表達(dá)抑制麥長(zhǎng)管蚜脂蛋白酯酶的發(fā)卡rna的dna分子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表達(dá)抑制麥長(zhǎng)管蚜脂蛋白酯酶的發(fā)卡RNA的DNA分子及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的DNA分子的結(jié)構(gòu)為SEQ正向-X-SEQ反向，所述SEQ正向的序列為序列表中序列1的第21-563位；所述SEQ反向的序列與所述SEQ正向的序列反向互補(bǔ)；所述X是所述SEQ正向與所述SEQ反向之間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互補(bǔ)。實(shí)驗(yàn)證明，將所述DNA分子轉(zhuǎn)化小麥，獲得轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)行蚜蟲飼喂試驗(yàn)，麥長(zhǎng)管蚜食用轉(zhuǎn)基因葉片后，脂蛋白酯酶基因表達(dá)量和繁殖率下降。可見，本發(fā)明對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上害蟲的防治具有重要意義。
【專利說(shuō)明】表達(dá)抑制麥長(zhǎng)管蚜脂蛋白酯酶的發(fā)卡RNA的DNA分子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種表達(dá)抑制麥長(zhǎng)管蚜脂蛋白酯酶的發(fā)卡RNA的DNA分子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蚜蟲是小麥生產(chǎn)中的主要害蟲，主要有麥無(wú)網(wǎng)長(zhǎng)管蚜(Metopolophiumdirhodum),麥二叉姆(Schizaphis graminum),禾谷纟益管姆(Rhopalosiphum padi )和麥長(zhǎng)管蟲牙(Sitobion avenae),分布極廣,幾乎遍及世界各產(chǎn)麥國(guó)。姆蟲以成蟲、若蟲吸取小麥汁液危害小麥，排到葉片上的蜜露降低光合作用，并傳播多種病毒病，包括大麥黃矮病毒，導(dǎo)致小麥產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降。
[0003]目前，防治小麥蚜蟲或者其他害蟲主要還是依靠化學(xué)殺蟲劑，雖然在一定程度上能夠減少蟲害所帶來(lái)的產(chǎn)量下降，但是長(zhǎng)期的使用化學(xué)殺蟲劑不但費(fèi)用較高而且容易使蚜蟲產(chǎn)生相應(yīng)的抗性，同時(shí)導(dǎo)致蚜蟲天敵殺傷嚴(yán)重，環(huán)境污染加劇。
[0004]近年來(lái)，隨著蚜蟲抗藥性的增強(qiáng)，化學(xué)殺蟲劑的使用濃度和藥用量也呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。
[0005]RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。植物介導(dǎo)的dsRNA確可以長(zhǎng)效的抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，達(dá)到生產(chǎn)上控制害蟲的目的，這種利用植物表達(dá)與昆蟲特定基因匹配的雙鏈RNA分子，當(dāng)昆蟲取食這類植物后，其靶基因的表達(dá)被明顯降低，這種技術(shù)不僅為昆蟲的功能基因組研究提供了便捷的方法，也為農(nóng)業(yè)害蟲的防治提供了特異性更強(qiáng)且環(huán)境安全的新思路、新技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)抑制麥長(zhǎng)管蚜脂蛋白酯酶的發(fā)卡RNA的DNA分子及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明所提供的DNA分子具體為如式(I)所示的DNA片段:
[0008]SEQ正向-X-SEQ反向(I)
[0009]所述序列如序列表中序列I的第21-563位核苷酸所示；
[0010]所述SEQg的序列與所述序列反向互補(bǔ)(序列I的第1728-2270位)；
[0011]所述X是所述SEQ1^1與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQIE向及所述SEQ反向均不互補(bǔ)。
[0012]在本發(fā)明中，式(I)中所述X為FAD2內(nèi)含子序列,具體如序列表中序列2所
[0013]更加具體的，式(I)所示的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列I所示。
[0014]含有所述DNA片段的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。[0015]所述重組載體可為重組表達(dá)載體，也可為重組克隆載體。
