一種羧酸酯酶基因dsRNA及其在防治麥長管蚜中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種羧酸酯酶基因dsRNA及其在防治麥長管蚜中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的dsRNA，為由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。實驗證明，飼喂羧酸酯酶基因dsRNA后，麥長管蚜羧酸酯酶基因有不同程度的降低，說明麥長管蚜通過口針攝入的dsRNA進(jìn)入了麥長管蚜的細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了RNAi級聯(lián)反應(yīng)，目的基因的表達(dá)受到了干擾。在形態(tài)學(xué)角度來看，麥長管蚜的生長狀態(tài)均發(fā)生了變化，飼喂羧酸酯酶基因dsRNA的麥長管蚜的蛻皮指數(shù)比對照顯著降低。這表明羧酸酯酶基因dsRNA可以用于麥長管蚜的防治，本發(fā)明為下一步利用植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)創(chuàng)建小麥新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】一種羧酸酯酶基因 dsRNA及其在防治麥長管蚜中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種羧酸酯酶基因 dsRNA及其在防治麥長管蚜中 的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 小麥?zhǔn)俏覈闹饕Z食作物。小麥田內(nèi)害蟲種類很多，主要害蟲有地下害蟲、小 麥吸漿蟲、麥蚜、麥蜘蛛、食葉的粘蟲等，其中麥蚜對小麥的危害最為嚴(yán)重。麥蚜屬同翅目 蚜科，俗稱膩蟲、由汗、蜜蟲等，是我國小麥上的主要害蟲之一。其種類主要包括麥長管蚜 (Sitobion avenae)、麥二叉蟲牙（Schizaphis graminum)、禾谷溢管蟲牙（Rhopalosiphum padi Linnaeus)、麥無網(wǎng)長管姆（Acyrthosiphon dirhodum)等。麥長管姆、麥二叉姆和禾谷纟益管 蚜在世界各個地區(qū)廣泛分布，我國小麥種植區(qū)內(nèi)均有發(fā)生。麥二叉蚜主要分布在西北、華北 地區(qū)，麥長管蚜危害南北麥區(qū)，禾谷縊管蚜在南方地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重。麥蚜的發(fā)生受氣候影響較 大，在小麥生不同的生長期內(nèi)，麥蚜的危害優(yōu)勢種有所不同，在小麥拔節(jié)期，麥二叉蚜種群 密度大，到達(dá)抽穗期，麥長管蚜逐漸變?yōu)閮?yōu)勢種，麥二叉蚜與麥長管蚜混合發(fā)生，小麥抽穗 以后，禾谷縊管蚜發(fā)生嚴(yán)重。
[0003] 麥蚜以若蚜、成蚜聚集在小麥葉片、莖干，吸食小麥汁液，造成小麥葉片出現(xiàn)黃斑 或枯萎，在苗期危害嚴(yán)重時造成小麥苗枯死，后期危害穗部，造成小麥籽粒干癟，使小麥品 質(zhì)變劣，產(chǎn)量降低。麥蚜排出的廢物覆蓋在葉片上使葉片變黑，光合作用受到嚴(yán)重影響。此 夕卜，麥姆還分泌毒素，傳播病害，嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)。因麥姆的危害造成小麥減產(chǎn)一 般在10% -20%，麥蚜危害嚴(yán)重時小麥減產(chǎn)量達(dá)到30%。麥蚜還可以傳播小麥與大麥黃矮 病毒，使小麥產(chǎn)量降低。
[0004] RNAi的基本過程包括起始階段和效應(yīng)階段。在起始階段，dsRNA穿過細(xì)胞膜進(jìn)入 細(xì)胞后，細(xì)胞質(zhì)中的一種RNA酶III家族的內(nèi)切酶Dicer酶特異識別dsRNA，Dicer酶將dsRNA 切割成許多 21bp_23bp 的小片段（small interference RNA，siRNA)，每個 siRNA 都有 2 個突出的核苷酸。效應(yīng)階段，siRNA與一個酶復(fù)合物形成一種沉默復(fù)合物（RNA-indueed sileneeing eomplex，RISC)。在ATP存在的前提下，攜帶的雙鏈siRNA被RISC變成單鏈 siRNA分子，變成具有活性的RISC(Slicer)。之后Slicer與外源性基因表達(dá)的mRNA分子結(jié) 合，RISC在結(jié)合部位開始切割mRNA。切割后的mRNA誘導(dǎo)細(xì)胞降解這些mRNA片段。siRNA還 能引導(dǎo)目的RNA結(jié)合RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)，合成新的 dsRNA， 然后由Dicer酶切割產(chǎn)生新的siRNA，又引發(fā)新一輪的合成切割過程，沉默信號逐漸擴(kuò)大。 [0005] 目前常用的dsRNA導(dǎo)入的方法有注射法、浸泡法、飼喂法、組織培養(yǎng)法、植物介導(dǎo) 法等。注射法是通過顯微注射儀將dsRNA導(dǎo)入到昆蟲體內(nèi)，是目前最常用的方法。這種方 法既有優(yōu)點又有缺點，優(yōu)點是效率高，缺點是體外合成保存dsRNA成本高，難以避免注射的 傷口影響昆蟲生長。浸泡法是用dsRNA溶液浸泡昆蟲組織或細(xì)胞，可以有效地抑制基因表 達(dá)。浸泡法有一定的局限性，只適合于昆蟲一定的發(fā)育階段和易吸收dsRNA的細(xì)胞組織， 在研究中應(yīng)用較少。飼喂法操作方便且簡單，對昆蟲的影響小。喂食dsRNA在許多昆蟲中 都取得了成功，例如半翅目、鱗翅目、鞘翅目昆蟲。組織培養(yǎng)法將dsRNA混入培養(yǎng)基，昆蟲 細(xì)胞從培養(yǎng)基里吸收dsRNA。目前利用這種方法取得成功的昆蟲有果蠅、埃及伊蚊、白紋伊 蚊。這種方法要求的培養(yǎng)基條件嚴(yán)格，不容易培養(yǎng)得到符合要求的細(xì)胞，對這種方法的使用 受一定限制。轉(zhuǎn)基因植物介導(dǎo)法是借助植物持續(xù)不斷的產(chǎn)生穩(wěn)定的dsRNA，昆蟲持續(xù)取食 這種植物會不斷的攝入dsRNA。但是這種方法也有一定的局限性，不同昆蟲或同一昆蟲的 不同基因?qū)νㄟ^口腔進(jìn)入的RNAi的敏感性不同，影響喂食dsRNA的成功率的關(guān)鍵因素是昆 蟲的上皮細(xì)胞攝入dsRNA的效率。Walshe等發(fā)現(xiàn)利用喂食方法可以抑制刺舌蠅（Glossina morsitans morsitans)中腸表達(dá)TsetseEP,卻不能抑制脂肪體的傳遞蛋白基因2A192的表 達(dá)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種羧酸酯酶基因（CarE基因）dsRNA及其在防治麥長管蚜 中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所提供的dsRNA，具體為由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序 列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。
[0008] 編碼所述dsRNA的DNA分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0009] 所述DNA分子的核苷酸序列具體為序列表中序列2。
[0010] 含有所述DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因系細(xì)胞系也屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0011] 所述dsRNA、或所述DNA分子、或所述表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因系細(xì)胞 系，在如下（al)_(a4)任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0012] (al)防治麥長管蚜或制備防治麥長管蚜的產(chǎn)品；
[0013] (a2)抑制麥長管蚜生長或制備抑制麥長管蚜生長的產(chǎn)品；
[0014] (a3)降低麥長管蚜蛻皮指數(shù)或制備降低麥長管蚜蛻皮指數(shù)的產(chǎn)品；
[0015] (a4)抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達(dá)或制備抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達(dá)的 產(chǎn)品。
[0016] 進(jìn)一步，所述應(yīng)用為將所述dsRNA導(dǎo)入麥長管蚜，從而實現(xiàn)防治麥長管蚜、抑制麥 長管蚜生長、降低麥長管蚜蛻皮指數(shù)或抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達(dá)。
[0017] 在本發(fā)明中，所述導(dǎo)入的方式具體為飼喂。
[0018] 更加具體的，所述飼喂為：將所述dsRNA混合于液體飼料中，得到混合液；用所述 混合液飼喂麥長管蚜；所述dsRNA在所述混合液中的終濃度具體為20ng/μ L。
[0019] 所述飼喂持續(xù)的時間可為6天以上，具體如6天。
[0020] 在本發(fā)明中，所述麥長管蚜具體為4齡至成蟲期的麥長管蚜，具體如4齡麥長管蚜 或麥長管姆成蟲。
[0021] 活性成分為如下A-C中任一種的產(chǎn)品也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0022] A、所述 dsRNA;
