專利名稱：副溶血性弧菌多重定量pcr檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種副溶血性弧菌毒素基因多重定量PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)是一種革蘭陰性嗜鹽性弧菌,是弧菌屬內(nèi)比較重要的致病菌之一，主要存在于近海岸的魚(yú)貝類(lèi)等海產(chǎn)品、海水及其沉積物中， 是沿海地區(qū)夏、秋季食物中毒和急性腹瀉的主要病原菌，可引起急性胃腸道癥狀。目前副溶血性弧菌的發(fā)病率已居各種微生物食源性疾病之首，并明顯高于位居第二的沙門(mén)菌食物中毒，尤其在沿海地區(qū)的發(fā)病率更是居高不下。據(jù)報(bào)道，副溶血性弧菌菌體攜帶多種毒素基因，這些基因表達(dá)的毒素蛋白是造成食物中毒的主要原因。傳統(tǒng)的副溶血性弧菌的鑒定方法主要包括分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、血清分型等，因其操作復(fù)雜、周期長(zhǎng)，已不能滿足目前實(shí)際工作(傳染病現(xiàn)場(chǎng)診斷、流行趨勢(shì)分析等)的需要，而且對(duì)于毒素的診斷多使用經(jīng)典細(xì)胞學(xué)手段，無(wú)法實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化判定。因此建立一種快速、敏感、特異的檢測(cè)和鑒定相關(guān)毒素的方法對(duì)預(yù)防和控制副溶血性弧菌食物中毒及其早期診斷具有十分重要的意義。副溶血弧菌的tdh (耐熱直接溶血毒素)、tlh (不耐熱溶血毒素)、toxR(毒素表達(dá)調(diào)控蛋白基因)和 trh (耐熱直接相關(guān)溶血毒素)是目前報(bào)道該菌攜帶的主要毒素基因，與海產(chǎn)品食物中毒具有密切關(guān)系，準(zhǔn)確和快速的明確病原是有效預(yù)防傳染病大面積發(fā)生和傳播的前提和基礎(chǔ)。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR是近幾年發(fā)展起來(lái)的新型檢測(cè)技術(shù)，具有快速、準(zhǔn)確、可定量等優(yōu)勢(shì)，其中TaqMan探針、TaqMan-MGB探針、復(fù)合探針、染料及分子信標(biāo)等方法目前已成功應(yīng)用到病原菌分子診斷領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種副溶血性弧菌四種相關(guān)毒素基因的多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，能夠?qū)Ω比苎曰【姆N相關(guān)毒素基因進(jìn)行準(zhǔn)確、有效地甄別。本發(fā)明采用的技術(shù)方案收是一種副溶血性弧菌毒素基因多重定量PCR檢測(cè)試劑盒，主要包括特異性引物和探針以及PCR反應(yīng)試劑，所述特異性引物和探針由副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因(tdh)、 不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達(dá)調(diào)控蛋白基因(toxR)和耐熱相關(guān)溶血素基因(trh)的特異性引物和探針組成tdh 上游引物5' -TCTGCTTTTGAGCTTCCATCTGT-3'；tdh 下游引物5' -TGACCGGAGCTTGGGTATTAA-3'；tdh熒光探針5' -FAM-CCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATT-BHQ1-3'；tlh 上游引物5' -CCAGAAGAGCACGGTTTC-3'；tlh 下游引物5' -GGTGTACATGTAATCGACAGACGAT-3'；tlh熒光探針
5' -VIC-CGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCT-BHQ1-3'；
toxR 上游引物5' -TTCCGTCAGATTGGTGAGTATCAG-3'；
toxR 下游引物5' -TGCTCAATAGAAGGCAACCAGTT-3'；
toxR突光探針
5' -R0X-TGATGACACCTGTAAATCACCCGCAAATC-BHQ2-3'；
trh 上游引物5' -TGCTATTGGCTTCGATATTTTCAGTA-3'；
trh 下游引物5' -CGAACCTGGAGAAGGAAAAGGT-3'；
trh突光探針
5' -CY5-CTAAATCATTCGCGATTGACCTGCCATC-BHQ2-3'；
其中FAM、VIC、ROX和CY5為不同波長(zhǎng)的熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQl和BHQ2為熒光淬滅基團(tuán)。
本發(fā)明的關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)，試劑盒中其他組成，可按本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選
擇。PCR反應(yīng)試劑包括PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶等，其中PCR緩沖液可采用市購(gòu)商品，也可自行配制，例如將Tris-HCl、KC1、MgCl2等按比例混合進(jìn)行配制， 進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，將PCR反應(yīng)試劑和擴(kuò)增引物和探針混合，再加入待測(cè)樣品或?qū)φ掌?，即可進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)。