專(zhuān)利名稱(chēng)：一種羧酸酯酶基因及其編碼的蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種羧酸酯酶及其基因序列。
背景技術(shù)：
生物素(biotin)是一種存在于所有活細(xì)胞中的必需維生素。它的生物合成途徑包括7，8- 二氨基壬酸合成酶、生物素合成酶、8-酮基-7氨基合成酶、甲基轉(zhuǎn)移酶和脫硫生物素合成酶，分別由bioA、bioB、bioF、bioC和bioD基因編碼，這五個(gè)基因組成bioABFCD 操縱子。庚二酰輔酶A(Pimeloyl-CoA)是生物素生物合成途徑的起始底物，它本身則由不同途徑產(chǎn)生。革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌(Escherichia coli)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)，通過(guò)修飾的脂肪酸合成途徑產(chǎn)生庚二酰輔酶A，而革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌 (Bacillus subtilis,B. spbaericus,)則通過(guò)庚二酰輔酶A合成酶將自由的庚二酸和輔酶 A合成為庚二酰輔酶A。盡管革蘭氏陰性菌中庚二酰輔酶A的合成機(jī)制至今仍未完全闡明，但是可能涉及 BioC和BioH的聯(lián)合作用。BioC作為庚二酰特異載體蛋白，而B(niǎo)ioH不僅具有硫酯酶(從庚二酰-BioC復(fù)合體上水解一個(gè)硫酯鍵)，而且具有?；D(zhuǎn)移酶(轉(zhuǎn)移一個(gè)酰基給輔酶A)活性。盡管bioH基因不屬于含有bioC的生物素合成操縱子bioABTOD，可是bioH是生物素合成的必需基因。近年來(lái)，已從E. colLSerratia spp.中克隆到bioH基因，并被鑒定編碼一種新型的羧酸酯酶。羧酸酯酶(Carboxylesterase，CaEs, EC 3. 1. 1. 1)水解帶羧基的脂肪酸族及芳香族酯類(lèi)，對(duì)α -萘酚酯和對(duì)硝基苯酯類(lèi)物質(zhì)均具有較高的特異性，且對(duì)其相應(yīng)的丁酸酯、戊酸酯活性最高，酶活性隨碳鏈延長(zhǎng)減弱。目前已從鏈霉菌屬(Sti^ptomyces sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp·)、乳桿菌屬(Lactobacillus sp·)、微球菌屬(Micrococcus sp.)等微生物中克隆到羧酸酯酶基因，已經(jīng)應(yīng)用于食品、洗滌、皮革、紙張等工業(yè)中，主要用于水解反應(yīng)。羧酸酯酶還被應(yīng)用于制藥、染料、殺蟲(chóng)劑和殺菌劑等工農(nóng)業(yè)廢水中硝基苯酚類(lèi)毒性污染物的降解。然而，至今從微生物中克隆獲得的羧酸酯酶仍然較少，難以滿足食品、化工等工業(yè)快速發(fā)展，以及環(huán)境可持續(xù)、健康發(fā)展的需求；此外，國(guó)外對(duì)新型羧酸酯酶的研究還很少 (14篇研究論文，NCBI PUBMID數(shù)據(jù)庫(kù)檢索)，國(guó)內(nèi)至今未見(jiàn)研究報(bào)道。本發(fā)明運(yùn)用功能驅(qū)動(dòng)的篩選策略和基因克隆技術(shù)，成功克隆到bioH基因，命名為APbioH，并獲得了其全長(zhǎng)基因序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種雙功能羧酸酯酶及編碼該羧酸酯酶的基因。一種雙功能羧酸酯酶基因，其核苷酸序列包括SEQ ID No. 1所示的序列，是編碼 SEQ ID No. 2所示羧酸酯酶蛋白的核苷酸序列，更優(yōu)選的，其核苷酸序列是SEQ ID No. 1所示的序列，長(zhǎng)度為780bp。
一種雙功能羧酸酯酶，其氨基酸序列包括SEQ ID No. 2所示的序列，更優(yōu)選的，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，含259個(gè)氨基酸。本發(fā)明提取無(wú)色桿菌AchromcAacter piechaudii基因組DNA，利用功能驅(qū)動(dòng)的篩選策略和基因克隆技術(shù)，從中成功克隆到具有羧酸酯酶活性的生物素合成酶bioH基因，命名為ApbioH，并獲得了其全長(zhǎng)基因序列。該基因編碼的蛋白是一種雙功能羧酸酯酶(命名為APBioH)，由260個(gè)氨基酸構(gòu)成，具有硫酯酶和?；D(zhuǎn)移酶的活性。APBioH與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中BioH同源序列的相似性為96%，含有G-X-S-X-G-G保守結(jié)構(gòu)域，屬于新型的雙功能羧酸酯酶。本發(fā)明填補(bǔ)了我國(guó)在該領(lǐng)域研究的空白，為我國(guó)酶制劑的發(fā)展及其在食品、化工工業(yè)，以及硝基苯酚類(lèi)毒性污染物降解中的應(yīng)用提供了新基因資源。