[0023] B、所述DNA分子；
[0024] C、所述表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因系細(xì)胞系；
[0025] 所述產(chǎn)品具有如下（al)-(a4)功能中的至少一種：
[0026] (al)防治麥長管蚜；
[0027] (a2)抑制麥長管蚜生長；
[0028] (a3)降低麥長管蚜蛻皮指數(shù)；
[0029] (a4)抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達(dá)。
[0030] 另外，抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達(dá)的物質(zhì)，在如下（al)_(a3)任一中的應(yīng)用 同樣屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0031] (al)防治麥長管蚜或制備防治麥長管蚜的產(chǎn)品；
[0032] (a2)抑制麥長管蚜生長或制備抑制麥長管蚜生長的產(chǎn)品；
[0033] (a3)降低麥長管蚜蛻皮指數(shù)或制備降低麥長管蚜蛻皮指數(shù)的產(chǎn)品。
[0034] 本發(fā)明將麥長管蚜CarE基因 dsRNA (序列1)采用體外飼喂的方法飼喂麥長管蚜， 實際上是利用RNAi技術(shù)對CarE基因的表達(dá)進(jìn)行干擾。結(jié)果顯示，從mRNA水平上檢測飼喂 后的麥長管蚜CarE基因有不同程度的降低，說明麥長管蚜通過口針攝入的dsRNA進(jìn)入了麥 長管蚜的細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了 RNAi級聯(lián)反應(yīng)，目的基因的表達(dá)受到了干擾。在形態(tài)學(xué)角度來看， 麥長管蚜的生長狀態(tài)均發(fā)生了變化，飼喂CarE基因 dsRNA的麥長管蚜的蛻皮指數(shù)比對照降 低。這表明CarE基因 dsRNA可以用于麥長管蚜的防治，本發(fā)明為下一步利用植物介導(dǎo)的 RNAi技術(shù)創(chuàng)建小麥新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖1為麥長管蚜總RNA的提取結(jié)果。
[0036] 圖2為麥長管蚜羧酸酯酶基因（CarE基因）cDNA片段的PCR擴(kuò)增。M為標(biāo)準(zhǔn)DNA marker ; 1 為 CarE 基因。
[0037] 圖3為體外轉(zhuǎn)錄所得麥長管蚜CarE基因 dsRNA和GFP基因 dsRNA的瓊脂糖凝膠 電泳結(jié)果。M :D2000plus ;1 :麥長管蚜CarE基因體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物dsRNA ;2 :GFP基因體外轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物dsRNA ;可以看到，得到目的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0038] 圖4為不同齡期麥長管蚜CarE基因的表達(dá)量分析。其中，L1-L4為1-4齡麥長管 蟲牙幼蟲，Adult為麥長管蟲牙成蟲。圖中，*表示P〈0. 05, **表示P〈0. 01。
[0039] 圖5為不同濃度的dsCarE飼喂麥長管蚜后CarE基因的表達(dá)水平分析。圖中，*表 示 Ρ〈0· 05, ** 表示 Ρ〈0· 01。
[0040] 圖6為飼喂dsCarE后不同處理組中麥長管蚜的存活率統(tǒng)計。圖中，*表示Ρ〈0. 05， ** 表示 Ρ〈〇· 01。
[0041] 圖7為飼喂dsCarE 6天后不同處理組中麥長管蚜的蛻皮指數(shù)統(tǒng)計。圖中，*表示 Ρ〈0· 05, ** 表示 Ρ〈0· 01。
[0042] 圖8為飼喂dsCarE 6天后不同處理組中麥長管蚜CarE基因的表達(dá)水平分析。圖 中，* 表示 P〈〇. 05, ** 表示 P〈0. 01。

【具體實施方式】
