專利名稱：一株產(chǎn)谷胱甘肽的酵母工程菌及其在生產(chǎn)谷胱甘肽中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)谷胱甘肽的酵母工程菌，其構(gòu)建方法，及其在生產(chǎn)谷胱甘肽中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
谷胱甘肽(glutathione，GSH)又名Y _L_谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸縮合形成的生物活性三肽化合物，廣泛存在于動物、植物和微生物細(xì)胞中。發(fā)酵法因其可以利用廉價(jià)的生產(chǎn)原料通過特定的微生物代謝合成谷胱甘肽，操作簡單、成本較低且生產(chǎn)速率快而越來越受到青睞(Meister A，Anderson M Ε. Glutathione[J]. Ann Rev Biochem,1983,52 :711-760. Li Y， Wei G Y,Chen J, Glutathione :a review on biotechnological production[J]Appl MicrobiolBiotechnol，2004，66 (3) :233-242)。GSH的生理功能主要有以下幾方面(1)抗自由基對細(xì)胞的損傷機(jī)體代謝產(chǎn)生的過多自由基會損傷生物膜、侵襲生命大分子、加快機(jī)體衰老、誘發(fā)腫瘤或動脈硬化的產(chǎn)生。GSH可以通過巰基與體內(nèi)的自由基結(jié)合轉(zhuǎn)化成易代謝的酸性物質(zhì)，加速自由基的排泄，對細(xì)胞起到強(qiáng)有力的保護(hù)作用。⑵除外源有毒物質(zhì)的毒性GSH能與進(jìn)入機(jī)體有毒化合物、重金屬離子等直接結(jié)合，并促其排出體外，起到中和解毒的作用。臨床上已應(yīng)用GSH來解除丙烯腈、氟化物、C0、重金屬、有機(jī)溶劑的中毒現(xiàn)象。( 促進(jìn)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)GSH可通過Y-谷氨?；D(zhuǎn)運(yùn)酶直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并通過Y2谷氨?；h(huán)參與眾多氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。(4)是多種酶的輔基或輔酶GSH參與三羧酸循環(huán)與糖代謝，組織中有許多酶是以GSH為輔酶，其活性需要GSH的存在才能表現(xiàn)出來。另外，GSH對于需要巰基的酶有保護(hù)或恢復(fù)活性的作用。(5)參與轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)丙氨基反應(yīng)，維持肝細(xì)胞正常功能(劉娟，劉春秀，王雅琴等。發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2002，四(6) :71-75)。谷胱甘肽的生物合成由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸通過谷氨酰半胱氨酰合成酶(GSH I)和谷胱甘肽合成酶(GSH II)催化的。其中，GSH I是GSH合成中的限速酶，受GSH的反饋抑制。在合成過程中，每合成一分子的谷胱甘肽需要消耗二分子的ATP。另外，GSH也可以在NADPH存在時(shí)通過谷胱甘肽還原酶將氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原得到。在微生物界，GSH產(chǎn)生菌主要集中在真核生物和革蘭氏陰性菌中。野生型釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母本身具有較高的GSH含量(占細(xì)胞干重的0. 1.0% )，并且能夠持續(xù)保持GSH的合成能力，因此它們已成為工業(yè)生產(chǎn)谷胱甘肽最常用的菌種。在實(shí)際發(fā)酵生產(chǎn)中，GSH產(chǎn)量的提高可以通過兩個(gè)方面來實(shí)現(xiàn)一是菌體本身細(xì)胞內(nèi)GSH含量的提高；二是通過提高菌體生物量使GSH的總量提高。工業(yè)發(fā)酵的最終目標(biāo)是以最低的生產(chǎn)成本獲得最大的產(chǎn)值和收益，而實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的手段就是針對每個(gè)特定過程建立相應(yīng)的高效發(fā)酵模式。GSH的發(fā)酵過程可以分為兩個(gè)階段細(xì)胞生長階段和GSH的合成階段。所以，GSH總量的增加可以分別在這兩個(gè)階段通過增加細(xì)胞的生物量或者細(xì)胞內(nèi)GSH的合成量來實(shí)現(xiàn)。而對發(fā)酵過程的控制可以同時(shí)從這兩個(gè)方面使GSH的總量提高。目前，通過補(bǔ)料分批培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵是增加細(xì)胞生物量的最成熟和最完善的方法。