一種高效表達(dá)中華絨螯蟹甲殼素的釀酒酵母工程菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種高效表達(dá)中華絨馨蟹甲殼素的釀酒酵母工程菌，屬于生物技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是我國經(jīng)濟(jì)出口創(chuàng)匯的重要產(chǎn)業(yè)之一，漁業(yè)在我國已成為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的 增長點(diǎn)。近年來甲殼類動物病害日趨嚴(yán)重，給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 甲殼類動物缺乏后天獲得的特異性免疫功能，但是它們有比較完善的先天性非特 異性免疫系統(tǒng)，能夠迅速識別和有效清除入侵的微生物。甲殼類動物的非特異性免疫機(jī)制 包括甲殼和粘液的屏障作用、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞隧作用W及非特異性體液分子。甲殼動物 的抗菌膚，是具有較高抗菌活性，水溶性好，熱穩(wěn)定的免疫效應(yīng)因子，能夠直接殺死或者清 除病原微生物，是甲殼動物先天免疫系統(tǒng)中的重要組成部分。多數(shù)抗菌膚具有廣譜抗菌作 用，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有不同程度的殺菌或者抑菌作用。甲殼素（化UStin) 是郵蟹中研究較多的抗菌膚。
[0004] 目前，中華絨馨蟹巧riocheir sinensis)甲殼素化UStin基因全長已被克隆，也 有研究學(xué)者將中華絨馨蟹化UStin基因在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)，但大腸桿菌表達(dá)體系 常會導(dǎo)致蛋白聚集形成不溶的無活性的包涵體，復(fù)性過程繁瑣，產(chǎn)出率低等因素大大提高 工業(yè)生產(chǎn)的成本。而利用釀酒酵母對中華絨馨蟹甲殼素化UStin進(jìn)行真核表達(dá)及蛋白功能 研究至今仍未有報(bào)道。眾所周知，基因的異源表達(dá)受到宿主、載體、啟動元件等多種因素的 影響。因此，如何實(shí)現(xiàn)甲殼類動物來源的化UStin的異源表達(dá)、活性表達(dá)、高效表達(dá)是目前 亟需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]為了克服上述問題，本發(fā)明利用釀酒酵母構(gòu)建真核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了中華絨馨蟹 甲殼素化UStin進(jìn)行高效活性表達(dá)。本發(fā)明構(gòu)建的釀酒酵母真核表達(dá)工程菌株必將在水產(chǎn) 養(yǎng)殖上發(fā)揮重要作用。
[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種高效表達(dá)中華絨馨蟹抗甲殼素的釀酒酵母工程 菌，所述基因工程菌的構(gòu)建方法是將中華絨馨蟹甲殼素Es化UStin(Es化UStin代表來源于 中華絨馨蟹的化UStin)的CDNA克隆至表達(dá)質(zhì)粒PHAC181上得到測序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒 pHAClSl-Es化UStin,然后設(shè)計(jì)同源重組引物，利用同源重組技術(shù)將目的基因Es化UStin整 合至釀酒酵母宿主菌株的GALl啟動子下游。該工程菌在半乳糖的誘導(dǎo)下，可高效表達(dá)目的 蛋白。
[0007] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述EsCrustin的cDNA的CDS(codingsequence) 區(qū)域翻譯后的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0008] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述Es化UStin的cDNA的CDS區(qū)域的核巧酸序列如 沈QIDNO. 1所示。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)質(zhì)粒pHAClSl是在商業(yè)化質(zhì)粒YCplaclSl 的SphI和EcoRV位點(diǎn)插入3個組氨酸標(biāo)簽得到的，詳見文獻(xiàn)：Analysesoftheeffectsof 民ck2pmutantsonPbs2p^-inducedtoxicityinSaccharomycescervisiaeidentifya MAPkinasedockingmotif，andunexpectedfunctionalinactivationduetoacidic substitutionofT379,MolGenGenomics, 2004, 271:208 - 219.