[0043] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0044] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0045] 麥長管姆（Sitobion avenae):從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實驗站小麥試驗田獲得，按 照"王春芝，3種小麥蚜蟲的形態(tài)識別與防治技術(shù)，農(nóng)技服務(wù)，2008, 25 (3) :50, 58" 一文記載 的方法，鑒定證實確為麥長管姆（Sitobion avenae)。其形態(tài)學(xué)特征如下：無翅孤雌姆體長 3. 1mm，寬1.4mm，長卵形，草綠色至橙紅色，有時頭部帶紅色或褐色，腹部兩側(cè)有不明顯的灰 綠至灰黑色斑。觸角黑色，第3節(jié)有8 -12個感覺圈排成一行。腹部第6-8節(jié)及腹面具橫 網(wǎng)紋，無緣瘤。喙粗大，黑色，長度超過中足基節(jié)。腹管長圓筒形，黑色，長為體長的1/4,在 端部有十幾行網(wǎng)紋。有翅孤雌蚜體長3. Omm，橢圓形，綠色。喙不達(dá)中足基節(jié)。腹管長圓筒 形，黑色，端部具15?16行橫行網(wǎng)紋，尾片長圓錐狀，有8?9根毛。若蚜體綠色，有時粉紅 色，復(fù)眼紅色，一般體較短。麥長管姆的飼養(yǎng)條件是：溫度（22±1)°C，光周期16 L : 8 D， 相對濕度控制在85 % -90 %。用溫水浸泡小麥種子4h-8h，然后將小麥種子種在直徑8cm， 高為12cm的花盆中，放在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（溫度22±1°C，光周期16 L : 8 D，RH 85% -90% )。待5天后，小麥葉片長出約5cm時在小麥上接蚜蟲。
[0046] pEGAD質(zhì)粒：GenBank N0:AF218816. 1，購于美國俄亥俄州立大學(xué)。在文獻(xiàn)"Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency" Proc Natl Acad Sci USA. 97(7)，3718-3723(2000) 中報道過。
[0047] 總 RNA 提取試劑 TRIzol，F(xiàn)astQuant RT Kit (With gDNase)，PCR 產(chǎn)物純化試劑 盒，質(zhì)粒小提試劑盒、突光定量試劑SuperReal PreMix(SYBR Green)均購自天根生化科技 (北京）有限公司。T 載體 PMDl9-T Simple Vector、Ex Taq? 購自 TaKaRa。?7 RiboMAX expression RNAisystem購自promega。2 X Taq MasterMix購自北京艾德萊生物科技有限 公司。乙醇、異丙醇均為國產(chǎn)試劑。
[0048] 麥長管蚜的人工飼料：制備過程可參考文獻(xiàn)"李彩霞，高麗鋒，高玲玲，李 潤植.全純?nèi)斯I養(yǎng)液飼養(yǎng)蚜蟲的研究.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1997, 17(3) :225-228. Li C X, Gao L F, Gao L L, Li R Z. Study on the rearing of aphids on a artificially holidic diets. Journal of Shanxi Agricultural University, 1997, 17(3):225-228. (in Chinese) "進(jìn)行，用0. 2 μ m的細(xì)菌過濾器過濾人工飼料，分裝到2. 0 mL滅菌的離心管保存 于-20°C的冰箱中，避免反復(fù)凍融。
[0049] 實施例1、麥長管蚜羧酸酯酶基因 dsRNA的獲得
[0050] -、麥長管蚜總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
[0051] 1、總 RNA 提取
[0052] 1)取50頭麥長管姆放入無 RNA酶的I. 5 mL EP離心管中，加入60 μ LTrizol Reagent,用電動研磨器研磨至勻楽狀態(tài)；
[0053] 2)取出1-2 μ L總RNA進(jìn)行L 5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時用NanoDrop測定 260/280吸光值、260/230吸光值和核酸濃度，剩余的放于-80°C備用。
[0054] 結(jié)果如圖1所示，可見提取的總RNA比較完整，總RNA的5S、18S、28S條帶比較清 晰，RNA未降解。
[0055] 2、反轉(zhuǎn)錄
[0056] 按反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作，操作如下：
[0057] (1)配制基因組 DNA 去除體系混合液：5 X gDNA buffer 2 μ 1 ;總 RNAl μ g ;RNase free ddH20 補(bǔ)足 10 μ 1。
[0058] 42°C孵育3min，冰上放置。
[0059] (2)配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系混合液：RT Enzyme Mix 1 μ I ;10XFast RT buffer 2μ I ;FQ_RT Primer Mix 2μ I ;RNasefree ddH20 補(bǔ)足 10μ 1。