為達(dá)到定量檢測(cè)的目的，所述試劑盒還可包括副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因 (tdh)、不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達(dá)調(diào)控蛋白基因(toxR)和耐熱相關(guān)溶血素基因 (trh)的標(biāo)準(zhǔn)品,所述標(biāo)準(zhǔn)品序列如下tdh 標(biāo)準(zhǔn)品tctgcttttga gcttccatct gtcccttttc ctgcccccg gttctgatga gatattgttt gttgttcgag atacaacttt taatacccaa gctccggtca ；tlh標(biāo)準(zhǔn)品 ccagaagagc acggtttcgt gaacgcgagt gatccttgtt tggacatcaa ccgctcatcg tctgtcgatt acatgtacacc ；toxR 標(biāo)準(zhǔn) 品ttccgt cagattggtg agtatcagaa cgtaccagtg atgacacctg taaatcaccc gcaaatcaac aactggttgc cttctattga gca ；trh 標(biāo)準(zhǔn) 品tgctattg gcttcgatat tttcagtatc taaatcattc gcgattgacc taccatccat accttttcct tctccaggtt eg。本發(fā)明還涉及一種副溶血性弧菌毒素基因多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，所述方法包括(I)提取待測(cè)樣品DNA ；(2)以待測(cè)樣品DNA為模板，加入副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因(tdh)、不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達(dá)調(diào)控蛋白基因(toxR)和耐熱相關(guān)溶血素基因(trh)的特異性引物和探針，PCR緩沖液，脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶配制PCR反應(yīng)液，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以非靶細(xì)菌為陰性對(duì)照于相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；若待測(cè)樣品熒光增長(zhǎng)曲線超過(guò)閾值線，并呈良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則判斷為陽(yáng)性；所述特異性引物和探針如前所述。為達(dá)到定量檢測(cè)的效果，所述方法可同時(shí)以副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因 (tdh)、不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達(dá)調(diào)控蛋白基因(toxR)和耐熱相關(guān)溶血素基因 (trh)標(biāo)準(zhǔn)品的梯度濃度的DNA溶液進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，分別根據(jù)拷貝濃度的對(duì)數(shù)值與各標(biāo)準(zhǔn)品Ct值的關(guān)系繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得樣品DNA的Ct值后，對(duì)照相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品 DNA中相應(yīng)基因的拷貝濃度；所述標(biāo)準(zhǔn)品序列如前所述。所述PCR反應(yīng)條件如下95°C預(yù)變性5分鐘，95°C 15秒、60°C 45秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)
擴(kuò)增，最后置4°C。熒光采集在每個(gè)循環(huán)的退火溫度時(shí)進(jìn)行。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明針對(duì)副溶血弧菌毒素基因提供了一種快速、敏感、特異的多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，為及時(shí)控制副溶血性弧菌食物中毒及其早期診斷提供了基礎(chǔ)。


圖I 為標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果;1 7 分別為 30ng、3ng、0. 3ng、30pg、3pg、0. 3pg、30fg/ uL標(biāo)準(zhǔn)品；圖2為四種毒素基因?qū)?yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線'Y :對(duì)應(yīng)的Ct值；X :基因的質(zhì)量數(shù)。圖3為陽(yáng)性菌株DNA檢測(cè)結(jié)果；1為tdh基因，2為toxR基因，3為tlh基因，4為 trh基因。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例I :標(biāo)準(zhǔn)品的犾得I、材料pGEM-T-Easy克隆系統(tǒng)、PCR相關(guān)試劑及Taq DNA聚合酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司， 377 型測(cè)序儀(ABI 公司)、Bio-Rad icycler PCR 儀(Bio-Rad 公司)、ABI7500 fast 定量 PCR儀(ABI公司)。2、引物及探針設(shè)計(jì)與合成以副溶血性弧菌tdh(耐熱直接溶血素)基因(Genbank注冊(cè)號(hào)為⑶971653)、 tlh (不耐熱溶血素)基因(Genbank注冊(cè)號(hào)為AY829372)、toxR(毒素表達(dá)調(diào)控蛋白)基因(Genbank注冊(cè)號(hào)為JN188468)和trh(耐熱相關(guān)溶血素)基因(Genbank注冊(cè)號(hào)為 DQ359749)為模板，使用Primer Express TM(V3. 0，美國(guó)ABI公司)軟件分析TaqMan引物和探針位點(diǎn)，從中選擇最佳組合。由上海輝睿生物科技有限公司進(jìn)行引物和探針的合成與純化。3、陽(yáng)性參考品的制備以副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 17802)做為模板，用DNA提取試劑提取基因組DNA， 用分光光度計(jì)測(cè)定濃度，取I. O μ L (50ng/ μ L)做PCR反應(yīng)模板，分別用上述的上下游引物在Bio-Rad icycler PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)液組成如下2 x PCR bufferlO.OfiL