圖 1 為實(shí)施例中 E. coliDH5 α (pCaEsSHOl-1)在選擇性 SBA-Amp (100mg/mL)瓊脂平板上的表型。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說(shuō)明。本發(fā)明所用主要試劑Trypton、YeastExtract、NaCl、瓊脂糖(Agrose)、 50XTris-acetate-EDTA(TAE)buffer(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，ADNA/ HindIII DNA marker、X_gal、IPTG(天根生物工程北京有限公司)，T4DNA Polymerase、 Klenow Fragment、T4 DNA Ligase、Premix Ex Taq Version 2· O, dNTP (3· 2 μ mol)(大連寶生物工程有限公司)，Sprit Blue Agar、三丁酸甘油酯、Tween80、對(duì)硝基苯酯、乙腈 (Sigma-Aldrich，美國(guó))，PCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。本發(fā)明所用主要菌株、載體和培養(yǎng)基E. coli DH5a (大連寶生物工程有限公司)，pUC19(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，LB培養(yǎng)基(含TryptoruO. 5% Yeast Extracts. 5%NaCl,pH7. 2,1. 5% agar), Sprit Blue Agar (SBA)選擇性培養(yǎng)基(含
三丁酸甘油酯、0.05% Tween 80)。本發(fā)明所用主要儀器設(shè)備Mili-Q超純水儀(Millipore Billerica，美國(guó))，酶標(biāo)儀(Synergy 2，北京基因有限公司)，超聲波細(xì)胞粉碎儀(YJ92-IIN，寧波新芝生物科技股份有限公司)，SMA4000UV-Spectrophotometer(Merinton技術(shù)有限公司，北京)，核酸電泳儀(Model No. PowerPac basic)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RAD Molecular Imager GEL DoctmXR+) (Bio-RAD,美國(guó))，PCR 儀(Mastercycler ，Eppendorf，德國(guó))。離心機(jī)(5810R， Eppendorf 德國(guó))。實(shí)施例1采用無(wú)菌水系列梯度稀釋法，將無(wú)色桿菌涂布于SBA選擇性培養(yǎng)基，涂布100 μ 1/ 瓊脂平板(90mm直徑)，涂布后的平板倒置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天。挑取SBA選擇性培養(yǎng)基上有較大透明圈的菌落，于SBA選擇性培養(yǎng)基純化兩次后，加入終濃度為20%的甘油后置于-40°C保存。酶活性測(cè)定對(duì)硝基苯酯乙腈轉(zhuǎn)化為對(duì)硝基苯酚
配制IOmM對(duì)硝基苯酯乙腈溶液作為底物溶液；配制反應(yīng)溶液lmL底物溶液、 4mL無(wú)水乙醇、95mL 50mM Tris-Hcl (pH 8. 5)。接種分離菌株于5mL LB液體培養(yǎng)基，37°C， 160rpm震蕩培養(yǎng)16-l i、5000g離心lOmin，取上清液50 μ L加入150 μ L上述反應(yīng)溶液中， 45°C反應(yīng)條件下用酶標(biāo)儀測(cè)定405nm處吸光值，測(cè)定時(shí)間為20min，每Imin測(cè)定一次，記錄吸光值變化；制備對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，將羧酸酯酶Imin釋放1 μ mol的對(duì)硝基苯酚的量定義為一個(gè)酶活單位；采用BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒(BCA Protein Assay Kit，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)測(cè)定培養(yǎng)上清液的總蛋白含量。取其中一株羧酸酯酶酶活性為0. lU/mg總蛋白的菌株建立基因組DNA文庫(kù)。實(shí)施例2分離菌株16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定和分析基因組DNA的提取接種分離實(shí)施例1得到的菌株于5mL LB液體培養(yǎng)基，37°C， 160rpm震蕩培養(yǎng)16_18h，12000g離心Imin收集菌體，吸棄上清。采用Biospin細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒(杭州博日科技有限公司)，提取基因組DNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。