[0016]在本發(fā)明中，所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子具體為rbcS啟動(dòng)子。
[0017]進(jìn)一步,所述rbcS啟動(dòng)子的序列如序列表中序列3所示。
[0018]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組表達(dá)載體具體為在pBAC-rbcs-sNTL載體的酶切位點(diǎn)插入序列I所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒(pBAC-rbcs-LPL);所述酶切位點(diǎn)具體為 Kpn I 和 BamH I。
[0019]由以上式(I)所示DNA片段編碼得到的RNA分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020]以上式(I)所示DNA片段，或所述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌，或所述RNA分子在如下al)_a4)任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:
[0021]al)抑制麥長(zhǎng)管蚜脂蛋白酯酶表達(dá)；
[0022]a2)降低麥長(zhǎng)管蚜的繁殖率；
[0023]a3)防治麥長(zhǎng)管蚜；
[0024]a4)培育抗麥長(zhǎng)管蚜的轉(zhuǎn)基因植物。
[0025]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種培育抗麥長(zhǎng)管蚜的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0026]本發(fā)明所提供的培育抗麥長(zhǎng)管蚜的轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下步驟:將以上式(I)所示DNA片段導(dǎo)入目的植物中，得到抗麥長(zhǎng)管蚜的轉(zhuǎn)基因植物；
[0027]所述抗麥長(zhǎng)管蚜具體體現(xiàn)`在如下bl) _b2)中的至少一種:`[0028]bl)抑制麥長(zhǎng)管蚜的脂蛋白酯酶表達(dá)；
[0029]b2)降低麥長(zhǎng)管蚜的繁殖率。
[0030]進(jìn)一步，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，al)和bI)中所述抑制麥長(zhǎng)管蚜的脂蛋白酯酶表達(dá)具體為使麥長(zhǎng)管蚜的脂蛋白酯酶編碼基因在RNA水平的表達(dá)量降低。
[0031]在上述方法中，以上式(I)所示DNA片段具體是以重組表達(dá)載體的形式導(dǎo)入所述目的植物中的；在本發(fā)明中，所述重組表達(dá)載體為以上所述pBAC-rbcs-LPL載體。更加具體的，是將所述pBAC-rbcs-LPL載體和pBAC35SIH3載體按照3: I的摩爾比混合后共轉(zhuǎn)化所述目的植物，從而實(shí)現(xiàn)將式(I)所示DNA片段導(dǎo)入所述目的植物。
[0032]在以上所述的應(yīng)用或方法中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物；在本發(fā)明中，所述植物為單子葉植物小麥，具體為小麥品種京花I號(hào)。在本發(fā)明中，所述麥長(zhǎng)管蚜具體為一齡麥長(zhǎng)管蟲牙。
[0033]本發(fā)明通過(guò)RT-PCR方法克隆了麥長(zhǎng)管蚜脂蛋白酯酶基因(SaLPL)片段，進(jìn)一步構(gòu)建了此基因片段的發(fā)夾RNAi構(gòu)件。將該構(gòu)件基因槍轟擊受體品種京花I號(hào)，獲得轉(zhuǎn)基因株系，對(duì)轉(zhuǎn)基因株系對(duì)麥長(zhǎng)管蚜脂蛋白酯酶基因的干擾效果和抗蟲性進(jìn)行分析，表明轉(zhuǎn)基因株系均能抑制麥長(zhǎng)管蚜脂蛋白酯酶基因的表達(dá)量，且對(duì)麥長(zhǎng)管蚜的繁殖率下降?？梢?，本發(fā)明對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上害蟲的防治具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1為麥長(zhǎng)管蚜總RNA的電泳檢測(cè)結(jié)果。其中，泳道1-4為四個(gè)重復(fù)，均為麥長(zhǎng)管蚜總RNA。
[0035]圖2為RT-PCR獲得SaLPL基因片段(約543bp)。其中，泳道M為DAN分子量標(biāo)準(zhǔn)2000bp DNA Ladder ;泳道1_3為PCR擴(kuò)增所得SaLPL基因片段。
[0036]圖3為pHurricane載體的質(zhì)粒圖譜。
[0037]圖4為重組質(zhì)粒pBSK-FAD2Il-LPL鑒定結(jié)果。其中，泳道M為DAN分子量標(biāo)準(zhǔn)IkpDNA Ladder ;泳道 I 用引物 SaLPL-sl 和 AtFAD2I9F 擴(kuò)增 pBSK_FAD2Il_LPL。