但是，在實(shí)際發(fā)酵過程中，由于溶氧、副產(chǎn)物積累等因素影響了細(xì)胞的生長，從而難以實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵。因此，解決供氧問題是獲得大量目的產(chǎn)物的關(guān)鍵之一。傳統(tǒng)的解決辦法是改善設(shè)備的供氧能力，提高攪拌速度，增大通氣量，以增加空氣在培養(yǎng)液中的截留率，增加氣液相接觸的比表面積；或者在培養(yǎng)液中加入某些助溶劑，以提高氧的溶解度。所有這些方法均受到設(shè)備和能耗的限制，現(xiàn)在僅用于通氣和攪拌的能耗已占整個(gè)發(fā)酵成本的1/3，嚴(yán)重限制了發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展。透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla hemoglobin，簡稱為VHb)是原核生物中迄今發(fā)現(xiàn)的唯一的一種血紅蛋白，能夠從分子水平上提高透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)重組菌對氧氣的利用能力，因此能在限氧條件下促進(jìn)細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成，從而大幅度提高發(fā)酵過程中目的產(chǎn)物的產(chǎn)量和收率。VHb的應(yīng)用不僅可以降低氧氣及能量的消耗，還不需要附加的設(shè)備投資，因此可大大降低發(fā)酵成本?？梢哉f，VHb的發(fā)現(xiàn)及研究進(jìn)展為利用分子克隆技術(shù)解決微生物發(fā)酵過程中的氧氣供求矛盾及實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵培養(yǎng)提供了良好途徑，因此VHb的研究與應(yīng)用必將成為發(fā)酵工業(yè)中的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，具有十分光明的前景。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)既有原核生物生長快、操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，又具有真核生物能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾的的優(yōu)點(diǎn)。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因的優(yōu)點(diǎn)有很多釀酒酵母培養(yǎng)條件普通，生長繁殖迅速，用于表達(dá)基因工程產(chǎn)品時(shí)工藝簡單，能夠耐受較高的流體靜壓，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低生產(chǎn)成本，已廣泛應(yīng)用于釀酒和食品工業(yè)；它不會產(chǎn)生毒素，安全可靠；釀酒酵母表達(dá)外源基因具有一定的翻譯后加工能力，收獲的外源蛋白具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，特別適合于表達(dá)真核生物基因，有利于保持生物產(chǎn)品的活性和穩(wěn)定性(唐香山，張學(xué)文。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)[J].生命科學(xué)研究，2004，8 (2)106-109)。VHb已成功的用于提高多種微生物中目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，但至今沒有利用VHb提高釀酒酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽產(chǎn)量的報(bào)道。將VHb應(yīng)用于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)中，有望解決釀酒酵母高密度發(fā)酵中供氧不足的問題，進(jìn)而提高谷胱甘肽在釀酒酵母中的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一株產(chǎn)谷胱甘肽的酵母工程菌，其構(gòu)建方法，及其在生產(chǎn)谷胱甘肽中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一株產(chǎn)谷胱甘肽的酵母工程菌，菌株名為101-V，分類命名為釀酒酵母Saccharomycescerevisiae，已于2012年02月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 5758。一種產(chǎn)谷胱甘肽的酵母工程菌的構(gòu)建方法，是將透明顫菌血紅蛋白基因Vgb整合到產(chǎn)谷胱甘肽的酵母基因組中，篩選得到能夠表達(dá)透明顫菌血紅蛋白基因的重組酵母，其中，透明顫菌血紅蛋白基因序列如SEQ ID NO. 1所示，為GenBank號為M27061的5'-端第142-582位核苷酸序列。