專利名稱：一種導(dǎo)致煙草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養(yǎng)物制備和保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物純化、保存技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種導(dǎo)致煙草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養(yǎng)物制備方法和兩種保存方法。
背景技術(shù)：
煙草青枯病(Tobacco bacterial wilt)是煙草生產(chǎn)中的主要細(xì)菌病害之一，在中國大部分產(chǎn)煙區(qū)都有發(fā)生，而且有逐年加重的趨勢。其病原菌是茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)，該菌的寄主廣泛，現(xiàn)有技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對該菌的分離、培養(yǎng)和保存，見《中國煙草病害》(朱賢朝，王彥亭，王智發(fā)，中國農(nóng)業(yè)出版社，2002，152 163頁)，其采取的培養(yǎng)方式為將分離的材料表面消毒后，取病組織加入滅菌水后剪碎或磨碎，再取剪碎或磨碎液在 TTC培養(yǎng)基上劃線或涂布，27 30°C培養(yǎng)3 4天后，檢查培養(yǎng)的菌落，選擇病菌菌落轉(zhuǎn)入斜面培養(yǎng)、保存。該方式存在的不足是病菌在人工培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接多次會導(dǎo)致病菌的變異、 一些固有的特性會喪失；而且有可能因?yàn)椴【鷶?shù)量少分離不到病菌。方中達(dá)編著的《植物病研究方法》(中國農(nóng)業(yè)出版社，1998，187 189頁)記載，有關(guān)保存煙草青枯病菌菌株的方法有真空冷凍干燥保存、冷凍甘油保存、礦物油保存、斜面保存和無菌水常溫保存等方式。 真空冷凍干燥保存煙草青枯病菌雖然保存時(shí)間長、保存效果好，但需要配套的昂貴設(shè)備、操作煩瑣、技術(shù)難度大。冷凍甘油保存方式如果長期保存時(shí)會出現(xiàn)煙草青枯病菌菌株存活率低、致病力下降的問題。礦物油保存、斜面保存方式的保存時(shí)間短、保存效果不佳。無菌水常溫保存，煙草青枯病菌菌體會沉淀，外界溫度變化大，保存效果得不到保障。為了防止煙草青枯病菌在人工培養(yǎng)基上連續(xù)傳代，出現(xiàn)致病力迅速下降或其它遺傳性狀的改變的問題，以及現(xiàn)有技術(shù)保存培養(yǎng)物的效果不確定的缺陷，發(fā)展一種經(jīng)濟(jì)有效的、并保持煙草青枯病致病菌固有特性的分離培養(yǎng)和保存方法，顯得尤為必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的在于提供一種導(dǎo)致煙草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養(yǎng)物制備方法，第二、三目的在于提供兩種保存該高純培養(yǎng)物的方法。本發(fā)明的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，導(dǎo)致煙草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養(yǎng)物制備方法，采取以下步驟A、原料的制備選具有煙草青枯病典型癥狀的病株莖稈用自來水洗凈，經(jīng)75%的酒精表面消毒2 3分鐘后，用無菌水沖洗2 3次，然后在無菌條件下將病株莖稈截成 3 5cm的小段；B、保濕培養(yǎng)在27 30°C下，將病株莖稈小段的截口暴露于滅菌蒸餾水外，無菌保濕培養(yǎng)12 M小時(shí)，有濃稠狀液體從截口處流出，濃稠狀液體為含茄科雷爾氏菌培養(yǎng)物；C、選擇高純培養(yǎng)物采用半選擇TTC法進(jìn)行培養(yǎng)測定，用移菌環(huán)取B步驟所得的濃稠狀液體，以含有0. 吐溫_80、pH值為6. 8的滅菌磷酸緩沖液10倍系列稀釋后，涂布于直徑9 IOcm半選擇TTC平板培養(yǎng)基上，27 30°C無菌培養(yǎng)3 4天后，選擇含有80 120個(gè)菌落的培養(yǎng)基，且有環(huán)狀螺紋、邊緣白色中央粉紅色的較大菌落占總菌落數(shù)80%以上的，即接種到該培養(yǎng)基上的濃稠狀液體為含菌量在80%以上的含茄科雷爾氏菌高純培養(yǎng)物。