上游引物(10pM)l^iL
下游引物(10pM)l^iL
DNA 聚合酶(5U/pL )0.2^iL
dNTPs (各 250mM)1.6^iL (dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物質(zhì)的量比 1: 1: 1: 1)
基因組 DNA ( 50ng/^iL )1 ^iL去離子水補(bǔ)足至20 U L。PCR條件為94°C 5分鐘變性，94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 30秒進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò) 增，最后于72°C延伸5分鐘后置4°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后即用克隆系統(tǒng)插入pGEM-T-Easy克隆載 體，并將陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。tdh (耐熱直接溶血素)、tlh(不耐熱溶血素)、toxR(毒素 表達(dá)調(diào)控蛋白)和trh(耐熱相關(guān)溶血素)基因?qū)?yīng)的片段長(zhǎng)度分別為100bp、81bp、89bp 和80bp片段，即為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定濃度并換算成質(zhì)量/體積，分別命名為質(zhì)粒tdh、tlh、toxR 和 trho4、結(jié)果經(jīng)測(cè)序，上述設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)品完全與預(yù)期相符，回收的標(biāo)準(zhǔn)品片段序列如下tdh (耐熱直接溶血素)基因標(biāo)準(zhǔn)品序列tctgcttttga gcttccatct gtcccttttc ctgcccccg gttctgatga gatattgttt gttgttcgag atacaacttt taatacccaa gctccggtca。tlh(不耐熱溶血素)基因標(biāo)準(zhǔn)品序列 ccagaagagc acggtttcgt gaacgcgagt gatccttgtt tggacatcaa ccgctcatcg tctgtcgatt acatgtacacc。toxR(毒素表達(dá)調(diào)控蛋白)基因標(biāo)準(zhǔn)品序列ttccgt cagattggtg agtatcagaa cgtaccagtg atgacacctg taaatcaccc gcaaatcaac aactggttgc cttctattga gca。trh(耐熱相關(guān)溶血素)基因標(biāo)準(zhǔn)品序列tgctattg gcttcgatat tttcagtatc taaatcattc gcgattgacc taccatccat accttttcct tctccaggtt eg。實(shí)施例2 :多重?zé)晒舛縋CR法檢測(cè)副溶血性弧菌四種相關(guān)毒素基因方法的建立1、質(zhì)粒DNA及其他細(xì)菌DNA提取采用基因組DNA提取試劑提取細(xì)菌基因組DNA，采用質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取陽(yáng) 性質(zhì)粒DNA，分別取1. Oil L(50ng/ii L)做模板，用檢測(cè)用上下游引物在ABI7500 fast定量 PCR儀(ABI公司)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)液組成如下IOx PCR buffer5 · O pL
tdh 上游引物(ΙΟμΜ)l.OpL
tdh 下游引物(ΙΟμΜ)2ΛμL
tlh 上游引物(ΙΟμΜ)2ΛμL
tlh 下游引物(ΙΟμΜ)2ΛμL
toxR 上游引物(ΙΟμΜ)2·4μ!ν
toxR 下游引物(ΙΟμΜ)2ΛμΙ
trh 上游引物(ΙΟμΜ)2ΛμL
trh 下游引物(ΙΟμΜ)2ΛμL
tdh 熒光探針(ΙΟμΜ)\ΛμL
tlh 熒光探針(ΙΟμΜ)\ΛμL
toxR 焚;光探針(ΙΟμΜ)\ΛμL
trh 熒光探針(ΙΟμΜ)\ΛμL
DNA 聚合酶(5U/pL )0.5pL
dNTPs (各 250mM)4·0μΙ^
(dATP, dTTP, dCTP、dGTP 物質(zhì)的量比 I: I: I: I)
質(zhì)粒 DNA (tdh、tlh、toxR、trh 各 50ng/pL)或模板 DNA去離子水補(bǔ)足至50 μ LoPCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5分鐘，95°C 15秒、60°C 45秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增， 最后置4°C，熒光采集在每個(gè)循環(huán)的退火溫度時(shí)進(jìn)行。以非靶細(xì)菌志賀菌(ACCC04121)為陰性對(duì)照于相同條件下進(jìn)行PCR檢測(cè)，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；若待測(cè)模板熒光增長(zhǎng)曲線超過(guò)閾值線，并呈良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則判斷為陽(yáng)性。