所述用于將透明顫菌血紅蛋白基因Vgb整合到酵母基因組中使用的重組載體是pYM-vgb,該載體是將透明顫菌血紅蛋白基因vgb連接到質(zhì)粒pYMIKP (本實(shí)驗(yàn)室保存，圖譜參照說明書附圖1所示。劉向勇，沈煜，郭亭等。rDNA介導(dǎo)的多拷貝整合表達(dá)載體的構(gòu)建及其在釀酒酵母工業(yè)菌株中的應(yīng)用[J]。山東大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版)，2005，40C3) :105-109)上構(gòu)建而成。具體構(gòu)建步驟如下(1)以載體pYES3/CT-vgb為模板擴(kuò)增目的基因vgb ；(2)利用Bgl II分別酶切vgb片段和載體ρΥΜΙΚΡ，然后用T4DNA連接酶連接；(3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆并通過PCR及DNA測序分析鑒定重組質(zhì)粒pYM-vgb，最終獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pYM-vgb ；(4)將測序正確的重組質(zhì)粒pYM-vgb用限制性內(nèi)切酶Kpn I酶切線性化，利用電擊轉(zhuǎn)化法將線性化質(zhì)粒pYM-vgb轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中，在篩選平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，2 3天后挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)Mh，提培養(yǎng)物基因組，利用上述vgb的引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，獲得含有vgb基因的工程菌；(5)工程菌發(fā)酵及vgb表達(dá)產(chǎn)物檢測。所述步驟(1)中，引物為上游引物5‘ GGCGCAGATCTATGTTAGACCAGCAAAC3 ‘；
下游引物5 ‘ GGCAGATCTTTATTCAACCGCTTGAGC3 ‘；其中引物的5'均引入Bgl II酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增條件為①95°C，5min ；②94°C，30s ；③ 56°C，30s ；④ 72°C，Imin ；⑤循環(huán) 30_；35 次；⑥ 72°C，IOmin0所述步驟(4)中，電擊轉(zhuǎn)化的條件是電壓1. 5kV，電容25 μ F，電阻200 Ω，電擊時(shí)間4 5ms。所述步驟中，篩選平板為含遺傳霉素G418的抗生素平板。所述步驟(5)中，工程菌發(fā)酵的條件為30°C，200 250r/min培養(yǎng)2 3天。所述步驟(5)中，vgb表達(dá)產(chǎn)物檢測的方法為C0_差示光譜法，具體步驟如下(1)取細(xì)菌培養(yǎng)液6ml離心，沉淀用生理鹽水洗滌一次后重懸于3ml緩沖液中，超聲破碎，所述緩沖液為含有100mmol/L Tris-HCI、50mmol/L NaCI的水溶液，pH7. 5 ；(2) 40C、10000r/min 離心 15min，留上清；(3)上清用3ml步驟(1)所述的緩沖液稀釋一倍，并加入連二亞硫酸鈉至終濃度2. 5mg/ml ；(4)將經(jīng)步驟⑴ (3)處理過的樣品分成兩份，一份通CO，3min, 1個(gè)氣泡/s ；(5)用紫外可見光分光光度計(jì)在400 500nm范圍內(nèi)分別對兩份樣品掃描，以未經(jīng)CO處理的樣品作對照，所得的曲線即為CO-差示光譜圖，通過CO-差示光譜圖判斷透明顫菌血紅蛋白基因是否表達(dá)產(chǎn)物中是否含有透明顫菌血紅蛋白。本發(fā)明的產(chǎn)谷胱甘肽的酵母工程菌，能夠表達(dá)透明顫菌血紅蛋白，從而從分子水平上提高重組菌對氧氣的利用能力，進(jìn)而在限氧條件下促進(jìn)細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成，從而大幅度提高發(fā)酵過程中谷胱甘肽的產(chǎn)量和收率。本發(fā)明的工程菌，可以用于生產(chǎn)谷胱甘肽，其產(chǎn)量和收率，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通的產(chǎn)谷胱甘肽菌。