所述的無菌保濕培養(yǎng)是將病株莖稈小段置于滅菌的離心管或量筒中，用封口膜封口，病株莖稈小段的截口高出液面1 2cm。所述的離心管或量筒的內(nèi)徑比病株莖稈粗2 3mm。本發(fā)明第二個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的將高純培養(yǎng)物加入到裝有保存液A的保存容器中，保存時(shí)細(xì)菌濃度為1千萬 10億CFU/mL，將旋蓋或扣蓋蓋緊后，用封口膜封口， 在-20 _40°C恒溫保存；所述的保存液A是用100 200mL甘油和20 40g脫脂奶粉， 加入蒸餾水溶解、定容至500mL，搖勻，常規(guī)滅菌后制得。本發(fā)明第三個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的將高純培養(yǎng)物加入到裝有保存液B的保存容器中，保存時(shí)細(xì)菌濃度為1千萬 10億CFU/mL，將旋蓋或扣蓋蓋緊后，用封口膜封口，在20°C 恒溫保存；所述的保存液B是用1 2g瓊脂加入至IOOOmL蒸餾水中融化、搖勻，常規(guī)滅菌后制得。上述兩種保存方法中，所述的保存容器為1. 5mL的離心管或2. OmL的菌種保存管。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有以下技術(shù)效果1、獲得高純培養(yǎng)直接、快速、純度高、性狀穩(wěn)定。利用目標(biāo)菌的寄主植物——煙草， 其莖稈微管系統(tǒng)發(fā)達(dá)的特性，直接將具有煙草青枯病典型癥狀的病株莖稈進(jìn)行保濕培養(yǎng)， 從而獲得高純培養(yǎng)物。這種方法避免了人工培養(yǎng)基導(dǎo)致病株傳代中致病力下降或遺傳性狀改變的問題。配合半選擇 TTC培養(yǎng)基(Granada G A, Sequeira L. Survival of Pseudomonas solanacearum in soil, rhizosphere and plant roots. Can. J. Microbiol. ,1983,29 433 440.)進(jìn)行稀釋分離、篩選高純培養(yǎng)物，可經(jīng)濟(jì)、有效地獲得固有特性保持良好的菌株。2、保存方法簡便易行、保存效果好。保存目標(biāo)菌的高純培養(yǎng)物，可根據(jù)需要選擇采用兩種方法，即利用保存液A在-20 _40°C冷凍保存和利用保存液B在20°C恒溫保存。冷凍保存將培養(yǎng)物作為菌種資源長期保存，如不反復(fù)凍融，可有效保存病菌10年以上；采用恒溫保存，培養(yǎng)物中菌體存活率高，轉(zhuǎn)接方便，可以有效保存病菌至少5年。
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。一種導(dǎo)致煙草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養(yǎng)物制備方法，采取以下步驟A、原料的制備選具有煙草青枯病典型癥狀的病株莖稈用自來水洗凈，經(jīng)75%的酒精表面消毒2 3分鐘后，用無菌水沖洗2 3次，然后在無菌條件下將病株莖稈截成 3 5cm的小段；B、保濕培養(yǎng)在27 30°C下，將病株莖稈小段的截口暴露于滅菌蒸餾水外，無菌保濕培養(yǎng)12 M小時(shí)，有濃稠狀液體從截口處流出，濃稠狀液體為含茄科雷爾氏菌培養(yǎng)物；C、選擇高純培養(yǎng)物采用半選擇TTC法進(jìn)行培養(yǎng)測定，用移菌環(huán)取B步驟所得的濃稠狀液體，以含有0. 吐溫-80、pH值為6. 8的滅菌磷酸緩沖液10倍系列稀釋后，涂布于直徑9 IOcm半選擇TTC平板培養(yǎng)基上，27 30°C無菌培養(yǎng)3 4天后，選擇含有80 120個(gè)菌落的培養(yǎng)基，且有環(huán)狀螺紋、邊緣白色中央粉紅色的較大菌落占總菌落數(shù)80%以上的，即接種到該培養(yǎng)基上的濃稠狀液體為含菌量在80%以上的含茄科雷爾氏菌高純培養(yǎng)物。上述制備方法中，所述的無菌保濕培養(yǎng)是將病株莖稈小段置于滅菌的離心管或量筒中，用封口膜封口，病株莖稈小段的截口高出液面1 2cm。所述的離心管或量筒的內(nèi)徑比病株莖稈粗2 3_。一種保存上述高純培養(yǎng)物的方法，將高純培養(yǎng)物加入到裝有保存液A的保存容器中，保存時(shí)細(xì)菌濃度為1千萬 10億CFU/mL，將旋蓋或扣蓋蓋緊后，用封口膜封口， 在-20 -40°C恒溫保存；所述的保存液A是用100 200mL甘油和20 40g脫脂奶粉， 加入蒸餾水溶解、定容至500mL，搖勻，常規(guī)滅菌后制得。