專利名稱：一種煙草黑脛病病菌液固復(fù)合體系培養(yǎng)方法及培養(yǎng)物應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煙草黑脛病病菌液固復(fù)合體系培養(yǎng)方法及培養(yǎng)物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
煙草黑脛病(tobacco black shank)是世界煙草生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害之一， 特別是在溫帶、亞熱帶和熱帶發(fā)生較重，也是我國(guó)煙草生產(chǎn)的主要病害類型。目前，在實(shí)驗(yàn)室、溫室有采用平板菌絲塊、攪碎菌絲液、游動(dòng)孢子液等制備煙草黑脛病病菌接種體的方法。這幾類方法制備的接種體操作復(fù)雜、技術(shù)難度大，一般不適用于大田人工接種。在田間煙草黑脛病病菌接種體應(yīng)用較多的是谷物培養(yǎng)接種體，主要供煙草種質(zhì)資源抗性鑒定或藥劑篩選時(shí)人工接種病原物用。這種谷物培養(yǎng)是將平板上的菌絲塊直接接種到谷物培養(yǎng)基表面，讓菌絲由內(nèi)向四周、由上向下生長(zhǎng)、蔓延。由于是單點(diǎn)或幾點(diǎn)表層接種， 菌絲通常需要45飛0天才可能長(zhǎng)滿整個(gè)基質(zhì)，周期較長(zhǎng)；培養(yǎng)時(shí)上下層菌絲生長(zhǎng)不同步，導(dǎo)致上部菌絲過度老熟、而下部菌絲過于幼嫩，固體培養(yǎng)物不均一，影響病菌的侵染，造成極大人為誤差；而且培養(yǎng)時(shí)病菌菌絲不能很快占領(lǐng)基質(zhì)而為其他可能污染的雜菌提供了生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致病菌培養(yǎng)的雜菌污染，培養(yǎng)病菌失敗。此外，谷物培養(yǎng)接種體的谷粒過大，大量過剩的營(yíng)養(yǎng)物為其潛在的拮抗微生物提供了豐富的養(yǎng)料，致使拮抗微生物迅速繁殖，而病菌接種體的有效數(shù)量急劇下降，不能形成有效浸染。因此，如何有效地固體培養(yǎng)煙草黑脛病病菌是煙草育種、植保工作中值得探索的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制， 基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變更或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的第一目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的，包括病菌分離、平板培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)，具體包括以下步驟
A、病菌分離，從發(fā)病田塊中采集病株，經(jīng)過分離、純化、致病力測(cè)定，獲得病菌，將菌種采用菌絲塊水浸法置于10°C條件下恒溫保存，備用；
B、平板培養(yǎng)，將病菌接種于培養(yǎng)基平板上，于M 30°C溫度下培養(yǎng)5 7天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養(yǎng)物，用作液體培養(yǎng)菌種；
C、液體培養(yǎng)，將B步驟得到的平板菌絲接種于培養(yǎng)液中，于M 30°C溫度下，13(Tl50r/ min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)5 7天，培養(yǎng)得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團(tuán)，鏡檢可發(fā)現(xiàn)游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個(gè)以上；
D、固體培養(yǎng)，將C步驟得到的液體菌絲接種于固體培養(yǎng)基，2Γ30 培養(yǎng)8 12天，培養(yǎng)得到的固體培養(yǎng)物整個(gè)基質(zhì)布滿白色菌絲，菌絲經(jīng)過液體浸泡、低溫誘導(dǎo)、室溫釋放孢子， 鏡檢可見游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個(gè)以上。本發(fā)明的另一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，培養(yǎng)物用于煙草黑脛病的人工接種物，或者用于制備帶煙草黑脛病病菌病土的添加物。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn)及效果