產(chǎn)谷胱甘肽的酵母工程菌，菌株名為101-V，分類命名為釀酒酵母Saccharomycescerevisiae，已于2012年02月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 5758，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。圖1為pYM-vgb重組載體的構(gòu)建過程示意圖。圖2為pYM-vgb重組載體酶切驗(yàn)證電泳圖，其中，泳道1為Bgl II酶切重組質(zhì)粒pYM-vgb,泳道2為Bgl II酶切ρYMIKP，泳道3為pYM-vgb，泳道4為ρYMIKP，泳道5為DNAMarker(10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、IOOObp)。圖3為目的基因整合到釀酒酵母基因組上得PCR驗(yàn)證的電泳圖，其中，泳道1為原始菌基因組，泳道2為無菌水，泳道3為質(zhì)粒pYM-vgb，泳道4、5分別為轉(zhuǎn)化子1和2，泳道6為 DNAMarker(10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、IOOObp)。圖4為CO-差示光譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1 表達(dá)VHb的釀酒酵母整合載體的構(gòu)建1.透明顫菌血紅蛋白基因vgb序列的獲得。以載體pYES3/CT-vgb為模板擴(kuò)增目的基因vgb，引物為上游引物5 ‘ GGCGCAGATCTATGTTAGACCAGCAAAC3 ‘下游引物5‘ GGCAGATCTTTATTCAACCGCTTGAGC3 ‘其中引物的5'均引入Bgl II酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增條件為①95°C，5min ；②94°C，30s ；③ 56°C，30s ；④ 72°C，Imin ；⑤循環(huán) 30_；35 次；⑥ 72°C，IOmin02.利用Bgl II分別酶切vgb片段和載體ρΥΜΙΚΡ，然后用T4DNA連接酶連接。3.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆并通過PCR及DNA測序分析鑒定重組質(zhì)粒pYM-vgb，最終獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pYM-vgb (其構(gòu)建過程見圖1，重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證見圖2)。實(shí)施例2 含VHb基因工程菌的構(gòu)建將實(shí)施例1中的測序正確的重組質(zhì)粒pYM-vgb用限制性內(nèi)切酶Kpn I酶切線性化，用乙醇沉淀純化酶切產(chǎn)物，回收后用于電轉(zhuǎn)化。具體方法如下(1)將轉(zhuǎn)化用酵母菌株的單菌落接種于YPD培養(yǎng)基5ml中，在30°C、搖床轉(zhuǎn)速為220r/min的培養(yǎng)條件下過夜培養(yǎng)至飽和；(2)接種適量的過夜培養(yǎng)液于50ml YPD培養(yǎng)基，直到0D600約為1. 3 1. 5 ；于4°C、3000r/min離心收獲培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞用無菌水IOOml重懸；(3)加入適量lmol/L 二硫蘇糖醇(DTT，用來疏松細(xì)胞壁)溶液，并同時(shí)旋轉(zhuǎn)搖動，于30°C輕輕搖動15min ；(4)用預(yù)冷的無菌水洗2 3次，離心條件為4°C，3000r/min，5min ；(5)用預(yù)冷的lmol/L山梨醇溶液洗2次，離心條件為4°C，3000r/min, 5min ；(6)最后用lmol/L山梨醇溶液200 μ 1懸浮，分裝至1. 5ml EP管中(100 μ 1/個(gè))放置IOmin后電轉(zhuǎn)；
(7)將電轉(zhuǎn)杯置于冰上預(yù)冷，取線性化DNA溶液10 μ 1與酵母感受態(tài)細(xì)胞懸液100 μ 1混合，冰上放置5min ；(8)轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，1. 5kV電擊，電容25 μ F，電阻200 Ω，然后立即加入預(yù)冷lmol/L山梨醇溶液900 μ 1，轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置IOmin ；(9)再轉(zhuǎn)入15ml離心管中，30°C復(fù)蘇2 3h ；(10)取50 μ 1、100 μ 1涂含有1000 μ g/ml遺傳霉素(G418)的抗性YPD平板；(11)在30°C培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3 4天后挑單菌落，在含G418的YPD液體培養(yǎng)基中，30°C、220r/min過夜培養(yǎng)其中涉及的YPD培養(yǎng)基配方為酵母抽提物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖 20g/L。(12)提取酵母基因組，用以下引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證(附圖3)，得到轉(zhuǎn)化成功的工程菌。上游引物5‘ GGCGCAGATCTATGTTAGACCAGCAAAC3 ‘下游引物5'GGCAGATCTTTATTCAACCGCTTGAGC3‘(13)VHb基因表達(dá)產(chǎn)物的驗(yàn)證采用的是CO-差示光譜法。