另一種保存上述高純培養(yǎng)物的方法，將高純培養(yǎng)物加入到裝有保存液B的保存容器中，保存時(shí)細(xì)菌濃度為1千萬 10億CFU/mL，將旋蓋或扣蓋蓋緊后，用封口膜封口，在 20°C恒溫保存；所述的保存液B是用1 2g瓊脂加入至IOOOmL蒸餾水中融化、搖勻，常規(guī)滅菌后制得。上述保存方法中，所述的保存容器為1. 5mL的離心管或2. OmL的菌種保存管，其保存效果更好。實(shí)施例1 制備高純培養(yǎng)物，采取以下步驟A、取具有煙草青枯病典型癥狀的煙草病株莖稈自來水洗凈，經(jīng)75%的酒精表面消毒3分鐘后，用無菌水沖洗2次，然后在無菌條件下將病株莖稈截成3cm的小段；B、在27°C下，將病株莖稈小段截口暴露于滅菌蒸餾水外1cm，無菌保濕培養(yǎng)12小時(shí)，直到有濃稠狀液體從病株莖稈小段的截口處流出；C、采用半選擇TTC培養(yǎng)測定，用移菌環(huán)取濃稠狀液體，以含有0. 吐溫-80的、 PH值為6. 8的滅菌磷酸緩沖液10倍系列稀釋后，涂布于直徑IOcm的半選擇TTC平板培養(yǎng)基上，27°C無菌培養(yǎng)3天后，培養(yǎng)基上包含有96個(gè)菌落，其中有環(huán)狀螺紋、邊緣白色中央粉紅色的較大菌落占總菌落數(shù)的86.對％。配制保存液Al 用IOOOmL甘油和20g脫脂奶粉，加入蒸餾水溶解、定容至500mL，
搖勻，常規(guī)滅菌后制得。采用裝有保存液Al的1. 5mL離心管保存高純培養(yǎng)物，將高純培養(yǎng)物加入到其中， 保存時(shí)細(xì)菌濃度為1千萬 10億CFU/mL(采用常規(guī)稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法測定)，在_20°C 恒溫保存；。實(shí)施例2 制備高純培養(yǎng)物，采取以下步驟A、取具有煙草青枯病典型癥狀的煙草病株莖稈自來水洗凈，經(jīng)75%的酒精表面消毒2分鐘后，在無菌條件下用無菌水沖洗3次，然后將病株莖稈截成5cm的小段；
B、在30°C下，將病株莖稈小段截口暴露于滅菌蒸餾水外2cm，無菌保濕培養(yǎng)M小時(shí)，直到有濃稠狀液體從病株莖稈小段的截口處流出；C、采用半選擇TTC培養(yǎng)測定，用移菌環(huán)取濃稠狀液體，含有0. 1 %吐溫-80的、pH 值為6. 8的滅菌磷酸緩沖液10倍系列稀釋后，涂布于直徑9cm的半選擇TTC平板培養(yǎng)基上， 30°C無菌培養(yǎng)4天后，培養(yǎng)基上包含有87個(gè)菌落，其中有環(huán)狀螺紋、邊緣白色中央粉紅色的較大菌落占總菌落數(shù)的83. 15%。配制保存液A2 用200mL甘油和40g脫脂奶粉，加入蒸餾水溶解、定容至500mL，搖勻，常規(guī)滅菌后制得。采用裝有保存液A2的2. OmL菌種保存管保存高純培養(yǎng)物，將高純培養(yǎng)物加入到其中，保存時(shí)細(xì)菌濃度為ι千萬 10億CFU/mL(采用常規(guī)稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法測定)， 在-40°C恒溫保存。實(shí)施例3制備高純培養(yǎng)物采取的方法中病株莖稈小段截口暴露于滅菌蒸餾水外1. 5cm, 無菌保濕培養(yǎng)18小時(shí)，其他均與實(shí)施例1相同。半選擇TTC培養(yǎng)測定后，培養(yǎng)基上包含有 116個(gè)菌落，其中有環(huán)狀螺紋、邊緣白色中央粉紅色的較大菌落占總菌落數(shù)的82. 32%。配制保存液A3 用150mL甘油和30g脫脂奶粉，加入蒸餾水溶解、定容至500mL，搖勻，常規(guī)滅菌后制得。裝有保存液A3的1. 5mL離心管保存高純培養(yǎng)物，將高純培養(yǎng)物加入到其中，保存時(shí)細(xì)菌濃度為1千萬 10億CFU/mL(采用常規(guī)稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法測定)，在_30°C恒溫保存。實(shí)施例4制備高純培養(yǎng)物，采取的方法與實(shí)施例2相同。配制保存液A4 用ISOmL甘油和25g脫脂奶粉，加入蒸餾水溶解、定容至500mL，搖勻，常規(guī)滅菌后制得。采用裝有保存液A4的2. OmL菌種保存管保存高純培養(yǎng)物，將高純培養(yǎng)物加入到其中，保存時(shí)細(xì)菌濃度為ι千萬 10億CFU/mL(采用常規(guī)稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法測定)， 在-30°C恒溫保存。實(shí)施例5制備高純培養(yǎng)物采取的方法與實(shí)施例1相同。配制保存液Bl 用1. 5g的瓊脂加入至IOOOmL蒸餾水中融化、搖勻，常規(guī)滅菌后制得。采用裝有保存液Bl的1.5mL離心管保存高純培養(yǎng)物，將高純培養(yǎng)物加入到其中， 保存時(shí)細(xì)菌濃度為1千萬 10億CFU/mL (采用常規(guī)稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法測定)，在20°C恒