(1)培養(yǎng)質(zhì)量穩(wěn)定。本發(fā)明通過增加液體培養(yǎng)步驟來增大固體培養(yǎng)的接種量，能使病菌迅速占領(lǐng)基質(zhì)，達(dá)到同步、快速生長(zhǎng)，生長(zhǎng)周期短，比常規(guī)縮短培養(yǎng)時(shí)間1(Γ15天，在嚴(yán)格無菌操作的前提下，可杜絕雜菌污染；通過嚴(yán)密控制培養(yǎng)的每一個(gè)流程，從而形成科學(xué)完整的質(zhì)量保障措施；而且每一個(gè)流程時(shí)間控制范圍窄，可合理安排培養(yǎng)時(shí)間，保障病菌培養(yǎng)質(zhì)量的時(shí)效性；
(2)培養(yǎng)病菌的有效侵染數(shù)量大。培養(yǎng)所用的顆粒比通常用的谷粒小3飛倍，病菌能占據(jù)整?；|(zhì)，過剩的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)少，這樣既能促進(jìn)病菌的繼續(xù)繁殖，又能避免潛在拮抗微生物的生長(zhǎng)、使病菌免于消解，病菌的有效侵染數(shù)量大。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制， 基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變更或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。包括病菌分離、平板培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)，具體包括以下步驟
Α、病菌分離，從發(fā)病田塊中采集病株，經(jīng)過分離、純化、致病力測(cè)定，獲得病菌，將菌種采用菌絲塊水浸法置于10°C條件下恒溫保存，備用；
B、平板培養(yǎng)，將病菌接種于培養(yǎng)基平板上，于M 30°C溫度下培養(yǎng)5 7天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養(yǎng)物，用作液體培養(yǎng)菌種；
C、液體培養(yǎng)，將B步驟得到的平板菌絲接種于培養(yǎng)液中，于M 30°C溫度下，13(Tl50r/ min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)5 7天，培養(yǎng)得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團(tuán)，鏡檢可發(fā)現(xiàn)游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個(gè)以上；
D、固體培養(yǎng)，將C步驟得到的液體菌絲接種于固體培養(yǎng)基，2Γ30 培養(yǎng)8 12天，培養(yǎng)得到的固體培養(yǎng)物整個(gè)基質(zhì)布滿白色菌絲，菌絲經(jīng)過液體浸泡、低溫誘導(dǎo)、室溫釋放孢子， 鏡檢可見游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個(gè)以上。所述的B步驟培養(yǎng)基為燕麥、芝麻、黑麥、白蕓豆、利馬豆、大豆培養(yǎng)基中的任意一種。所述的C步驟培養(yǎng)液為2(T30g的燕麥、芝麻、黑麥、白蕓豆、利馬豆、大豆中任意一種，加入IOOOmL蒸餾水中浸泡1818小時(shí)后，將組織搗碎后過濾，常規(guī)濕熱方法滅菌，再加入用l(T20g 6 7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌制備的煙根組織液混勻即成，所述培養(yǎng)液占容器容積的309Γ50%。所述的C步驟培養(yǎng)液為15(T250g新鮮胡蘿卜、番茄、大豆芽、綠豆芽中的任意一種，加入IOOOmL餾水，將組織搗碎后過濾，再依次經(jīng)過0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾后滅菌； 再加入用l(T20g 6 7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌制備的煙根組織液混勻即成，所述培養(yǎng)液占容器容積的309Γ50%。所述的C步驟平板菌絲接種于培養(yǎng)液是用滅菌的解剖刀切取煙草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為2、X 2 4mm，固體培養(yǎng)基載體厚度為廣2mm，每100毫升培養(yǎng)液接種菌絲2 4塊。所述的D步驟固體培養(yǎng)基為粒徑廣3mm的粗米糠或粉碎豌豆桿或蠶豆桿中的一種或一種以上，與粗麥麩以3 4:廣2的質(zhì)量比混勻，加入409Γ50%的水充分混勻，固體培養(yǎng)基占容器容積的50% 80%，常規(guī)濕熱滅菌。所述的D步驟固體培養(yǎng)基為粒徑廣3mm的新鮮豆腐渣和粗麥麩以6 8:廣2的質(zhì)量比混勻，加水混合控制含水量為409Γ50%，固體培養(yǎng)基占容器容積的509Γ80%，常規(guī)濕熱滅菌。所述的D步驟液體菌絲接種于固體培養(yǎng)基系按39Γ5%的體積比加入，加入后培養(yǎng)基底部無積液。實(shí)施例1