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述宿主菌株為釀酒酵母GALl-ScRCHl，是將釀酒酵 母BY4741(Sc04153268_sl)菌株里的ScRCHl基因的啟動子替換成GALl啟動子。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述釀酒酵母工程菌是按照如下方法構(gòu)建得到 的：（1)W中華絨馨蟹組織的CDNA為模板PCR擴(kuò)增或者直接化學(xué)合成，得到核巧酸序列 如沈QIDN0. 1所示的Es化UStin基因片段；（2)將Es化UStin基因片段克隆到表達(dá)質(zhì) 粒pHAClSl上，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pHAC181-Es化UStin; (3)設(shè)計(jì)同源重組引物，對質(zhì)粒 pHAClSl-Es化UStin進(jìn)行擴(kuò)增，得到含有Es化UStin基因的核巧酸片段，使用同源重組的方 法，將該核巧酸片段整合至釀酒酵母菌株中GALl啟動子下游，并使用引物進(jìn)行PCR檢測，有 EsCrustin基因片段擴(kuò)增出的轉(zhuǎn)化子即為同源重組成功的菌株Gal-pHAC181-EsCrustin。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟（3)，還包括將菌株在YPG培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培 養(yǎng)化后，提取菌株蛋白，用于做WESTERNBL0T檢測，目的蛋白表達(dá)的菌株則為構(gòu)建成功的酵 母工程菌。
[0013] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種高效表達(dá)中華絨馨蟹甲殼素的方法，所述方法是 使用所述釀酒酵母工程菌為生產(chǎn)菌株。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將釀酒酵母工程菌活化后，接種于YPG 培養(yǎng)基中，在半乳糖的誘導(dǎo)下培養(yǎng)化；所述YPG培養(yǎng)基含有D-半乳糖20g/l、蛋白腺20g/ L酵母提取物lOg/L。
[0015] 本發(fā)明還要求保護(hù)所述釀酒酵母工程菌生產(chǎn)得到的甲殼素，W及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖、 水產(chǎn)動物免疫及免疫飼料添加劑方面的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的有益效果：
[0017] (1)本發(fā)明構(gòu)建的釀酒酵母工程菌，可W實(shí)現(xiàn)中華絨馨蟹重要免疫因子 Es化UStin進(jìn)行高效表達(dá)、活性表達(dá)；本發(fā)明的釀酒酵母工程菌得到的Es化UStin具有活 力，誘導(dǎo)培養(yǎng)化后每血發(fā)酵液可得蛋白0. 06mg。
[0018] (2)本發(fā)明的工程菌為釀酒酵母工程菌，表達(dá)真核來源的Es化ustin，可W分泌經(jīng) 正確折疊和加工的蛋白質(zhì)；而且釀酒酵母具有在簡單培養(yǎng)基中快速生長等優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明采 用的宿主菌釀酒酵母，是食品安全菌株，可W直接添加到飼料中。
[0019] (3)本發(fā)明WPHAC181為載體、GALl-ScRCHl為宿主構(gòu)建釀酒酵母工程菌，實(shí)現(xiàn)了 中華絨馨蟹重要免疫因子Es化UStin的高效表達(dá)，W期增強(qiáng)甲殼類動物對各種主要疾病和 環(huán)境變化的抵抗力，有效促進(jìn)其健康生長。目前新型飼料蛋白源與飼料添加劑的研制與開 發(fā)己成為促進(jìn)現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)，本發(fā)明的酵母工程菌不僅可W更進(jìn)一 步對甲殼類動物重要免疫基因的蛋白功能進(jìn)行研究，也將為開發(fā)新型免疫增強(qiáng)型飼料添加 劑提供科學(xué)依據(jù)及新方法。
【附圖說明】
[0020] 圖I:中華絨馨蟹甲殼素EsCrustincDNA擴(kuò)增條帶（33化p);
[0021] 圖2:將中華絨馨蟹甲殼素Es化UStincDNA克隆至載體PHAC181上時，菌落PCR驗(yàn) 證陽性轉(zhuǎn)化子化inel，4, 5, 8, 9, 10, 12, 13, 16, 18, 21，22, 23, 24為正確的轉(zhuǎn)化子）； 陽02引 圖3 :將中華絨馨蟹甲殼素EsCrustinCDNA克隆至載體PHAC181上時，陽性轉(zhuǎn)化 子的酶切驗(yàn)證化inel，2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11，12, 13為正確的轉(zhuǎn)化子）；