溫保存。實(shí)施例6制備高純培養(yǎng)物采取的方法與實(shí)施例3相同。配制保存液B2 用Ig的瓊脂加入至IOOOmL蒸餾水中融化、搖勻，常規(guī)滅菌后制得采用裝有保存液B2的2. OmL菌種保存管保存高純培養(yǎng)物，將高純培養(yǎng)物加入到其中，保存時(shí)細(xì)菌濃度為1千萬 10億CFU/mL (采用常規(guī)稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法測定)，在20°C恒溫保存。實(shí)施例7制備高純培養(yǎng)物采取的方法與實(shí)施例2相同。配制保存液B3 用2g的瓊脂加入至IOOOmL蒸餾水中融化、搖勻，常規(guī)滅菌后制得。采用裝有保存液B3的2. OmL菌種保存管保存高純培養(yǎng)物，將高純培養(yǎng)物加入到其中，保存時(shí)細(xì)菌濃度為1千萬 10億CFU/mL (采用常規(guī)稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法測定)，在20°C 恒溫保存。本發(fā)明技術(shù)效果的驗(yàn)證試驗(yàn)1、采用現(xiàn)有技術(shù)的半選擇TTC培養(yǎng)測定法選擇高純培養(yǎng)物，屬于現(xiàn)有技術(shù)。觀察培養(yǎng)了 3 4天后的培養(yǎng)基，如果直徑為9 IOcm的培養(yǎng)基上包含有80 120個(gè)菌落，并且有環(huán)狀螺紋、邊緣白色、中央粉紅色的較大菌落占總菌落數(shù)的80%以上，說明該培養(yǎng)基所接種的濃稠狀液體的含菌量在80%以上。選擇含菌量大于80%的培養(yǎng)物保存，保證了培養(yǎng)物的高純度。2、用第一種方法所保存菌株的活力和致病力試驗(yàn)結(jié)果1)隨機(jī)抽取采用保存液A、以-20 _40°C恒溫保存了 10年的M株病菌菌株，用半選擇TTC培養(yǎng)測定，發(fā)現(xiàn)所有供試菌株的存活率均在40%以上，純度在70%以上。2)從M株病菌菌株中任意抽取12株菌株，采用公知技術(shù)的注射法接種苗齡45 55天的K326( —種主栽的煙草品種)煙苗的第3、4片真葉，在M小時(shí)內(nèi)觀察過敏性反應(yīng)， 結(jié)果表明所有的菌株致病力保持不變。3)采用Hicks煙草品種(一種測定茄科雷爾氏菌菌株致病力常用的煙草品種)， 用公知技術(shù)的濕潤育苗灌根法接種另外12株病菌菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病情指數(shù)與10年前的相比變化范圍為1 3，致病力變化不顯著。由此說明，第一種方法保存10年后的菌株活力保持良好，致病力變化不大。3、用第二種方法所保存菌株的活力和致病力試驗(yàn)結(jié)果1)隨機(jī)抽取采用保存液B、以20°C恒溫保存了 5年的20株病菌菌株，用半選擇TTC 培養(yǎng)測定，發(fā)現(xiàn)所有的供試菌株存活率均在35 %以上，純度在60%以上。2)從20株病菌菌株中任意取10株菌株，采用公知技術(shù)的注射法接種苗齡45 55天的1(3 煙苗的第3、4片真葉，在M小時(shí)內(nèi)觀察過敏性反應(yīng)，結(jié)果表明所有的菌株致病力保持不變。3)采用Hicks煙草品種濕潤育苗灌根法接種另外10株病菌菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病情指數(shù)與5年前的相比變化范圍為1 3，致病力變化不顯著。由此說明，第二種方法保存5年后的菌株活力保持良好，致病力變化不大。本發(fā)明特點(diǎn)1、直接進(jìn)行保濕培養(yǎng)，簡便快速，培養(yǎng)物的純度高，有效保持了菌株的固有特性；2、保存方式易于實(shí)施，操作簡便，保存時(shí)間長，效果好。
權(quán)利要求