將從發(fā)病田塊中采集病株，經(jīng)過分離、純化、致病力測(cè)定，獲得病菌，將菌種采用菌絲塊水浸法置于10°c條件下恒溫保存，備用；將病菌接種于培養(yǎng)基為IOg燕麥在IOOOmL蒸餾水中浸泡M小時(shí)后，將組織搗碎后過濾，常規(guī)濕熱方法滅菌，再加入用IOg 6 7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌制備的煙根組織液混勻，并制成培養(yǎng)基板，于溫度下培養(yǎng)5天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養(yǎng)物，用作液體培養(yǎng)菌種；再將得到的平板菌絲接種于以150g新鮮胡蘿卜加入IOOOmL餾水將組織搗碎后過濾，再依次經(jīng)過 0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾后滅菌；再加入用IOg 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、 過濾滅菌制備的煙根組織液混勻即成培養(yǎng)液中，平板菌絲接種于培養(yǎng)液是用滅菌解剖刀切取煙草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為4X4mm，固體培養(yǎng)基載體厚度為1. 9mm，每100毫升培養(yǎng)液接種菌絲2塊。接種后于溫度下，130r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)7天，培養(yǎng)得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團(tuán)，鏡檢可發(fā)現(xiàn)游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個(gè)以上；將得到的液體菌絲接種于粒徑Imm的新鮮豆腐渣與粗麥麩以8:2的質(zhì)量比混勻，控制含水量在45%的固體培養(yǎng)基中，液體菌絲按固體培養(yǎng)基4% 的體積比加入，加入后培養(yǎng)基底部無積液，28°C培養(yǎng)9天，培養(yǎng)得到的固體培養(yǎng)物整個(gè)基質(zhì)布滿白色菌絲，菌絲經(jīng)過液體浸泡、低溫誘導(dǎo)、室溫釋放孢子，鏡檢可見游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個(gè)以上。獲得的培養(yǎng)物可作為煙草黑脛病的人工接種物，或者用于制備帶煙草黑脛病病菌病土的添加物之用。實(shí)施例2
將從發(fā)病田塊中采集病株，經(jīng)過分離、純化、致病力測(cè)定，獲得病菌，將菌種采用菌絲塊水浸法置于10°c條件下恒溫保存，備用；將病菌接種于培養(yǎng)基為30g芝麻在IOOOmL蒸餾水中浸泡18小時(shí)后，將組織搗碎后過濾，常規(guī)濕熱方法滅菌，再加入用20g 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌制備的煙根組織液混勻，并制成培養(yǎng)基板，于30°C溫度下培養(yǎng)5天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養(yǎng)物，用作液體培養(yǎng)菌種；再將得到的平板菌絲接種于以150g新鮮胡蘿卜加入IOOOmL餾水將組織搗碎后過濾，再依次經(jīng)過 0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾后滅菌；再加入用IOg 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、 過濾滅菌制備的煙根組織液混勻即成培養(yǎng)液中，平板菌絲接種于培養(yǎng)液是用滅菌解剖刀切取煙草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為2 X 2mm，固體培養(yǎng)基載體厚度為1mm，每100毫升培養(yǎng)液接種菌絲2塊。接種后于30°C溫度下，150r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)7天，培養(yǎng)得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團(tuán)，鏡檢可發(fā)現(xiàn)游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個(gè)以上；將得到的液體菌絲接種于粗米糠與粗麥麩以4:1的質(zhì)量比混勻，加入50%的水充分混勻制得的固體培養(yǎng)基，液體菌絲按固體培養(yǎng)基4. 5%的體積比加入，加入后培養(yǎng)基底部無積液，24°C培養(yǎng)10天，培養(yǎng)得到的固體培養(yǎng)物整個(gè)基質(zhì)布滿白色菌絲，菌絲經(jīng)過液體浸泡、低溫誘導(dǎo)、室溫釋放孢子，鏡檢可見游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個(gè)以上。獲得的培養(yǎng)物可作為煙草黑脛病的人工接種物， 或者用于制備帶煙草黑脛病病菌病土的添加物之用。實(shí)施例3