[0060] (3)將步驟⑴配得的混合液加入步驟⑵中配得的混合液中，充分混勻。42°C孵 育15min之后95°C孵育3min。將反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA存放于-20°C保存。
[0061] 二、含有麥長管蚜羧酸酯酶基因片段的重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0062] 根據(jù)棉蚜的羧酸酯酶基因（CarE基因）（GenBank登錄號：EU783916. 1)序列設(shè)計 引物，引物如下：
[0063] 引物 CarE-F :5' -TACCCTACGCTCAACCAC-3'（序列 5 的第 1-18 位）；
[0064] 引物 CarE-R :5' -GAACAGACGCTGATCCTG-3'（序列 5 的第 469-486 位的反向互補(bǔ)序 列）。
[0065] 以步驟一反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，采用引物CarE-F和CarE-F進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反 應(yīng)條件是：94°C 3min ;94°C 30s、55°C 30s、72°C 40s，38 個循環(huán)；72°C lOmin。
[0066] 將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。如圖2所示，可見PCR產(chǎn)物大小約為486bp。 將PCR產(chǎn)物膠回收后與pMD19-T Simple Vector相連，得到重組質(zhì)粒，命名為pMD19-CarE。 測序表明，重組質(zhì)粒pMD19_CarE在pMD19_T Simple Vector的缺口處連入了序列表中序列 5所示DNA片段。
[0067] 三、麥長管蚜羧酸酯酶基因 dsRNA的獲得
[0068] 1、引物的設(shè)計
[0069] 體外合成dsRNA需要帶有T7序列的引物，利用Primer5. 0設(shè)計并合成如下引物：
[0070] 針對CarE基因的引物對如下：
[0071] dsCarEFt :5' -TAATACGACTCACTATAGGGGATGGTCTGGAGTTTT-3' (無下劃線部分為序 列2的第1-17位）；
[0072] dsCarERt : 5 ' -TAATACGACTCACTATAGGGAACAGACGCTGATCCTG-3 '（無下劃線部分為 序列2的第410-427位的反向互補(bǔ)序列）。
[0073] 針對作為對照的GFP基因的引物對如下：
[0074] dsGFPFt : 5 ' -TAATACGACTCACTATAGGCACAAGTTCAGCGTGTCCG-3 '（無下劃線部分為 序列4的第1-19位）；
[0075] dsGFPRt :5 ' -TAATACGACTCACTATAGGGTTCACCTTGATGCCGTTC-3 '（無下劃線部分為 序列4的第402-420位的反向互補(bǔ)序列）。
[0076] 引物中標(biāo)有下劃線的序列為T7啟動子序列。
[0077] 2、合成DNA模版
[0078] 將步驟二所得重組質(zhì)粒pMD19_CarE稀釋成濃度為5ng/ μ 1，作為模板，用帶有T7 啟動子序列的引物對dsCarEFt/dsCarERt做PCR合成帶有Τ7序列的DNA。
[0079] 將pEGAD質(zhì)粒稀釋成濃度為5ng/l·! 1，作為模板，用帶有T7啟動子序列的引物對 dsGFPFt/dsGFPRt做PCR合成帶有T7序列的DNA。
[0080] PCR反應(yīng)體系：2XTaq Master Mix 10μ I ;ddH20 8 μ 1 ;上游引物 0· 5μ 1 ;下游引 物 〇. 5μ1 ;模板 Ιμ?。
[0081] 反應(yīng)條件：94°C 3min ;94°C 30s、53°C 30s、72°C 40s，38 個循環(huán)；72°C lOmin。
[0082] 反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，采用引物對dsCarEFt/dsCarERt 擴(kuò)增得到大小約為465bp的DNA片段，進(jìn)一步測序為"TAATACGACTCACTATAGG+序列 2+CCTATAGTGAGTCGTATTA"。采用引物對 dsGFPFt/dsGFPRt 擴(kuò)增得到大小約為 458bp 的 DNA 片段，進(jìn)一步測序為 "TAATACGACTCACTATAGG+ 序列 4+CCTATAGTGAGTCGTATTA"。
[0083] 3、合成 dsRNA
[0084] 以步驟2獲得的兩端帶有T7啟動子序列的DNA片段為模板，利用T7 RiboMAX expression RNAisystem(promega)試劑盒體外高效轉(zhuǎn)錄生成麥長管姆的dsRNA片段。