同時(shí)在相同條件下以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)DNA的測(cè)定結(jié)果經(jīng)儀器處理根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出檢測(cè)副溶血性弧菌含有 tdh (耐熱直接溶血素)、tlh (不耐熱溶血素)、toxR(毒素表達(dá)調(diào)控蛋白)和trh (耐熱相關(guān)溶血素)基因的數(shù)量。以腸出沙門(mén)氏菌(CICC21490)、血性大腸桿菌(EHEC)0157 :H7 (ATCC43889)，致病性大腸桿菌(EPEC) (ATCC 43887)，腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC) (ATCC35401)，腸侵襲性大腸桿菌(EIEC) (ATCC 43893)，創(chuàng)傷弧菌(CICC 10383)等按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，說(shuō)明本發(fā)明方法特異性好。2.檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線參見(jiàn)圖2，其中tdh基因標(biāo)準(zhǔn)方程(FAM) Y = -3. 5782Χ lgX+38. 406, R2 = O. 9695 ；toxR 基因標(biāo)準(zhǔn)方程(ROX) Y = -3. 9223XlgX+39. 3586, R2 = O. 9819 ；tlh 基因標(biāo)準(zhǔn)方程 (VIC) Y = -3. 6574XlgX+41. 3161, R2 = O. 9889 ；trh 基因標(biāo)準(zhǔn)方程(CY5) Y =-3. 7139XlgX+40. 0543，R2 = 0. 9987。陽(yáng)性菌株DNA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3 ;1為tdh基因，Ct值為26. 05，基因濃度為2. 84pg/ μ L ;2為toxR基因，Ct值為28. 30，基因濃度為O. 67pg/μ L ；3為tlh基因，Ct值為29. 62， 基因濃度為I. 59pg/ μ L ；4為trh基因，Ct值為29. 61，基因濃度為O. 65pg/y L。
權(quán)利要求
1.一種副溶血性弧菌毒素基因多重定量PCR檢測(cè)試劑盒，主要包括特異性引物和探針以及PCR反應(yīng)試劑，所述特異性引物和探針由副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因(tdh)、不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達(dá)調(diào)控蛋白基因(toxR)和耐熱相關(guān)溶血素基因(trh)的特異性引物和探針組成tdh 上游引物5' -TCTGCTTTTGAGCTTCCATCTGT-3'； tdh 下游引物5' -TGACCGGAGCTTGGGTATTAA-3'； tdh突光探針5' -FAM-CCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATT-BHQ1-3'； tlh 上游引物5' -CCAGAAGAGCACGGTTTC-3'； tIh 下游引物5' -GGTGTACATGTAATCGACAGACGAT-3'； tlh突光探針5' -VIC-CGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCT-BHQ1-3'； toxR 上游引物5' -TTCCGTCAGATTGGTGAGTATCAG-3'； toxR 下游引物5' -TGCTCAATAGAAGGCAACCAGTT-3'； toxR突光探針5' -R0X-TGATGACACCTGTAAATCACCCGCAAATC-BHQ2-3'； trh 上游引物5' -TGCTATTGGCTTCGATATTTTCAGTA-3'； trh 下游引物5' -CGAACCTGGAGAAGGAAAAGGT-3'； trh突光探針5' -CY5-CTAAATCATTCGCGATTGACCTGCCATC-BHQ2-3'；其中FAM、VIC、R0X和CY5為不同波長(zhǎng)的熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQl和BHQ2為熒光淬滅基團(tuán)。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因(tdh)、不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達(dá)調(diào)控蛋白基因(toxR)和耐熱相關(guān)溶血素基因(trh)的標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品序列如下tdh 標(biāo)準(zhǔn) 品tctgcttttga gcttccatct gtcccttttc ctgcccccg gttctgatga gatattgttt gttgttcgag atacaacttt taatacccaa gctccggtca ；tlh 標(biāo)準(zhǔn) 品ccagaagagc acggtttcgt gaacgcgagt gatccttgtt tggacatcaa ccgctcatcg tctgtcgatt acatgtacacc ；toxR 標(biāo)準(zhǔn)品ttccgt cagattggtg agtatcagaa cgtaccagtg atgacacctg taaatcaccc gcaaatcaac aactggttgc cttctattga gca ；trh標(biāo)準(zhǔn)品tgctattg gcttcgatat tttcagtatc taaatcattc gcgattgacc taccatccat accttttcct tctccaggtt eg。