將從發(fā)病田塊中采集病株，經(jīng)過分離、純化、致病力測(cè)定，獲得病菌，將菌種采用菌絲塊水浸法置于10°c條件下恒溫保存，備用；將病菌接種于培養(yǎng)基為28g利馬豆在IOOOmL蒸餾水中浸泡觀小時(shí)后，將組織搗碎后過濾，常規(guī)濕熱方法滅菌，再加入用15g 6 7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌制備的煙根組織液混勻，并制成培養(yǎng)基板，于溫度下培養(yǎng)6天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養(yǎng)物，用作液體培養(yǎng)菌種；再將得到的平板菌絲接種于以250g新鮮番茄加入IOOOmL餾水將組織搗碎后過濾，再依次經(jīng)過 0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾后滅菌；再加入用15g 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、 過濾滅菌制備的煙根組織液混勻即成培養(yǎng)液中，平板菌絲接種于培養(yǎng)液是用滅菌解剖刀切取煙草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為4X4mm，固體培養(yǎng)基載體厚度為2mm，每100毫升培養(yǎng)液接種菌絲4塊。接種后于溫度下，140r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)6天，培養(yǎng)得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團(tuán)，鏡檢可發(fā)現(xiàn)游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個(gè)以上；將得到的液體菌絲接種于豌豆桿粉與粗麥麩以3 1的質(zhì)量比混勻，加入45%的水充分混勻制得的固體培養(yǎng)基，液體菌絲按固體培養(yǎng)基3. 5%的體積比加入，加入后培養(yǎng)基底部無積液，28°C培養(yǎng)9天，培養(yǎng)得到的固體培養(yǎng)物整個(gè)基質(zhì)布滿白色菌絲，菌絲經(jīng)過液體浸泡、低溫誘導(dǎo)、室溫釋放孢子，鏡檢可見游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個(gè)以上。獲得的培養(yǎng)物可作為煙草黑脛病的人工接種物， 或者用于制備帶煙草黑脛病病菌病土的添加物之用。實(shí)施例4
將從發(fā)病田塊中采集病株，經(jīng)過分離、純化、致病力測(cè)定，獲得病菌，將菌種采用菌絲塊水浸法置于10°c條件下恒溫保存，備用；將病菌接種于培養(yǎng)基為20g白蕓豆在IOOOmL蒸餾水中浸泡觀小時(shí)后，將組織搗碎后過濾，常規(guī)濕熱方法滅菌，再加入用IOg 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌制備的煙根組織液混勻，并制成培養(yǎng)基板，于溫度下培養(yǎng)7天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養(yǎng)物，用作液體培養(yǎng)菌種；再將得到的平板菌絲接種于以150g新鮮大豆芽加入IOOOmL餾水將組織搗碎后過濾，再依次經(jīng)過0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾后滅菌；再加入用20g 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌制備的煙根組織液混勻即成培養(yǎng)液中，平板菌絲接種于培養(yǎng)液是用滅菌解剖刀切取煙草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為3 X 3mm，固體培養(yǎng)基載體厚度為1. 5mm，每 100毫升培養(yǎng)液接種菌絲3塊。接種后于溫度下，130r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)7天，培養(yǎng)得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團(tuán)，鏡檢可發(fā)現(xiàn)游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個(gè)以上；將得到的液體菌絲接種于蠶豆桿粉與粗麥麩以3:1. 5的質(zhì)量比混勻，加入50%的水充分混勻制得的固體培養(yǎng)基，液體菌絲按固體培養(yǎng)基3%的體積比加入，加入后培養(yǎng)基底部無積液，27°C培養(yǎng)10天，培養(yǎng)得到的固體培養(yǎng)物整個(gè)基質(zhì)布滿白色菌絲，菌絲經(jīng)過液體浸泡、低溫誘導(dǎo)、室溫釋放孢子，鏡檢可見游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個(gè)以上。獲得的培養(yǎng)物可作為煙草黑脛病的
