酮作為重 要平臺(tái)化合物和高效清潔燃料添加劑的評(píng)價(jià)（K6hlerKA，Riihl J，Blank L M，et al. Integration ofbiocatalyst and process engineering for sustainable and efficient n-butanol production.Eng.Life Sci. ,2015,15:4-19)。實(shí)際上，側(cè)重LCA的 ABE發(fā)酵實(shí)際上等同于同時(shí)強(qiáng)化丙酮和丁醇的合成、并最大可能地提高丙酮/ 丁醇質(zhì)量比。
[0004] 傳統(tǒng)丙丁梭菌實(shí)際上也具備高產(chǎn)丙酮的能力。但是，由于ABE發(fā)酵存在嚴(yán)重的丁醇 產(chǎn)物抑制，一旦丙丁梭菌間歇式ABE發(fā)酵開始，丁醇濃度迅速上升，在較短時(shí)間內(nèi)（40-50h) 達(dá)到抑制濃度，丙丁梭菌的產(chǎn)丙酮的能力無(wú)法得到體現(xiàn)。一般情況下，最終丁醇濃度和丙酮 濃度分別停留在12-13g/L和5-6g/L左右的水平。使用高效丁醇原位萃取劑-油醇，選擇性地 將丁醇萃取到油醇中、控制發(fā)酵液相中的丁醇濃度于低水平，發(fā)酵液相中的丙酮濃度甚至 可以積累到15g/L左右的高水平(數(shù)據(jù)未公開）。但是，由于高效丁醇原位萃取劑(油醇)價(jià)格 昂貴、原位萃取體系操作難度大，實(shí)用上存在很大問(wèn)題，現(xiàn)在丁醇和丙酮生物合成的主流依 舊是間歇發(fā)酵。與丁醇及其合成相比，丙酮及其合成具有截然不同的特征:丙酮合成不需要 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的參與，對(duì)細(xì)胞的能量供給壓力??；丙酮對(duì)細(xì)胞的毒害作用 小、提高其發(fā)酵濃度不會(huì)影響溶劑生產(chǎn)效率;丙酮沸點(diǎn)低、蒸餾精制相對(duì)容易、精制純化成 本低。因此，從以下幾個(gè)方面考慮對(duì)ABE發(fā)酵過(guò)程實(shí)施調(diào)控，提高生物丙酮的生產(chǎn)效率、提高 或控制丙酮/丁醇比，從強(qiáng)化丙酮合成的角度改善ABE發(fā)酵的總體性能是可行的：1)通過(guò)環(huán) 境脅迫，強(qiáng)化丙丁梭菌(C.acetobutylicum)對(duì)于高丁醇濃度環(huán)境的耐受能力(Luo H Z，Ge L B, Zhang J S,et al. Enhancing butanol production under the stress environments of c〇-culturing Clostridium acetobuty1icum/Saccharomyces cerevisiae integrated with exogenous butyrate addition,PLoS ONE,2015,10(10): e0141160);2)通過(guò)適度降低梭菌胞內(nèi)的NADH再生速度，改變梭菌胞內(nèi)碳代謝流的分配、使 較多的碳流走向丙酮合成途徑，降低細(xì)胞的能量供給壓力、使得ABE發(fā)酵以高效的NADH再生 模式運(yùn)車專（Luo Η Z,Ge L B,Zhang J S,etal.Enhancing acetone biosynthesis and acetone-butanol-ethanol fermentation performance by co-culturing Clostridium acetobutylicum/Saccharomyces cerevisiae integrated with exogenous acetate addition.Bioresour .Technol · ,2016,200:43-51); 3)控制發(fā)酵體系的還原糖濃度于低水 平、弱化梭菌糖酵解主路的碳代謝速度，進(jìn)而限制NADH的生成，為高丙酮/ 丁醇比率的形成 創(chuàng)造條件;4)外添乙酸作為共同碳源、維持胞內(nèi)乙酸濃度于較高水平，提高催化丙酮合成的 輔酶A轉(zhuǎn)移酶（CoAT)的活性（Chen C K，Blaschek H P.Effect of acetate on molecular and physiological aspects of Clostridium beijerinckii NCIMB 8052solvent production and strain degeneration.Appl.Environ.Microbiol.,1999,65:499-505), 進(jìn)而強(qiáng)化ABE整體代謝網(wǎng)絡(luò)中的丙酮合成途徑。