[0038]圖5為重組質(zhì)粒pBSK-LPL-R結(jié)果。其中，泳道M為DAN分子量標(biāo)準(zhǔn)2000bp DNALadder ;泳道 I 為用引物 SaLPL-sl 和 AtFAD2I9R 擴(kuò)增 pBSK-LPL-R。
[0039]圖6為pBAC-rbcs-sNTL載體的質(zhì)粒圖譜。
[0040]圖7為重組質(zhì)粒pBAC-rbcs-LPL的酶切鑒定結(jié)果。其中，泳道M為DAN分子量標(biāo)準(zhǔn)Ikp DNA Ladder ;泳道I為pBSK-LPL-R的Kpn I和BamH I酶切結(jié)果；泳道2為pBAC-rbcs-sNTL的Kpn I和BamH I酶切結(jié)果；泳道3為重組質(zhì)粒pBAC-rbcs-LPL的Kpn I和BamH I酶切結(jié)果。
[0041]圖8為重組表達(dá)載體pBAC-rbcs-LPL圖譜。
[0042]圖9為SaLPL的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥的PCR鑒定。其中，泳道M均為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000Marker ；泳道+均為陽(yáng)性對(duì)照pBAC-rbcs-LPL質(zhì)粒；泳道-均為陰性對(duì)照未轉(zhuǎn)基因小麥；泳道1-17均為轉(zhuǎn)基因植株，擴(kuò)增出目的條帶(箭頭處)的為陽(yáng)性植株。
[0043]圖10為SaLPL的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)麥長(zhǎng)管蚜羧酸酯酶基因表達(dá)量干擾效果分析結(jié)果。具體為麥長(zhǎng)管蚜取食轉(zhuǎn)基因小麥葉片5天后的檢測(cè)結(jié)果。
[0044]圖11為SaLPL的 RNAi轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)麥長(zhǎng)管蚜繁殖率的影響分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0045]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0046]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0047]麥長(zhǎng)管姆(Sitobion avenae):從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實(shí)驗(yàn)站小麥試驗(yàn)田獲得,按照“王春芝，3種小麥蚜蟲的形態(tài)識(shí)別與防治技術(shù)，農(nóng)技服務(wù)，2008，25 (3):50，58” 一文記載的方法，鑒定證實(shí)確為麥長(zhǎng)管姆(Sitobion avenae)。其形態(tài)學(xué)特征如下:無(wú)翅孤雌姆體長(zhǎng)
3.1_，寬1.4_，長(zhǎng)卵形，草綠色至橙紅色，有時(shí)頭部帶紅色或褐色，腹部?jī)蓚?cè)有不明顯的灰綠至灰黑色斑。觸角黑色，第3節(jié)有8-12個(gè)感覺圈排成一行。腹部第6-8節(jié)及腹面具橫網(wǎng)紋，無(wú)緣瘤。喙粗大，黑色，長(zhǎng)度超過(guò)中足基節(jié)。腹管長(zhǎng)圓筒形，黑色，長(zhǎng)為體長(zhǎng)的1/4，在端部有十幾行網(wǎng)紋。有翅孤雌蚜體長(zhǎng)3.0mm，橢圓形，綠色。喙不達(dá)中足基節(jié)。腹管長(zhǎng)圓筒形，黑色，端部具15~16行橫行網(wǎng)紋，尾片長(zhǎng)圓錐狀，有8~9根毛。若蚜體綠色，有時(shí)粉紅色，復(fù)眼紅色，一般體較短。
[0048]pHurricane載體:記載于“張付蕓，陳偉霞,劉子渲,李保云,梁榮奇.小麥SS I1-A基因片段的克隆及其RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27 (7):50_54”一文中的“H質(zhì)?！薄９娍蓮闹袊?guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0049]pBAC35SIH3載體:記載于“隋曉燕，趙琰，王樹彬等.無(wú)載體框架結(jié)構(gòu)的大豆鐵蛋白線性表達(dá)盒提高小麥籽粒鐵含量的研究.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，20(7):766~773”一文中，用于基因槍遺傳轉(zhuǎn)化后抗性愈傷組織的篩選。公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0050]小麥(Triticum aestivum L.)品種京花I號(hào):記載于“胡道芬，袁振東，湯云蓮等.植物細(xì)胞工程——冬小麥花培新品種京花I號(hào)的育成.