[0085] 體外轉(zhuǎn)錄的（T7RiboMax)反應(yīng)體系：RiboMaxTM Express T72 X bufferlO μ L ;DNA 模版 I U g ;Enzyme Mix 2 μ L ;RNase Free 水補(bǔ)充至 20 μ L。
[0086] I)將上述溶液輕輕混勻，置于37°C中金屬浴中孵育2hr-6hr ;
[0087] 2)孵育結(jié)束后將反應(yīng)液放于70°C水浴IOmin,緩慢降至室溫,約20min ;
[0088] 3)向冷卻至室溫的反應(yīng)液中加入1 μ L RQl RNase-Free DNase和1 μ L RNase Solution (RNase Solution 稀釋 200 倍）去除模板 DNA 和單鏈 RNA，37°C溫浴 30min ;
[0089] 4)加入與管中溶液等體積的3M醋酸鈉水溶液，冰浴5min ;
[0090] 5) 15000rpmin 離心 IOmin ;
[0091] 6)棄上清，用500 μ L 70% (體積分?jǐn)?shù)）乙醇洗兩次，棄上清，空氣中干燥15min， 加 50 μ L RNase Free 水溶解；
[0092] 7)將產(chǎn)物電泳檢測后，放于_80°C超低溫冰箱中保存。
[0093] 反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0094] 結(jié)果如圖3所示，M :D2000plus ;1 :麥長管蚜CarE基因體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物dsRNA ;2 : GFP基因體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物dsRNA ;可以看到，得到目的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0095] 將麥長管蚜CarE基因 dsRNA和GFP基因 dsRNA分別測序，結(jié)果如下：
[0096] 麥長管蚜CarE基因 dsRNA為雙鏈RNA，由正義鏈和反義鏈組成，其正義鏈的核苷酸 序列為序列表中的序列1，其反義鏈的核苷酸序列為序列表中的序列1的反向互補(bǔ)序列；
[0097] GFP基因 dsRNA為雙鏈RNA，由正義鏈和反義鏈組成，其正義鏈的核苷酸序列為序 列表中的序列3,其反義鏈的核苷酸序列為序列表中的序列3的反向互補(bǔ)序列。
[0098] 當(dāng)然，也可以直接人工合成序列1所示的麥長管蚜CarE基因 dsRNA和序列3所示 的GFP基因 dsRNA用于下述實施例。
[0099] 實施例2、麥長管蚜CarE基因 dsRNA在防治麥長管蚜中的應(yīng)用 [0100] 一、不同齡期麥長管蚜CarE基因的表達(dá)量分析
[0101] 在做飼喂實驗之前，挑取處于不同齡期的麥長管蚜分別檢測CarE基因的表達(dá)量。 每個齡期（1齡幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼蟲、4齡幼蟲和成蟲）選取20頭左右的蚜蟲提取總RNA 然后檢測基因表達(dá)量。
[0102] 利用Primer5. 0分別設(shè)計不同基因的熒光定量引物，熒光定量引物如下：
[0103] 用于檢測麥長管蚜CarE基因的引物：
[0104] CarERTF :5, -TCCTGGAAACGTGGGCTTGAA-3'（序列 2 的第 300-320 位）；
[0105] CarERTR :5' -AACAGACGCTGATCCTGCACTTT-3'（序列 2 的第 404-426 位的反向互補(bǔ) 序列）。
[0106] 用于檢測內(nèi)參基因 RpL7Actin的引物：
[0107] 內(nèi)參基因 RpL7ActinF :5' -CCGAAAAGCTGTCATAATGAAGACC-3' ；
[0108] 內(nèi)參基因 RpL7ActinR :5' -GGTGAAACCTTGTCTACTGTTACATCTTG-3'。
[0109] 采用的熒光定量試劑盒為SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)，所用的PCR反應(yīng) 體系為：2 X SuperReal PreMix Plus 10 μ L，50 X ROX Reference Dye 2 μ L，ddH20 5.8 μ L， 上游引物F 0. 6yL，下游引物0. 6yL，cDNA模板lyL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94°C 15min ; 94°〇1〇8,571：2〇8,721：3〇8,40個循環(huán)。每個樣本重復(fù)3次，最后結(jié)果用2-^"法（(^表示 循環(huán)數(shù)）進(jìn)行計算，AACt=(目的基因的Ct-內(nèi)參基因的目的基因的Ct-內(nèi) 參基因的Ct)對照組，對照組是將1齡幼蟲的Δ Ct = Ct目的基因 _Ct _基因定乂為1. 0,其余齡期 作為實驗組，計算各組的平均值，進(jìn)行差異顯著性分析。