1.一種導(dǎo)致煙草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養(yǎng)物的制備方法，其特征是采取以下步驟A、原料的制備選具有煙草青枯病典型癥狀的病株莖稈用自來水洗凈，經(jīng)75%的酒精表面消毒2 3分鐘后，用無菌水沖洗2 3次，然后在無菌條件下將病株莖稈截成3 5cm的小段；B、保濕培養(yǎng)在27 30°C下，將病株莖稈小段的截口暴露于滅菌蒸餾水外，無菌保濕培養(yǎng)12 M小時(shí)，有濃稠狀液體從截口處流出，濃稠狀液體為含茄科雷爾氏菌培養(yǎng)物；C、選擇高純培養(yǎng)物采用半選擇TTC法進(jìn)行培養(yǎng)測定，用移菌環(huán)取B步驟所得的濃稠狀液體，以含有0. 吐溫_80、pH值為6. 8的滅菌磷酸緩沖液10倍系列稀釋后，涂布于直徑 9 IOcm半選擇TTC平板培養(yǎng)基上，27 30°C無菌培養(yǎng)3 4天后，選擇含有80 120個(gè)菌落的培養(yǎng)基，且有環(huán)狀螺紋、邊緣白色中央粉紅色的較大菌落占總菌落數(shù)80%以上的，即接種到該培養(yǎng)基上的濃稠狀液體為含菌量在80%以上的含茄科雷爾氏菌高純培養(yǎng)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)致煙草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養(yǎng)物的制備方法，其特征是所述的無菌保濕培養(yǎng)是將病株莖稈小段置于滅菌的離心管或量筒中，用封口膜封口，病株莖稈小段的截口高出液面1 2cm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的導(dǎo)致煙草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養(yǎng)物的制備方法，其特征是所述的離心管或量筒的內(nèi)徑比病株莖稈粗2 3mm。
4.一種保存權(quán)利要求1所述的導(dǎo)致煙草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養(yǎng)物的方法，其特征是將高純培養(yǎng)物加入到裝有保存液A的保存容器中，保存時(shí)細(xì)菌濃度為1千萬 10 億CFU/mL，將旋蓋或扣蓋蓋緊后，用封口膜封口，在-20 _40°C恒溫保存；所述的保存液A 是用100 200mL甘油和20 40g脫脂奶粉，加入蒸餾水溶解、定容至500mL，搖勻，常規(guī)滅菌后制得。
5.一種保存權(quán)利要求1所述的導(dǎo)致煙草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養(yǎng)物的方法， 其特征是將高純培養(yǎng)物加入到裝有保存液B的保存容器中，保存時(shí)細(xì)菌濃度為1千萬 10億CFU/mL，將旋蓋或扣蓋蓋緊后，用封口膜封口，在20°C恒溫保存；所述的保存液B是用 1 2g瓊脂加入至IOOOmL蒸餾水中融化、搖勻，常規(guī)滅菌后制得。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的保存導(dǎo)致煙草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養(yǎng)物的方法，其特征是所述的保存容器為1. 5mL的離心管或2. OmL的菌種保存管。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種導(dǎo)致煙草青枯病的茄科雷爾氏菌高純培養(yǎng)物制備和保存方法，將煙草青枯病典型癥狀的病株莖稈處置后，27～30℃無菌保濕培養(yǎng)12～24小時(shí)，獲得含茄科雷爾氏菌培養(yǎng)物；經(jīng)過TTC法鑒定、篩選含菌量在80％以上的高純培養(yǎng)物；所獲得的高純培養(yǎng)物可采用保存液A在-20～-40℃恒溫保存，或采用保存液B在20℃恒溫保存；保存液A為100～200mL甘油和20～40g脫脂奶粉，加入蒸餾水溶解、定容至500mL，搖勻，常規(guī)滅菌后制得；保存液B是將1～2g的瓊脂加入至1000mL蒸餾水中融化、搖勻，常規(guī)滅菌后制得。本發(fā)明的制備和保存方法簡便、易行，目標(biāo)菌純度高、性狀穩(wěn)定，保存效果好。
文檔編號C12N1/04GK102229897SQ201110112228
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月3日
發(fā)明者余清, 宋春滿, 方敦煌, 晉艷, 秦西云, 胡堅(jiān) 申請人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院