中國(guó)科學(xué)(B輯化學(xué)生物學(xué)農(nóng)學(xué)醫(yī)學(xué)地學(xué))，1986年03期，第283-292頁(yè)” 一文。北京市農(nóng)林科學(xué)院作物研究所，用(洛夫林18號(hào)X5238-036) X紅良4號(hào)的雜交一代花粉培養(yǎng)選育而成。幼苗匍匐，葉片較寬，葉色深綠，分蘗力強(qiáng)，成穗率高，穗層整齊，多花多粒，穗粒數(shù)多，穗呈紡錘形、頂芒、白殼、白粒。京花I號(hào)屬冬性，中晚熟品種?？共⌒詮?qiáng)，高抗條銹、葉銹和桿銹。抗干熱風(fēng)能力強(qiáng)，葉片功能期長(zhǎng)，后期落黃好?？购陨圆?，桿較弱，倒伏較重。公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0051]實(shí)施例1、表達(dá)抑制麥長(zhǎng)管蚜脂蛋白酯酶的發(fā)卡RNA的DNA分子的獲得
[0052]一、麥長(zhǎng)管蚜脂蛋白酯酶基因SaLPL目的片段獲得
[0053]設(shè)計(jì)如下引物:
[0054]SaLPL-sl:5’ -CCTGTTCCTGAGAGGCGTCT-3’(序列 I 的第 21-40 位)；
[0055]SaLPL-al:5’-GCAACACCAGCTGAAAACGCTACTC-3’(序列 I 的第 539-563 位的反向互補(bǔ)序列)。
[0056]擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為543bp。
[0057]取5齡麥長(zhǎng)管蚜成蟲，按照美萊博RNA提取試劑盒提取總RNA (圖1)。圖中，28S、18S都很清晰，說(shuō)明提取的總RNA可以用于RT-PCR。利用該總RNA、引物Pl-R和Pl-F進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性 5min ；94°C 40s, 55°C 40s, 72°C 90s, 33 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸IOrnin0
[0058]結(jié)果顯示，得到543bp左右的麥長(zhǎng)管蚜脂蛋白酯酶基因SaLPL目的片段(圖2)，將該目的片斷從瓊脂糖膠回收后連到pGEM-Teasy載體(promega公司)上,熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切鑒定及測(cè)序。
[0059]將經(jīng)測(cè)序表明在pGEM-Teasy載體上連入序列I的第21-543位的重組質(zhì)粒命名為pTE-LPL。
[0060]二、重組表達(dá)載體pBAC-rbcs-LPL的構(gòu)建及鑒定
[0061]1、目的片段正向插入FAD2 Intronl的上游
[0062]用EcoR I同時(shí)酶切pTE-LPL和pHurricane載體(質(zhì)粒圖譜如圖3所示)，電泳后分別回收前者約0.55Kb片段和后者的大片段，連接這兩個(gè)片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)，涂板，挑斑，搖菌，提取質(zhì)粒，用引物SaLPL-sl和AtFAD2I9F對(duì)所提取的質(zhì)粒進(jìn)行初步鑒定，將PCR擴(kuò)增得到大小約為674bp目的條帶的質(zhì)粒(圖4)命名為pBSK-FAD2Il-LPL。
[0063]SaLPL-sl:5’ -CCTGTTCCTGAGAGGCGTCT-3’(序列 I 的第 2251-2270 位的反向互補(bǔ)序列)；
[0064]AtFAD2I9F:5’ -AGCAGATCTATCGTGAGCGG-3’(序列 I 的第 1597-1616 位)。
[0065]進(jìn)一步，對(duì)所述重組質(zhì)粒pBSK-FAD2Il-LPL進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pBSK_FAD211-LPL為在pHurricane載體的FAD2 Intronl下游酶切位點(diǎn)EcoR I處正向插入“GATT+序列I的第21-563位+AATCACTAGT”后得到的重組質(zhì)粒。
[0066]2、目的片段反向插入FAD2 Intronl的下游
[0067]用Not I同時(shí)酶切pTE-LPL和pBSK_FAD2Il_LPL，分別回收前者0.55Kb片段和后者的大片段，連接這兩個(gè)片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，涂板，挑斑，搖菌，提取質(zhì)粒，用引物SaLPL-sl和AtFAD2I9R對(duì)所提取的質(zhì)粒進(jìn)行初步鑒定，將PCR擴(kuò)增得到大小約為674bp目的條帶的質(zhì)粒(圖5)命名為pBSK-LPL-R。
[0068]SaLPL-sl:5，-CCTGTTCCTGAGAGGCGTCT-3，(序列 I 的第 21-40 位)；[0069]AtFAD2I9R:5’ -GAAGACTCTCTTGAATCGTTACC-3’(序列 I 的第 672-694 位的反向互補(bǔ)序列)。