6人工接種物，或者用于制備帶煙草黑脛病病菌病土的添加物之用。實(shí)施例5
將從發(fā)病田塊中采集病株，經(jīng)過分離、純化、致病力測(cè)定，獲得病菌，將菌種采用菌絲塊水浸法置于10°c條件下恒溫保存，備用；將病菌接種于培養(yǎng)基為25g黑麥在IOOOmL蒸餾水中浸泡23小時(shí)后，將組織搗碎后過濾，常規(guī)濕熱方法滅菌，再加入用14g 6 7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌制備的煙根組織液混勻，并制成培養(yǎng)基板，于溫度下培養(yǎng)6天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養(yǎng)物，用作液體培養(yǎng)菌種；再將得到的平板菌絲接種于以250g新鮮綠豆芽加入IOOOmL餾水將組織搗碎后過濾，再依次經(jīng)過 0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾后滅菌；再加入用20g 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、 過濾滅菌制備的煙根組織液混勻即成培養(yǎng)液中，平板菌絲接種于培養(yǎng)液是用滅菌解剖刀切取煙草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為4X4mm，固體培養(yǎng)基載體厚度為2mm，每100毫升培養(yǎng)液接種菌絲2塊。接種后于25°C溫度下，150r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)6天，培養(yǎng)得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團(tuán)，鏡檢可發(fā)現(xiàn)游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個(gè)以上；將得到的液體菌絲接種于粗米糠與豌豆桿粉1:1混合后，再與粗麥麩以3:2的質(zhì)量比混勻，加入50%的水充分混勻制得的固體培養(yǎng)基，液體菌絲按固體培養(yǎng)基4%的體積比加入，加入后培養(yǎng)基底部無積液，^TC培養(yǎng)8天，培養(yǎng)得到的固體培養(yǎng)物整個(gè)基質(zhì)布滿白色菌絲，菌絲經(jīng)過液體浸泡、低溫誘導(dǎo)、室溫釋放孢子，鏡檢可見游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個(gè)以上。獲得的培養(yǎng)物可作為煙草黑脛病的人工接種物，或者用于制備帶煙草黑脛病病菌病土的添加物之用。實(shí)施例6
將從發(fā)病田塊中采集病株，經(jīng)過分離、純化、致病力測(cè)定，獲得病菌，將菌種采用菌絲塊水浸法置于10°c條件下恒溫保存，備用；將病菌接種于培養(yǎng)基為20g大豆在IOOOmL蒸餾水中浸泡27小時(shí)后，將組織搗碎后過濾，常規(guī)濕熱方法滅菌，再加入用17g 6 7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌制備的煙根組織液混勻，并制成培養(yǎng)基板，于30°C溫度下培養(yǎng)5天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養(yǎng)物，用作液體培養(yǎng)菌種；再將得到的平板菌絲接種于以150g新鮮胡蘿卜和IOOg番茄加入IOOOmL餾水將組織搗碎后過濾， 再依次經(jīng)過0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾后滅菌；再加入用IOg 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌制備的煙根組織液混勻即成培養(yǎng)液中，平板菌絲接種于培養(yǎng)液是用滅菌解剖刀切取煙草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為2. 5X2. 5mm,固體培養(yǎng)基載體厚度為1. 7mm,每100毫升培養(yǎng)液接種菌絲3塊。接種后于溫度下，140r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)5天，培養(yǎng)得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團(tuán)，鏡檢可發(fā)現(xiàn)游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個(gè)以上；將得到的液體菌絲接種于粒徑 Imm的粗米糠與蠶豆桿粉的混合物與粗麥麩以4:1的質(zhì)量比混勻，加入50%的水充分混勻制得的固體培養(yǎng)基，液體菌絲按固體培養(yǎng)基5%的體積比加入，加入后培養(yǎng)基底部無積液，