[0110] 結(jié)果如圖4所示，可以看出，4齡、成蟲的CarE基因表達(dá)量顯著高于其他齡期 (P〈0. 05)，說明從若蟲到成蟲，麥長管蚜的CarE基因的表達(dá)量逐漸升高，到若蟲末齡和成 蟲期CarE基因表達(dá)量達(dá)到高峰，CarE的解毒作用最強(qiáng)。后續(xù)試驗中采用4齡麥長管蚜作 為研究對照。
[0111] 二、dsRNA的飼喂及最佳飼喂?jié)舛鹊拇_定
[0112] 1、麥長管蚜的dsRNA飼喂方法
[0113] 飼喂麥長管蚜?xí)r采用的是兩端開口直徑為2-3. 5cm、長度為3-4cm的玻璃通管。將 Parafilm膜截成I. 5cm2,用手拉展開膜覆蓋在玻璃管的一端，放在紫外燈下照射15分鐘，然 后在Parafilm膜表面加上150 μ L的人工飼料或者是人工飼料與dsRNA的混合液，再在其上 面另覆蓋一層Parafilm膜。將麥長管蚜放入管內(nèi)，玻璃管的另一端用細(xì)棉紗網(wǎng)封住以防止 蚜蟲逃逸。將玻璃管放到光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，溫度22°C ±1°C，相對濕度為85%?90%， 光周期16 : 8(L : D)。選用同齡的蚜蟲為供試群體，饑餓4小時左右后接入玻璃管內(nèi)，每 管內(nèi)接麥長管蚜15頭，每個處理重復(fù)2管，實驗重復(fù)3次。
[0114] 2、飼喂?jié)舛鹊拇_定
[0115] 為了確定比較合適的CarE基因 dsRNA的飼喂?jié)舛龋炔捎萌齻€不同濃度的dsRNA 飼喂麥長管蚜（4齡幼蟲），飼喂實驗在飼喂6天后檢測基因的表達(dá)量（具體操作參見步驟 一）。采用三組不同的CarE基因 dsRNA終濃度分別為Srig/yLaOng/uLdOng/yL(以 5ng/ μ L為例，為將CarE基因 dsRNA與人工飼料混合，形成混合液，CarE基因 dsRNA在所述 混合液中的終濃度為5ng/yL。其余濃度所表示含義以此類推）。在實驗中以相同濃度的 GFP基因 dsRNA的飼喂為對照。將IOng/ μ L GFP基因 dsRNA組的Λ Ct = Ct __-Ct _基 H定義為1. 〇,計算各組的平均值，進(jìn)行差異顯著性分析。
[0116] 結(jié)果顯示，采用三種不同濃度的CarE基因 dsRNA飼喂麥長管蚜?xí)r，與對照相比，麥 長管蚜的CarE基因表達(dá)量只有在20ng/μ L的濃度下才顯著降低（P〈0. 05)，所以在后續(xù)實 驗中采用20ng/ μ L這個濃度對麥長管蚜進(jìn)行RNA干擾實驗（圖5)。
[0117] 三、dsRNA飼喂后麥長管蚜存活率、蛻皮指數(shù)及CarE基因表達(dá)量的測定
[0118] 1、實驗方法
[0119] 以4齡麥長管蚜為研究對象，參照上文所述方法對其進(jìn)行dsRNA飼喂，dsRNA的 濃度選用20ng/ μ L，同設(shè)置3個處理，即CarE基因 dsRNA飼喂組（簡稱dsCarE)、GFP基 因 dsRNA飼喂組（簡稱dsGFP)、以及向人工飼料中加入等量的DEPCH2O的對照組。共飼喂 6天。用dsRNA飼喂蚜蟲后每天觀察麥長管蚜的生長狀態(tài)，記錄麥長管蚜的存活數(shù)和蛻皮 數(shù)。每天計算每個處理的麥長管蚜的存活率，飼喂6天后計算每個處理的麥長管蚜的蛻皮 指數(shù)。另外，飼喂6天后檢測每個處理的麥長管蚜CarE基因的表達(dá)量，其中AACt =(目 的基因的Ct-內(nèi)參基因的Ct) -(目的基因的Ct-內(nèi)參基因的Ct) ，將DEPCH2O對照 組的Λ Ct = Ct g_H-Ct _?Η定義為1. 0, dsCarE飼喂組和dsGFP飼喂組作為實驗組,計 算各組的平均值，進(jìn)行差異顯著性分析。
[0120] 計算公式如下：
[0121] 存活率=前一天的存活蟲數(shù)/當(dāng)天的存活蟲數(shù)X 100% ;
[0122] 蛻皮指數(shù)（Im) = Σ (蛻皮數(shù)/前一天的存活蟲數(shù)）。
[0123] 2、實驗結(jié)果
[0124] (1)麥長管蚜存活數(shù)
[0125] 結(jié)果顯示，在進(jìn)行飼喂試驗的6天時間內(nèi)，dsCarE處理組的麥長管蚜存活率均與 對照組相比差異不明顯（P>〇. 05)。分析原因可能有以下幾種：一是選取的干擾片段不能使 蚜蟲的數(shù)量迅速降低；二是選取的CarE基因片段翻譯的蛋白不是蚜蟲存活所必須的蛋白。 結(jié)果詳見圖6。
[0126] (2)麥長管蚜蛻皮指數(shù)