[0070]進(jìn)一步，對(duì)所述重組質(zhì)粒pBSK-LPL-R進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pBSK-LPL-R為在pBSK-FAD2Il-LPL載體的FAD2 Intronl上游酶切位點(diǎn)Not I處反向插入“GGGAATTCGATT+ 序列 I 第 21-563 位 +AATCACTAGTGAATTC” 后得到的重組質(zhì)粒。
[0071 ] 在重組質(zhì)粒pBSK-LPL-R中，位于酶切位點(diǎn)Kpn I和BamH I之間的序列即為RNAi構(gòu)件。
[0072]3、將RNAi構(gòu)件置于rbcs啟動(dòng)子下游
[0073]用限制性內(nèi)切酶Kpn I和BamH I同時(shí)雙酶切pBAC-rbcs-sNTL載體(質(zhì)粒圖譜如圖6所示，構(gòu)建過(guò)程見下文)和以上構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBSK-LPL-R，電泳后分別回收前者大小約為4kb的片段和后者大小約為2.3kb的片段，連接這兩個(gè)片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，涂板，挑斑，搖菌，提取重組質(zhì)粒，將其命名為pBAC-rbcs-LPL。
[0074]用限制性內(nèi)切酶Kpn I和BamH I對(duì)pBSK_LPL_R、pBAC-rbcs-sNTL，以及重組質(zhì)粒pBAC-rbcs-LPL分別進(jìn)行雙酶切。結(jié)果如圖7所示，酶切pBAC-rbcs-sNTL可得到一條大小約為4kb的骨架片段,酶切pBSK-LPL-R可得到一條大小約為2.3kb的目的片段,而酶切重組質(zhì)粒pBAC-rbcs-LPL則得到一條約4kb的片段和一條約為2.3kb的片段，其中大片段同pBAC-rbcs-sNTL酶切后的骨架片段大小相符，小片段同目的片段大小相符，證明從pBSK-LPL-R上切下的約2.3kb的目的片段已經(jīng)連接到pBAC-rbcs-sNTL上酶切位點(diǎn)Kpn I和BamH I之間。
[0075]進(jìn)一步，對(duì)所述重組質(zhì)粒pBAC-rbcs-LPL進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pBAC-rbcs-LPL為在pBAC-rbcs-sNTL載體的rbcs啟動(dòng)子下游的酶切位點(diǎn)Kpn I和BamH I之間插入序列表中序列I后得到的重組質(zhì)粒。
[0076]重組表達(dá)載體pBAC-rbcs-LPL的質(zhì)粒圖譜如圖8所示。在重組表達(dá)載體pBAC-rbcs-LPL中，啟動(dòng)所述序列I所示DNA片段轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為rbcs啟動(dòng)子,其核苷酸序列如序列表中序列3所示。序列I由2296個(gè)核苷酸組成。其中，第21-563為SaLPL基因片段的正向序列；第594-1711位為FAD2內(nèi)含子核苷酸序列(序列2);第1728-2270位為所述SaLPL基因片段的反向序列。正向序列和反向序列之間由一段內(nèi)含子(intron)序列隔開以維持載體的穩(wěn)定性；該系統(tǒng)在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin)的dsRNA,弓丨發(fā)RNAi，從而可用于抑制目的基因的表達(dá)。
[0077]其中，pBAC-rbcs-sNTL載體的構(gòu)建方法及后續(xù)的篩選鑒定過(guò)程參見文獻(xiàn)uSambrook J,Fritsch E F，Maniatis T.Molecular cloning - A laboratory Mauual, 2nded., New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.”。具體方法如下:
[0078]I)將載體PBAC202 (參考文獻(xiàn)“高澤發(fā)，陳旭清，楊鳳萍，梁榮奇，張立全，張曉東.人工合成gna基因在小麥中的表達(dá)及其抗蚜蟲效果研究，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，14(4): 559-564”)用 BamH I 和 Kpn I 酶切，回收 3.8Kb 載體片段。
[0079]2)由上海捷瑞生物工程有限公司人工化學(xué)合成sNTL基因全長(zhǎng)(5’端加上BamH I酶切位點(diǎn)，3’端加上Kpn I酶切位點(diǎn))，經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序證明正確。sNTL基因⑶S全長(zhǎng)為序列表中序列4。