培養(yǎng)10天，培養(yǎng)得到的固體培養(yǎng)物整個(gè)基質(zhì)布滿白色菌絲，菌絲經(jīng)過液體浸泡、低溫誘導(dǎo)、室溫釋放孢子，鏡檢可見游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個(gè)以上。獲得的培養(yǎng)物可作為煙草黑脛病的人工接種物，或者用于制備帶煙草黑脛病病菌病土的添加物之用。實(shí)施例7將從發(fā)病田塊中采集病株，經(jīng)過分離、純化、致病力測(cè)定，獲得病菌，將菌種采用菌絲塊水浸法置于10°C條件下恒溫保存，備用；將病菌接種于培養(yǎng)基為20g燕麥在IOOOmL蒸餾水中浸泡沈小時(shí)后，將組織搗碎后過濾，常規(guī)濕熱方法滅菌，再加入用18g 6 7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌制備的煙根組織液混勻，并制成培養(yǎng)基板，于30°C溫度下培養(yǎng)5天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養(yǎng)物，用作液體培養(yǎng)菌種；再將得到的平板菌絲接種于以130g新鮮胡蘿卜和120g番茄加入IOOOmL餾水將組織搗碎后過濾， 再依次經(jīng)過0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾后滅菌；再加入用17g 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌制備的煙根組織液混勻即成培養(yǎng)液中，平板菌絲接種于培養(yǎng)液是用滅菌解剖刀切取煙草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為3. 5X3. 5mm,固體培養(yǎng)基載體厚度為1. 9mm,每100毫升培養(yǎng)液接種菌絲4塊。接種后于溫度下，130r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)7天，培養(yǎng)得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團(tuán)，鏡檢可發(fā)現(xiàn)游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個(gè)以上；將得到的液體菌絲接種于粒徑3mm 的新鮮豆腐渣與粗麥麩以6:1的質(zhì)量比混勻，控制含水量在45%的固體培養(yǎng)基中，液體菌絲按固體培養(yǎng)基3%的體積比加入，加入后培養(yǎng)基底部無積液，培養(yǎng)9天，培養(yǎng)得到的固體培養(yǎng)物整個(gè)基質(zhì)布滿白色菌絲，菌絲經(jīng)過液體浸泡、低溫誘導(dǎo)、室溫釋放孢子，鏡檢可見游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個(gè)以上。獲得的培養(yǎng)物可作為煙草黑脛病的人工接種物，或者用于制備帶煙草黑脛病病菌病土的添加物之用。
權(quán)利要求
1.一種煙草黑脛病病菌的液固復(fù)合體系培養(yǎng)方法，包括病菌分離、平板培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)，其特征在于培養(yǎng)方法具體包括以下步驟A、病菌分離，從發(fā)病田塊中采集病株，經(jīng)過分離、純化、致病力測(cè)定，獲得病菌，將菌種采用菌絲塊水浸法置于10°C條件下恒溫保存，備用；B、平板培養(yǎng)，將病菌接種于培養(yǎng)基平板上，于M 30°C溫度下培養(yǎng)5 7天，選擇菌絲純白色，在平板表面密布一層菌絲的培養(yǎng)物，用作液體培養(yǎng)菌種；C、液體培養(yǎng)，將B步驟得到的平板菌絲接種于培養(yǎng)液中，于M 30°C溫度下，13(Tl50r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)5 7天，培養(yǎng)得到的液體菌液中菌絲白色、菌液不渾濁、菌絲不成團(tuán)，鏡檢可發(fā)現(xiàn)游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在1萬個(gè)以上；D、固體培養(yǎng)，將C步驟得到的液體菌絲接種于固體培養(yǎng)基，2Γ30 培養(yǎng)8 