具體操作如下將工程菌在30°C、搖床轉(zhuǎn)速為220r/min的培養(yǎng)條件下過夜培養(yǎng)，取發(fā)酵培養(yǎng)液6ml離心，離心條件為4°C，3000r/min，5min ；沉淀用生理鹽水洗滌一次后重懸于緩沖液(lOOmmol/LTris-HCl，50mmol/L NaCl, pH7. 5) 3ml 中，超聲破碎(500W，工作時(shí)間 10s，間歇時(shí)間 20s，破碎時(shí)間40 60min，在冰上進(jìn)行)；4°C、10000r/min離心15min，留上清；上清用緩沖液3ml稀釋一倍，并加入連二亞硫酸鈉至終濃度2. 5mg/ml ；將經(jīng)上處理過的樣品分成兩份，一份通CO 3min(l個(gè)氣泡/s)；然后用紫外可見光分光光度計(jì)在400 500nm范圍內(nèi)分別對兩份樣品掃描，以未經(jīng)CO處理的樣品作對照，所得的曲線即為CO-差示光譜圖。從圖4中可以看到，重組菌與原始菌相比，在419nm處有明顯的吸收峰，說明重組菌已成功表達(dá)出有生物活性的透明顫菌血紅蛋白。實(shí)施例3 基因工程菌的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)將原始菌株和實(shí)施例2得到的重組菌株分別接種在250ml含有YPD液體培養(yǎng)基50ml的三角瓶中，30°C過夜培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為220r/min。將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基以2%的接種量接種于250ml含有發(fā)酵培養(yǎng)基100ml的三角瓶中，30°C培養(yǎng)^h，搖床轉(zhuǎn)速為220r/min0發(fā)酵結(jié)束后，谷胱甘肽的含量采用Alloxan法(上海醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所.臨床生化檢驗(yàn)[M].上海科技出版利，1979,86-88.)進(jìn)行測定。發(fā)酵結(jié)果表明100ml的裝液量對于250ml的三角瓶來說通氣量不夠，不能滿足酵母在生長過程中對氧氣的需求量。原始菌株在100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中的產(chǎn)量為8%ig/L，而重組菌的谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)到122. 5mg/L。由此可知重組菌中谷胱甘肽的產(chǎn)量較原始菌高出45.8%，申請人將該菌株進(jìn)行了保藏，分類命名為釀酒酵母&iccharomycescerevisiae，于2012年02月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0. 5758。此實(shí)驗(yàn)說明了，在低氧條件下，原始菌的生長代謝明顯受到影響，而含有VHb基因的重組菌能夠?qū)崿F(xiàn)在較低溶氧水平條件下生產(chǎn)出較高產(chǎn)量的谷胱甘肽，解決了在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)過程中要求高溶氧的問題，為谷胱甘肽的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了可行性。需要注意的是，本發(fā)明的工程菌的構(gòu)建方法是有成功率的，也就是說，利用本發(fā)明的構(gòu)建方法所得到的重組工程菌，并非都能夠使谷胱甘肽的產(chǎn)量得到明顯提高，本發(fā)明的保藏的菌株，是發(fā)明人通過多次實(shí)驗(yàn)所得到的效果最好的重組工程菌，其谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)到122. 5mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它通過同樣的方法構(gòu)建得到的工程菌。
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)谷胱甘肽的酵母工程菌，其特征在于菌株名為101-V，分類命名為釀酒酵母&iccharomyces cerevisiae，已于2012年02月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 5758。