[0080]3) BamH I和Kpn I雙酶切上一步獲得的sNTL基因片段和用BamH I和Kpn I酶切載體PBAC202得到的3.8kb載體片段連接后，選擇sNTL方向和rbcs啟動(dòng)子方向一致的重組載體，命名為pBAC-rbcs-sNTL。重組載體pBAC-rbcs-sNTL的結(jié)構(gòu)描述為:在載體PBAC202的酶切位點(diǎn)BamH I和Kpn I之間插入了序列表中序列4所示DNA片段后得到的
重組載體。
[0081]實(shí)施例2、SaLPL的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥的獲得及鑒定
[0082]一、SaLPL的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥的獲得
[0083]選取開花后12-15天的小麥品種京花I號(hào)的幼穗，將其種子消毒后剝?nèi)∮着?，盾片向上置于幼胚接種培養(yǎng)基(配方:MS基本培養(yǎng)基+2，4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉7g/L，pH5.8。各濃度為相應(yīng)組分在培養(yǎng)基中的終濃度)上，25±1°C暗培養(yǎng)3-5天誘導(dǎo)出小麥愈傷組織。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織塊進(jìn)行基因槍共轉(zhuǎn)化(將pBAC-rbcs-LPL和PBAC35SIH3按照3:1摩爾比混合，其中pBAC35SIH3質(zhì)粒帶有Basta抗性基因bar)，轉(zhuǎn)化后的愈傷25 ± I °C暗培 養(yǎng)2-3天后移至篩選培養(yǎng)基(配方:幼胚接種培養(yǎng)基+Basta 2_25mg/L。各濃度為相應(yīng)組分在培養(yǎng)基中的終濃度)上進(jìn)行除草劑抗性篩選；觀察篩選1-2周之后，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好、顏色鮮黃的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(配方:MS基本培養(yǎng)基+玉米素10mg/L+Basta0.5mg/L, pH5.8。各濃度為相應(yīng)組分在培養(yǎng)基中的終濃度)上使其分化，大約4-5周后可分化出幼苗，將其轉(zhuǎn)移到生根壯苗培養(yǎng)基(配方:MS培養(yǎng)基+IAA 10mg/L，pH5.8。各濃度為相應(yīng)組分在培養(yǎng)基中的終濃度)中進(jìn)行生根壯苗，直到根系生長(zhǎng)繁茂、小麥綠苗足夠壯實(shí)；煉苗2-3天后移栽至土壤中可長(zhǎng)成Ttl代轉(zhuǎn)基因植株。
[0084]同時(shí)設(shè)置向小麥品種京花I號(hào)中轉(zhuǎn)入pBAC-rbcs空載體的對(duì)照。
[0085]pBAC-rbcs載體是用BamH I和Kpn I雙酶切pBAC-rbcs-sNTL載體后，將載體大片段末端補(bǔ)平后連接得到的載體。
[0086]二、SaLPL的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥的鑒定
[0087]用針對(duì)FAD2 Intronl的引物對(duì)AtFAD-s2/AtFAD_a2對(duì)步驟一獲得具有Basta抗性的SaLPL的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥的Ttl-T3代植株進(jìn)行PCR鑒定。以重組表達(dá)載體pBAC-rbcs-LPL作為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)基因的小麥品種京花I號(hào)為陰性對(duì)照，同時(shí)設(shè)置向小麥中轉(zhuǎn)入pBAC-rbcs的空載體對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0088]AtFAD-s2:5’ -TTCTGGTGGGTTGGTGGAAA-3’(序列 I 的第 1336-1355 位的反向互補(bǔ)序列)；
[0089]AtFAD-a2:5’ -CAGGTTGTGAAAGGGATTGCC-3，(序列 I 的第 720-740 位)。
[0090]結(jié)果如圖9所示，作為陽(yáng)性對(duì)照的pBAC-rbcs-LPL質(zhì)粒擴(kuò)增出636bp左右的目標(biāo)帶，而作為陰性對(duì)照的未轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)入pBAC-rbcs的空載體的植株均沒有擴(kuò)出目標(biāo)片段；而SaLPL的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥可擴(kuò)增出636bp左右的目標(biāo)片段，這些擴(kuò)增出約636bp目的片段的轉(zhuǎn)基因小麥為陽(yáng)性植株。從陽(yáng)性植株中隨機(jī)選取I株，種成株系，命名為dsLPL-1。