采用0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的基因組DNA，采用SAM 4000Spectrophotometer 測(cè)定DNA濃度。提取的基因組DNA模板置于-20°C備用。16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系(總體系25 μ L)無(wú)菌水 9· 5μ L ;2xPremix Ex Taq (Version 2· 0) 12. 5 μ L ；弓| 物 27F(5 μ mol/ L,引物序列 5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)1 μ L ；弓丨物 1492R(5 μ mol/L,引物序列 5，-TACCTTGTTACGACTT-3，) 1 μ L ；DNA 模板 1 μ L。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如下95°C預(yù)變性5min ；后經(jīng)過(guò)25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括 94°C, 30s, 58°C, 30s, 72°C, 120s ；最后 72°C延伸 5min ；4°C保存。采用 0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物DNA序列的測(cè)定與分析PCR產(chǎn)物的DNA序列由國(guó)家人類(lèi)基因組南方中心測(cè)定。采用 BioEdit (Version 7. 0. 9，http //www, mbio. ncsu. edu/BioEdit)軟件進(jìn)行 DNA原始數(shù)據(jù)的處理和正反雙向序列的拼接，拼接的Contig序列長(zhǎng)1430bp，以Fasta格式與 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)(http //www, ncbi. nlm. nih. Rov/Entrez)中的序列進(jìn)行 BLASTN 比對(duì)分析。發(fā)現(xiàn)與無(wú)色桿菌A. piechaudii (EU129469. 1) 16SrRNA序列具有99%的核苷酸序列相似性。實(shí)施例3基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建及陽(yáng)性克隆的篩選基因組DNA小片段的回收經(jīng)超聲法剪接的基因組DNA，進(jìn)行0. 7%瓊脂糖凝膠電泳；在紫外燈下切下約2-61Λ的DNA片段，計(jì)算凝膠重量；采用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒 [愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司]，回收DNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作?；蚪MDNA 片段與載體的連接采用 T4DNA Polymerase DNA(2_5U/ul)和 Klenow Fragment (2-5U/ul)(大連寶生物工程有限公司)補(bǔ)平DNA片段末端，根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。連接反應(yīng)體系(總體系20 μ L)無(wú)菌水 8 μ L ； 10XT4DNA Ligase Buffer2 μ L ；DNA 載體 DNA 1 μ L ； T4DNA Ligase (350U/μ 1) 2 μ L，16°C 反應(yīng)過(guò)夜。重組載體的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性重組子的篩選DNA連接液1 μ L，加入含有100 μ L Ε. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞[天根生物工程(北京]有限公司]離心管中，冰浴30min，根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。取100 μ L轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)夜涂布于含有三丁酸甘油酯、Tween 80的選