12天，培養(yǎng)得到的固體培養(yǎng)物整個(gè)基質(zhì)布滿白色菌絲，菌絲經(jīng)過液體浸泡、低溫誘導(dǎo)、室溫釋放孢子，鏡檢可見游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子或休止孢，每毫升孢子含量在10萬個(gè)以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液固復(fù)合體系培養(yǎng)方法，其特征是所述的B步驟中的培養(yǎng)基為燕麥、芝麻、黑麥、白蕓豆、利馬豆、大豆培養(yǎng)基中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的液固復(fù)合體系培養(yǎng)方法，其特征在于所述的C步驟中的培養(yǎng)液為2(T30g的燕麥、芝麻、黑麥、白蕓豆、利馬豆、大豆中任意一種，加入IOOOmL蒸餾水中浸泡1818小時(shí)后，將組織搗碎后過濾，常規(guī)濕熱方法滅菌，再加入用l(T20g 6 7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌制備的煙根組織液混勻即得到培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液占容器容積的30% 50%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的液固復(fù)合體系培養(yǎng)方法，其特征是所述的C步驟中的培養(yǎng)液為15(T250g新鮮胡蘿卜、番茄、大豆芽、綠豆芽中的任意一種，加入IOOOmL餾水，將組織搗碎后過濾，再依次經(jīng)過0. 45 μ m、0. 22 μ m濾膜過濾后滅菌；再加入用l(T20g 6^7葉期感病煙苗鮮根按上述方式搗碎、過濾滅菌制備的煙根組織液混勻即成，所述培養(yǎng)液占容器容積的30% 50%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液固復(fù)合體系培養(yǎng)方法，其特征是所述的C步驟平板菌絲接種于培養(yǎng)液是用滅菌的解剖刀切取煙草黑脛病病菌菌絲塊，菌絲塊大小為2 4X2 4mm，固體培養(yǎng)基載體厚度為廣2mm，每100毫升培養(yǎng)液接種菌絲2、塊。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液固復(fù)合體系培養(yǎng)方法，其特征是所述的D步驟固體培養(yǎng)基為粒徑廣3mm的粗米糠或豌豆桿粉或蠶豆桿粉中的一種或一種以上，與粗麥麩以3 4:廣2的質(zhì)量比混勻，加入40% 50%的水充分混勻，固體培養(yǎng)基占容器容積的50% 80%，常規(guī)濕熱滅菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的液固復(fù)合體系培養(yǎng)方法，其特征是所述的D步驟固體培養(yǎng)基為粒徑廣3mm的新鮮豆腐渣和粗麥麩以6 8:廣2的質(zhì)量比混勻，加水混合控制含水量為40% 50%，固體培養(yǎng)基占容器容積的50% 80%，常規(guī)濕熱滅菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液固復(fù)合體系培養(yǎng)方法，其特征是所述的D步驟液體菌絲接種于固體培養(yǎng)基系按39Γ5%的體積比加入，加入后培養(yǎng)基底部無積液。
9.權(quán)利要求1或8所述的液固復(fù)合體系培養(yǎng)方法獲得的培養(yǎng)物用于煙草黑脛病的人工接種物，或者用于制備帶煙草黑脛病病菌病土的添加物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種煙草黑脛病病菌液固復(fù)合體系培養(yǎng)方法及培養(yǎng)物應(yīng)用，該法培養(yǎng)獲得的固體物可用于煙草黑脛病的人工接種物，也可用于制備帶煙草黑脛病病菌病土的添加物，以便測(cè)定煙草品種對(duì)黑脛病的抗感性、篩選防治煙草黑脛病的藥劑或生防菌、天然產(chǎn)物。其培養(yǎng)步驟包括(A)病菌分離，從發(fā)病田塊中采集病株，經(jīng)過分離、純化、致病力測(cè)定，獲得病菌；(B)平板培養(yǎng)，將病菌接種于培養(yǎng)基平板上，24~30℃下培養(yǎng)5~7天；(C)液體培養(yǎng)，將平板菌絲接種于培養(yǎng)液中，24~30℃、150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)5~7天；(D)固體培養(yǎng)，將液體菌絲接種于固體培養(yǎng)基，24~30℃培養(yǎng)8~12天。本發(fā)明具有接種量大、培養(yǎng)周期短、不易污染等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102559516SQ20121002160
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月31日
發(fā)明者盧秀萍, 宋春滿, 方敦煌, 肖炳光 申請(qǐng)人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院