[0091]實(shí)施例3、SaLPL的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)麥長(zhǎng)管蚜防治效果研究
[0092]麥長(zhǎng)管蚜種群，室內(nèi)飼養(yǎng)蚜蟲三代，期間從未施用過(guò)任何殺蟲劑。室內(nèi)飼養(yǎng)溫度為21±1°C，相對(duì)濕度為30-40%，光周期為L(zhǎng):D=16h:8h。蚜蟲飼養(yǎng)在感蚜小麥品種京411上，兩周更換一次新鮮的幼苗用于蚜蟲
[0093]一、SaLPL的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)麥長(zhǎng)管蚜脂蛋白酯酶基因表達(dá)量干擾效果分析
[0094]以處于一齡時(shí)期的麥長(zhǎng)管蚜為實(shí)驗(yàn)材料，飼喂在T3代SaLPL的RNAi轉(zhuǎn)基因株系dsLPL-1上5天。利用qRT-PCR技術(shù)分析麥長(zhǎng)管蚜體內(nèi)脂蛋白酯酶基因的表達(dá)量。具體操作如下:
[0095]設(shè)計(jì)脂蛋白酶基因SaLPL的擴(kuò)增引物對(duì)SaLPL-s2/SaLPL_a2 (擴(kuò)增片段大小為249bp),設(shè)計(jì)內(nèi)參基因β -actin的擴(kuò)增引物對(duì)Actin-sl/Actin_al (擴(kuò)增片段大小為238bp)0
[0096]脂蛋白酶基因SaLPL的擴(kuò)增引物:
[0097]SaLPL-s2:5’ -AGGCGTCTCTGTCATCTACC-3’ ；
[0098]SaLPL-a2:5， -TGTGTCAAGAACCCAAGGA-3，。
[0099]內(nèi)參基因β -actin的擴(kuò)增引物:
[0100]P3-F:5， -CCGAAAAGCTGTCATAATGAAGACC-3，；
[0101]P3-R: 5，-GGTGAAACCTTGTCTACTGTTACATCTTG-3，。
[0102]取麥長(zhǎng)管蚜，按照美萊博RNA提取試劑盒提取總RNA，用針對(duì)SaLPL基因的引物對(duì)SaLPL-s2/SaLPL-a2 (擴(kuò)增片段大小為249bp)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。以β-actin為內(nèi)參基因，擴(kuò)增引物對(duì)為Actin-sl/Actin-al (擴(kuò)增片段大小為238bp)。取500ng總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,稀釋10°、IO1UO2UO3' IO4、IO5倍，作為熒光定量PCR的模板，檢測(cè)以上2對(duì)引物的特異性。經(jīng)檢測(cè)特異性良好后進(jìn)行正式檢測(cè)。
[0103]實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系:上下游引物(濃度ΙΟμπιοΙ.L—1)各0.5 μ L、2 X TransStart TM Green qPCR SuperMixl2.5 μ L> Passive Reference Dye 0.5 μ L、模板 cDNAI μ L, ddH20 補(bǔ)充至 25 μ L。
[0104]PCR 循環(huán)程序:95°C 30s ；95°C 5s，57°C 15s，72°C 10s，40 個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣本 3 個(gè)重復(fù)。
[0105]最終結(jié)果的計(jì)算采用I—一法(Ct表示循環(huán)數(shù))進(jìn)行計(jì)算，使用EXcel2003軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，具體參見 “Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the2 AAct method.Methods25(4):402~408.”一文，使用Excel2003軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算每種處理的平均值與方差，并進(jìn)行顯著性差異的分析(t-test，n=3，P < 0.01或0.05)。
[0106]實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。
[0107]同時(shí)設(shè)置以未轉(zhuǎn)基因的小麥品種京花I號(hào)(CK)和轉(zhuǎn)入pBAC-rbcs空載體的小麥植株飼喂麥長(zhǎng)管蚜的對(duì)照。
[0108]結(jié)果如圖10所示，從圖中可以看出，麥長(zhǎng)管蚜取食dsLPLl葉片5天后，其體內(nèi)脂蛋白酯酶基因表達(dá)量較對(duì)照(CK)降低。以上結(jié)果表明，SaLPL的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥可有效降低麥長(zhǎng)管蚜體內(nèi)脂蛋白酯酶的表達(dá)量。