5擇性SBA-氨芐青霉素(Amp，100mg/mL)瓊脂平板，平板涂布40 μ L X-gal (20mg/mL)和 16 μ L IPTG(50mg/mL)，37°C培養(yǎng)48h，結(jié)果在SBA-Amp選擇性瓊脂平板上篩選到有透明圈(降解三丁酸甘油酯、TweenSO產(chǎn)生的透明圈)的陽(yáng)性克隆2個(gè)，分別命名為E. coli DH5 α (pCaEsSH01-l)(如圖 1)，Ε· coli DH5 α (pCaEsSHOl—2)。制備Ε. coli DH5 α (pCaEsSHOl-1)過(guò)夜培養(yǎng)液，5000g離心IOmin收集菌體，采用超聲法破碎細(xì)胞，于4°C、25000g離心25min，棄沉淀，取50 μ L上清液進(jìn)行酶活性分析。 將羧酸酯酶Imin釋放1 μ mol的對(duì)硝基苯酚的量定義為一個(gè)酶活單位，經(jīng)測(cè)定，E. coli DH5 α (pCaEsSHOl-1)羧酸酯酶酶活為0. 05U/mg總蛋白，具有較高的酶活性。實(shí)施例4陽(yáng)性重組子DNA克隆片段的序列測(cè)定及分析接種陽(yáng)性克隆E. coli DH5a (pCaEsSHOl-1)于 5mL LB-Amp 液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，于12000g離心lmin，收集菌體，吸棄上清。采樣質(zhì)粒抽提試劑盒[寶生物工程 (大連)有限公司]，抽提重組質(zhì)粒pCaEsSHOl-lDNA，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的DNA。采用基因步行法，對(duì)重組質(zhì)粒pCaEsSHOl-Ι上外源DNA插入片段的全長(zhǎng)DNA序列進(jìn)行了測(cè)定，獲得了插入片段全長(zhǎng)DNA序列。采用BLASTX軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行了比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其中780bp序列(序列如SEQ ID No. 1所示)與數(shù)據(jù)庫(kù)中 Burkholderia sp. JV3bioH基因(YP_004794414. 1)具有96%氨基酸序列的相似性，是一種新型的雙功能羧酸酯酶。為進(jìn)一步驗(yàn)證，將SEQ ID No. 1的長(zhǎng)度為780bp核苷酸功能片段(可根據(jù)核苷酸序列人工合成并擴(kuò)增，或者從重組質(zhì)粒pCaEsSHOl-Ι上擴(kuò)增)與載體連接并用重組載體轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(方法同實(shí)施例3)。采用與實(shí)施例3同樣的鑒定方法，在SBA-Amp選擇性瓊脂平板上篩選到有透明圈的陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性的重組Ε. coli DH5 α過(guò)夜培養(yǎng)液，5000g離心IOmin收集菌體，采用超聲法破碎細(xì)胞，于4°C下25000g離心25min，棄沉淀，取50 μ L上清液進(jìn)行酶活性分析。將羧酸酯酶Imin釋放1 μ mol的對(duì)硝基苯酚的量定義為一個(gè)酶活單位，經(jīng)測(cè)定，重組子的羧酸酯酶酶活為0. 04 0. 07U/mg總蛋白，具有較高的酶活性。從實(shí)施例4可知，具有SEQ ID No. 1序列的DNA片段，可編碼具有259個(gè)氨基酸序列的雙功能羧酸酯酶，所編碼的蛋白可將對(duì)硝基苯酯乙腈轉(zhuǎn)化為對(duì)硝基苯酚，說(shuō)明不僅具有硫酯酶和酰基轉(zhuǎn)移酶的活性(即ApBioH在生物素生物合成途徑中的活性，同時(shí)還具有羧酸酯酶酶活性)。
權(quán)利要求
1.一種羧酸酯酶基因，其特征在于，其核苷酸序列包括SEQ ID No. 1所示的序列。
2.權(quán)利要求1所述一種羧酸酯酶基因，其特征在于，是編碼SEQID No. 2所示蛋白的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1所述一種羧酸酯酶基因，其特征在于，其核苷酸序列為SEQID No. 1。
4.一種羧酸酯酶，其特征在于，其氨基酸序列包括SEQ ID No. 2所示的序列。
5.權(quán)利要求4所述一種羧酸酯酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No. 2所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，提取無(wú)色桿菌基因組DNA，利用功能驅(qū)動(dòng)的篩選策略和基因克隆技術(shù)，提供了一種雙功能羧酸酯酶基因，其核苷酸序列包括SEQ ID No.1所示的序列；其編碼的蛋白是一種雙功能羧酸酯酶，具有硫酯酶和酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，其氨基酸序列包括SEQ ID No.2所示的序列。本發(fā)明填補(bǔ)了我國(guó)在該領(lǐng)域研究的空白，為我國(guó)酶制劑的發(fā)展及其在食品、化工工業(yè)，以及硝基苯酚類(lèi)毒性污染物降解中的應(yīng)用提供了新基因資源。
文檔編號(hào)C12N15/55GK102559719SQ20121001916
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者時(shí)玉萍, 李柏林, 歐杰, 潘迎捷, 陳蘭明, 陳興華 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)