[0023] 圖4:高保真酶PrimeSTARG)(L酶對重組質(zhì)粒pHAClSl-EsCrustin進(jìn)行擴(kuò)增 (470化P);
[0024] 圖5 :檢測引物檢測pHAClSl-Es化UStin與含GALl啟動子的菌株同源重組（同源 重組成功的條帶為633bp，a圖中Line3,b圖中Line10為正確的轉(zhuǎn)化子）； 陽0巧]圖6 :肥STERNBL0T檢測到Gal-pHAC181-EsCrustin蛋白表達(dá)，目的蛋白為22邸。
【具體實(shí)施方式】
[00%] 在本發(fā)明中，首先采用基因克隆技術(shù)，具體為：將中華絨馨蟹RNA提取后，用反轉(zhuǎn) 錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用高保真PCR酶將目的基因片段Es化UStin進(jìn)行擴(kuò) 增。擴(kuò)增得到的基因片段與載體PHAC181連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞transTl中，涂布 于LA平板上37°C過夜培養(yǎng)。LA平板上得到的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切驗(yàn)證及測序驗(yàn)證。其 次，利用同源重組技術(shù)將帶有目的基因Es化UStin的質(zhì)粒PHAC181整合至釀酒酵母菌株 GALl-ScRCHl菌株中GALl啟動子下游，整合成功的菌株在YPG培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)化后，提 取蛋白，用于WESTERNBL0T檢測。目的蛋白表達(dá)成功的菌株則為構(gòu)建成功的酵母工程菌。
[0027]LA培養(yǎng)基的組成：蛋白腺lOg/l、酵母提取物5g/L、化CllOg/l、瓊脂12g/l，調(diào)PH 為 7. 0,Amp抗生素lOOmg/ml(120°C，20min)。
[0028]SD-Leu培養(yǎng)基的組成：含有酵母氮源（無AA)I. 7g/l、硫酸錠5g/L、葡萄糖20g/ LlOxAAmix(-ura，-leu, -his)lOOml'lOOxUralOml'lOOxHis10ml，瓊脂 20g/L(120°C， 20min)。
[0029]YPG培養(yǎng)基的組成：D-半乳糖20g/l、蛋白腺20g/l、酵母提取物10g/L(115°C， 20min)。
[0030] 實(shí)施例I:釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建（基因克?。?br>[0031] 通過構(gòu)建高表達(dá)質(zhì)粒pHAClSl-Es化UStin,具體方法為提取中華絨馨蟹組織RNA， 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用高保真酶將目的基因片段Es化UStin進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，Es化UStin基因片段（CDS區(qū)域，不包含終止密碼子，共33化P)，然后將運(yùn)個片段克隆到 高表達(dá)質(zhì)粒PHAC181多克隆位點(diǎn)上，最后對正確的重組子進(jìn)行DNA測序，驗(yàn)證序列沒有發(fā)生 突變，得到重組高表達(dá)質(zhì)粒pHAClSl-EsCrustin。 陽0巧實(shí)施例2 :釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建（同源重組）
[0033] 根據(jù)構(gòu)建好的重組高表達(dá)質(zhì)粒pHAClSl-Es化UStin設(shè)計(jì)同源重組引物，利用高保 真PrimeSTARG)(L酶對質(zhì)粒pHAClSl-Es化UStin進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增成功的長片段整合至釀酒 酵母菌株中GALl啟動子下游。
[0034] 同源重組引物為F1、R1，序列如沈QIDN0. 3、SEQIDN0. 4所示：

[0037] 基因同源重組（整合）的具體步驟為：
[0038] 1.挑活化的GALl-ScRCHl菌株單菌落，接種到3mlYPD培養(yǎng)基，30°C22化pm培養(yǎng) 過夜。
[0039] 2.取300ul過夜培養(yǎng)物接種到4. 7ml2*YPD中，30°C培養(yǎng)4~化（達(dá)到0D600 = 0. 6-1.0