[0109]二、SaLPL的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)麥長(zhǎng)管蚜繁殖率的影響
[0110]以處于一齡麥長(zhǎng)管蚜為實(shí)驗(yàn)材料，分別飼喂在T3代SaLPL的RNAi轉(zhuǎn)基因株系dsLPLl上3、6、10、17天。飼喂在兩種轉(zhuǎn)基因株系上的麥長(zhǎng)管蚜的初始數(shù)量均為5頭。飼喂
3、6、10、17天后，統(tǒng)計(jì)各轉(zhuǎn)基因株系上麥長(zhǎng)管蚜的數(shù)目。
[0111]實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。
[0112]同時(shí)設(shè)置以未轉(zhuǎn)基因的小麥品種京花I號(hào)(CK)和轉(zhuǎn)入pBAC-rbcs空載體的小麥植株飼喂麥長(zhǎng)管蚜的對(duì)照。[0113]結(jié)果如圖11示，從圖中可以看出，飼喂轉(zhuǎn)基因株系dsLPLl的3、6、10、17天后，麥長(zhǎng)管蚜數(shù)目均較對(duì)照(CK)極顯著降低。而對(duì)于用轉(zhuǎn)入pBAC-rbcs空載體的小麥植株飼喂麥長(zhǎng)管蚜的對(duì)照組，其結(jié)果與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?(CK)基本一致，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明，SaLPL的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥可有效降低麥長(zhǎng)管蚜的繁殖率。
【權(quán)利要求】
1.如式(I)所示的DNA片段: SEQ正向-X-SEQ反向(I) 所述序列如序列表中序列I的第21-563位核苷酸所示； 所述SEQ的序列與所述序列反向互補(bǔ)； 所述X是所述SEQ1^1與所述SEQi^i間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ1向及所述SEQfi^1均不互補(bǔ)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述X的序列如序列表中序列2所/Jn ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DNA片段，其特征在于:所述DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列I所示。
4.含有權(quán)利要求1-3中任一所述DNA片段的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為重組表達(dá)載體或重組克隆載體； 所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子具體為rbcS啟動(dòng)子。
6.權(quán)利要求1-3中任一所述的DNA片段編碼得到的RNA分子。
7.權(quán)利要求1-3中任一所述的DNA片段，或權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌，或權(quán)利要求6所述的RNA分子在如下al) -a4)任一中的應(yīng)用: al)抑制麥長(zhǎng)管蚜脂蛋白酯酶表達(dá)； a2)降低麥長(zhǎng)管蚜的繁殖率； a3)防治麥長(zhǎng)管蚜； a4)培育抗麥長(zhǎng)管蚜的轉(zhuǎn)基因植物。
8.一種培育抗麥長(zhǎng)管蚜的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求1-3中任一所述的DNA片段導(dǎo)入目的植物中，得到抗麥長(zhǎng)管蚜的轉(zhuǎn)基因植物； 所述抗麥長(zhǎng)管蚜具體體現(xiàn)在如下bl)和/或b2): bl)抑制麥長(zhǎng)管蚜的脂蛋白酯酶表達(dá)； b2)降低麥長(zhǎng)管蚜的繁殖率。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，或權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用或方法，其特征在于:所述單子葉植物為小麥。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103667294SQ201310644179
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月3日
【發(fā)明者】梁榮奇, 倪中福, 許蘭杰, 張小華, 侯起嶺, 尤明山, 解超杰, 李保云, 彭惠茹, 姚穎垠, 杜金昆, 劉志勇, 胡兆榮, 孫其信 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)