2.一種產(chǎn)谷胱甘肽的酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于是將透明顫菌血紅蛋白基因vgb整合到產(chǎn)谷胱甘肽的酵母基因組中，篩選得到能夠表達(dá)透明顫菌血紅蛋白基因的重組酵母，其中，透明顫菌血紅蛋白基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述用于將透明顫菌血紅蛋白基因 vgb整合到酵母基因組中使用的重組載體是pYM-vgb，該載體是將透明顫菌血紅蛋白基因 vgb連接到質(zhì)粒pYMIKP上構(gòu)建而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的構(gòu)建方法，其特征在于步驟為(1)以載體pYES3/CT-vgb為模板擴(kuò)增目的基因vgb；(2)利用BglII分別酶切vgb片段和載體ρΥΜΙΚΡ，然后用T4DNA連接酶連接；(3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆并通過PCR及DNA測序分析鑒定重組質(zhì)粒pYM-vgb，最終獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pYM-vgb ；(4)將測序正確的重組質(zhì)粒pYM-vgb用限制性內(nèi)切酶KpnI酶切線性化，利用電擊轉(zhuǎn)化法將線性化質(zhì)粒pYM-vgb轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中，在篩選平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，2 3天后挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)Mh，提培養(yǎng)物基因組，利用上述vgb的引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，獲得含有vgb基因的工程菌；(5)工程菌發(fā)酵及vgb表達(dá)產(chǎn)物檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟⑴中，引物為上游引物5 ‘ GGCGCAGATCTATGTTAGACCAGCAAAC3 ‘；下游引物5 ‘ GGCAGATCTTTATTCAACCGCTTGAGC3 ‘；其中引物的5'均引入Bgl II酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增條件為①95°C，5min ；②94°C，30s ； ③ 56°C，30s ；④ 720C，Imin ；⑤循環(huán) 30-35 次；⑥ 72°C，IOmin0
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟中，電擊轉(zhuǎn)化的條件是電壓1. 5kV,電容25 μ F,電阻200 Ω，電擊時(shí)間4 5ms。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟(4)中，篩選平板為含遺傳霉素G418的抗生素平板。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟(5)中，工程菌發(fā)酵的條件為30°C，200 250r/min 培養(yǎng) 2 3 天。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟(5)中，vgb表達(dá)產(chǎn)物檢測的方法為C0-差示光譜法，具體步驟如下(1)取細(xì)菌培養(yǎng)液6ml離心，沉淀用生理鹽水洗滌一次后重懸于3ml緩沖液中，超聲破碎，所述緩沖液為含有100mmol/L Tris-HCI、50mmol/LNaCI的水溶液，pH7. 5 ；(2)40C、10000r/min 離心 15min,留上清；(3)上清用3ml步驟(1)所述的緩沖液稀釋一倍，并加入連二亞硫酸鈉至終濃度 2. 5mg/ml ；(4)將經(jīng)步驟(1) C3)處理過的樣品分成兩份，一份通C0，3min,1個(gè)氣泡/s ；(5)用紫外可見光分光光度計(jì)在400 500nm范圍內(nèi)分別對兩份樣品掃描，以未經(jīng)CO處理的樣品作對照，所得的曲線即為CO-差示光譜圖，通過CO-差示光譜圖判斷表達(dá)產(chǎn)物中是否含有透明顫菌血紅蛋白。
10.權(quán)利要求1所述的產(chǎn)谷胱甘肽的酵母工程菌在生產(chǎn)谷胱甘肽中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株產(chǎn)谷胱甘肽的酵母工程菌，菌株名為101-V，分類命名為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2012年02月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.5758。本發(fā)明還公開了一種構(gòu)建高產(chǎn)谷胱甘肽工程菌株的方法，是將透明顫菌血紅蛋白基因vgb整合到產(chǎn)谷胱甘肽的酵母基因組中，篩選得到能夠表達(dá)透明顫菌血紅蛋白基因的重組酵母，如此，從分子水平上提高了血紅蛋白基因重組菌對氧氣的利用能力，解決了微生物發(fā)酵過程中的氧氣供求矛盾，降低了氧氣及能量的消耗，并同時(shí)提高了谷胱甘肽的產(chǎn)量。
文檔編號C12R1/865GK102559529SQ20121004235
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月23日
發(fā)明者朱希強(qiáng), 王鳳山, 董坤, 陳曉燕 申請人:山東大學(xué)