[0005] 在申請(qǐng)人前期的研究中，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，在丙丁梭菌/釀酒酵母混合培養(yǎng)的操作模式 下、外添少量乙酸可以在維持甚至提高ABE發(fā)酵丁醇濃度的同時(shí)，較大幅度地提升丙酮的合 成強(qiáng)度和效率。與傳統(tǒng)ABE發(fā)酵(對(duì)照組；丙酮質(zhì)量濃度約5.0g/L，丙酮/丁醇比0.50)相比， 外添化學(xué)合成乙酸時(shí)，丙酮質(zhì)量濃度和丙酮/丁醇（質(zhì)量）比分別達(dá)到8.27g/L和0.59,增幅 分別為41.1 %和18.0%;外添廉價(jià)的乙酸發(fā)酵上清液時(shí)，相應(yīng)的發(fā)酵指標(biāo)達(dá)到8.55g/L和 0.60,增幅分別為46.0%和20.0%，發(fā)酵原料成本降低、丙酮發(fā)酵生產(chǎn)的可行性提高。發(fā)酵 性能改善的原因在于：1)該發(fā)酵控制策略可刺激有利于梭菌生存和丁醇合成的4種氨基酸 的胞內(nèi)分泌，提高了梭菌對(duì)高丁醇濃度環(huán)境的耐受能力；可以在保證丁醇正常合成的前提 下，適度抑制NADH再生、降低細(xì)胞能量周轉(zhuǎn)負(fù)擔(dān)、延緩了梭菌細(xì)胞的過(guò)早凋亡；可以提高 CoAT的活性、適度強(qiáng)化外添乙酸向丙酮的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而改善了 ABE發(fā)酵性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目標(biāo)是提供一種可以提高和自由控制丙丁梭菌ABE發(fā)酵丙酮濃度與丙 酮/ 丁醇比的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:在發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)制過(guò)程中， 將培養(yǎng)基初始還原糖(葡萄糖)濃度控制在20-60g/L的水平，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入到產(chǎn)溶劑期pH觸底 反彈回升0.2-0.3后，控制葡萄糖濃度在接近于0-3.9g/L的低水平，維持ABE厭氧發(fā)酵條件 直至發(fā)酵結(jié)束。
[0007] 丙丁梭菌具有分泌淀粉酶(液化)和糖化酶(糖化)的復(fù)雜酶系，當(dāng)葡萄糖濃度降至 接近于〇的低水平后，梭菌可以繼續(xù)分泌糖化酶、維持葡萄糖于低濃度，限制梭菌胞內(nèi)糖酵 解途徑的碳代謝和NADH的生成速度。
[0008] 為了獲得更好的效果可以添入乙酸溶液、強(qiáng)化外添乙酸向丙酮的生物轉(zhuǎn)化，形成 雙底物環(huán)境。在能量代謝基本不受破壞、丁醇濃度未達(dá)到抑制濃度的條件下，適度抑制丁醇 生產(chǎn)、有效地利用乙酸底物，打出時(shí)間差、強(qiáng)化丙酮合成。
[0009] 為了獲得更好的技術(shù)效果，可以在添入乙酸溶液的基礎(chǔ)上，再添加一定量的釀酒 酵母，形成丙丁梭菌和釀酒酵母的混合發(fā)酵體系，釀酒酵母在嚴(yán)格厭氧環(huán)境中仍然可以生 存，利用上述混合發(fā)酵體系提高梭菌細(xì)胞對(duì)高丁醇濃度環(huán)境的耐受能力，嚴(yán)格控制葡萄糖 濃度于低水平，最終提高丙酮濃度和丙酮/丁醇比，維持丁醇產(chǎn)量不變。
[0010]乙酸溶液可以使用工業(yè)級(jí)合成乙酸調(diào)配，也可以直接使用乙酸發(fā)酵上清液、替代 合成乙酸以降低發(fā)酵原料成本。通過(guò)使用以上調(diào)控手段或策略，可將丙酮濃度和丙酮/ 丁醇 比任意控制在5-12g//L和0.5-1.0的水平，并可維持丁醇濃度于10-148/1的正常水平，充分 滿足工業(yè)ABE發(fā)酵對(duì)于丙酮/ 丁醇比的不同需求。由于需要限制還原糖濃度和梭菌胞內(nèi)糖酵 解途徑的碳代謝速度，如果需要獲取高丙酮濃度和丙酮/丁醇比，發(fā)酵時(shí)間將略有延長(zhǎng)(55-65h vs 50h)。
[0011] 所述釀酒酵母可選擇市售的安琪