[0127] 結(jié)果顯示，dsCarE飼喂能顯著降低麥長管蚜的蛻皮指數(shù)（P〈0. 05)，阻礙麥長管 蚜的生長，dsCarE處理組麥長管蚜的蛻皮指數(shù)為I. 34±0. 05 (平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤），dsGFP 對照組的蛻皮指數(shù)為1.73±0. 07 (平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤），DEPCH2O對照組的蛻皮指數(shù)為 1.75±0. 10(平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤）。結(jié)果詳見圖7。
[0128] (3) CarE基因的表達(dá)量
[0129] 結(jié)果顯示，與對照相比，dsCarE處理組的麥長管蚜的CarE基因表達(dá)量降低，顯著 低于dsGFP處理組和DECH 2O對照組（P〈0. 05)。結(jié)果詳見圖8。
[0130] 本發(fā)明受農(nóng)業(yè)部行業(yè)項目"作物蚜蟲綜合防控技術(shù)研究和示范推廣（201103022) " 的支持。
【權(quán)利要求】
1. 一種dsRNA，為由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組 成的雙鏈RNA。
2. 編碼權(quán)利要求1所述dsRNA的DNA分子，其核苷酸序列為序列表中序列2。
3. 含有權(quán)利要求2所述DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因系細(xì)胞系。
4. 權(quán)利要求1所述的dsRNA、或權(quán)利要求2所述的DNA分子、或權(quán)利要求3所述的表達(dá) 盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因系細(xì)胞系，在如下（al)-(a4)任一中的應(yīng)用： (al)防治麥長管蚜或制備防治麥長管蚜的產(chǎn)品； (a2)抑制麥長管蚜生長或制備抑制麥長管蚜生長的產(chǎn)品； (a3)降低麥長管蚜蛻皮指數(shù)或制備降低麥長管蚜蛻皮指數(shù)的產(chǎn)品； (a4)抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達(dá)或制備抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達(dá)的產(chǎn)品。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述應(yīng)用為將權(quán)利要求1所述的dsRNA導(dǎo) 入麥長管蚜，從而實現(xiàn)防治麥長管蚜、抑制麥長管蚜生長、降低麥長管蚜蛻皮指數(shù)或抑制麥 長管蚜羧酸酯酶基因表達(dá)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述導(dǎo)入的方式為飼喂。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述飼喂為：將所述dsRNA混合于液體飼 料中，得到混合液；用所述混合液飼喂麥長管蚜； 所述dsRNA在所述混合液中的終濃度為20ng/ μ L ; 所述飼喂持續(xù)的時間具體為6天以上。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的應(yīng)用，其特征在于：所述麥長管蚜為4齡至成蟲期 的麥長管蚜。
9. 產(chǎn)品，其活性成分為如下A-C中任一種： Α、權(quán)利要求1所述的dsRNA ; B、 權(quán)利要求2所述的DNA分子； C、 權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因系細(xì)胞系； 所述產(chǎn)品具有如下（al)_(a4)功能中的至少一種： (al)防治麥長管蚜； (a2)抑制麥長管蚜生長； (a3)降低麥長管蚜蛻皮指數(shù)； (a4)抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達(dá)。
10. 抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達(dá)的物質(zhì)，在如下（al)_(a3)任一中的應(yīng)用： (al)防治麥長管蚜或制備防治麥長管蚜的產(chǎn)品； (a2)抑制麥長管蚜生長或制備抑制麥長管蚜生長的產(chǎn)品； (a3)降低麥長管蚜蛻皮指數(shù)或制備降低麥長管蚜蛻皮指數(shù)的產(chǎn)品。
【文檔編號】C12N15/63GK104293809SQ201410474665
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】趙章武, 梁榮奇, 鄧菲 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)