3.一種副溶血性弧菌毒素基因多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，所述方法包括(1)提取待測(cè)樣品DNA；(2)以待測(cè)樣品DNA為模板，加入副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因(tdh)、不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達(dá)調(diào)控蛋白基因(toxR)和耐熱相關(guān)溶血素基因(trh)的特異性引物和探針，PCR緩沖液，脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶配制PCR反應(yīng)液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以非靶細(xì)菌為陰性對(duì)照于相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；若待測(cè)樣品熒光增長(zhǎng)曲線超過(guò)閾值線，并呈良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則判斷為陽(yáng)性；所述特異性引物和探針如下tdh 上游引物5' -TCTGCTTTTGAGCTTCCATCTGT-3'； tdh 下游引物5' -TGACCGGAGCTTGGGTATTAA-3'； tdh突光探針5' -FAM-CCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATT-BHQ1-3'； tIh 上游引物5' -CCAGAAGAGCACGGTTTC-3'； tIh 下游引物5' -GGTGTACATGTAATCGACAGACGAT-3'； tlh突光探針5' -VIC-CGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCT-BHQ1-3'； toxR 上游引物5' -TTCCGTCAGATTGGTGAGTATCAG-3'； toxR 下游引物5' -TGCTCAATAGAAGGCAACCAGTT-3'； toxR突光探針5' -R0X-TGATGACACCTGTAAATCACCCGCAAATC-BHQ2-3'； trh 上游引物5' -TGCTATTGGCTTCGATATTTTCAGTA-3'； trh 下游引物5' -CGAACCTGGAGAAGGAAAAGGT-3'； trh突光探針5' -CY5-CTAAATCATTCGCGATTGACCTGCCATC-BHQ2-3'；其中FAM、VIC、R0X和CY5為不同波長(zhǎng)的熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQl和BHQ2為熒光淬滅基團(tuán)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同時(shí)以副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因(tdh)、不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達(dá)調(diào)控蛋白基因(toxR)和耐熱相關(guān)溶血素基因(trh)標(biāo)準(zhǔn)品的梯度濃度的DNA溶液進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，分別根據(jù)拷貝濃度的對(duì)數(shù)值與各標(biāo)準(zhǔn)品Ct值的關(guān)系繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得樣品DNA的Ct值后，對(duì)照相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品DNA中相應(yīng)基因的拷貝濃度；所述標(biāo)準(zhǔn)品序列如下tdh 標(biāo)準(zhǔn) 品tctgcttttga gcttccatct gtcccttttc ctgcccccg gttctgatga gatattgttt gttgttcgag atacaacttt taatacccaa gctccggtca ；tlh 標(biāo)準(zhǔn) 品ccagaagagc acggtttcgt gaacgcgagt gatccttgtt tggacatcaa ccgctcatcg tctgtcgatt acatgtacacc ；toxR 標(biāo)準(zhǔn)品ttccgt cagattggtg agtatcagaa cgtaccagtg atgacacctg taaatcaccc gcaaatcaac aactggttgc cttctattga gca ；trh標(biāo)準(zhǔn)品tgctattg gcttcgatat tttcagtatc taaatcattc gcgattgacc taccatccat accttttcct tctccaggtt eg。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)條件如下95°C預(yù)變性5分鐘，95°C 15秒、60°C 45秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，最后置4°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種副溶血性弧菌毒素基因多重定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。所述試劑盒主要包括特異性引物和探針以及PCR反應(yīng)試劑，所述特異性引物和探針由副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因(tdh)、不耐熱溶血素基因(tlh)、毒素表達(dá)調(diào)控蛋白基因(toxR)和耐熱相關(guān)溶血素基因(trh)的特異性引物和探針組成。本發(fā)明針對(duì)副溶血弧菌毒素基因提供了一種快速、敏感、特異的多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，為及時(shí)控制副溶血性弧菌食物中毒及其早期診斷提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK102605055SQ20121004206
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月23日
發(fā)明者葉菊蓮, 張政, 王復(fù)甦, 羅蕓, 金大智 申請(qǐng)人:浙江省疾病預(yù)防控制中心