專利名稱：測序方法
測序方法本發(fā)明涉及一種對多核苷酸進(jìn)行測序的新方法，其中使用珠粒作為標(biāo)記來識別多核苷酸中的堿基。已經(jīng)通過各種方法進(jìn)行多核苷酸測序多年，并且已經(jīng)提供了大量關(guān)于不同物種基因組的信息。盡管人類基因組已經(jīng)被測序，但是為了識別遺傳傾向性或者遺傳性疾病或基因相關(guān)的疾病，仍非常關(guān)注測序。因此，對突變的定位以及組織特異性mRNA產(chǎn)生和表達(dá)分析給予了很大的關(guān)注。另外，還關(guān)注來自其它物種的基因組的測序，即從頭測序(de novosequencing)。自20世紀(jì)80年代年起，傳統(tǒng)上通過使用Sanger雙脫氧法(Sanger、Nicklen和Coulson, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1977，74，5463-7)進(jìn)行 DNA 測序。其是一種基于克隆DNA (該克隆DNA首先被酶處理)的電泳過濾的多分子方法。酶處理通過使用熒光標(biāo)記的雙脫氧NTP和dNTP的混合物來中斷聚合作用而產(chǎn)生單鏈DNA，其中雙脫氧NTP終止鏈的延伸，而dNTP不能終止鏈的延伸。因此，利用這種方法獲得了不同鏈長的混合物，其中每一個DNA鏈的長度代表堿基位置并且所連接的熒光團(tuán)的顏色代表3'端堿基的特性(identity)。這些特性被表示為排列的彩色圓點，排列成一條線的圓點代表一個DNA序列。然而，Sanger測序法需要使用多條鏈并且僅可對約1000個堿基進(jìn)行測序。也使用了Maxam 等人(Proc.Natl.Acad.Sc1., 1977, 74, 560-4)的化學(xué)降解法以用于DNA測序，該方法涉及在特異性核苷酸處切割核苷酸序列，導(dǎo)致產(chǎn)生不同長度的鏈，其中每一個長度指示在該位置處存在特定的核苷酸。因此，化學(xué)降解法還需要鏈的電泳分離以用于序列確定。因此，Sanger的鏈終止法與Maxam的化學(xué)降解法都需要產(chǎn)生一組或多組標(biāo)記的DNA片段，其中每一DNA片段終止于特定的核苷酸堿基。這些片段必須按大小分離以便確定序列，并且因此所使用的電泳凝膠必須能夠通過單一核苷酸來區(qū)分大量大小不同的片段。如上文討論的，這限制了能 夠在一次測序中測序的DNA鏈的大小?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)提出了對鏈終止法的修改，例如通過組合酶切階段與讀出階段。因此，代替以電泳過濾器上的位置來表示的堿基位置，通過在特定位點處及時進(jìn)行讀取來提供堿基位置。因此，能夠?qū)崟r地讀出序列。使用該原理的第一種技術(shù)被稱為焦磷酸測序(Ronaghi> Uhlen 和 Nyren, Science, 1998, 281, 363-365),其不使用突光團(tuán)而使用突光素酶，當(dāng)被釋放自聚合步驟(其中每次提供一個核苷酸)的焦磷酸鹽間接地觸發(fā)時產(chǎn)生光。來自該步驟的光產(chǎn)生遠(yuǎn)低于熒光團(tuán)產(chǎn)生的光，因此依然需要克隆DNA以使得每一聚合步驟產(chǎn)生足以用于保證檢測的光。這種方法可以處理長度為400個核苷酸的DNA，但是并不十分適合用于檢測序列中的均聚物(同聚物，homopolymer),即相同核苷酸的重復(fù)。其它實時方法包括通過合成(該合成能夠被用于多分子或單分子測序)來測序、通過連接(用于多分子測序)來測序、以及通過逐步連接和切割(用于多分子測序)來測序。通過合成的測序涉及使用被添加至固定的靶DNA序列的熒光團(tuán)標(biāo)記的終止核苷酸堿基。因此，通過聚合作用在每個循環(huán)中將單一終止核苷酸堿基插入到靶DNA序列中，然后通過其熒光團(tuán)標(biāo)記的特性來確定該堿基。一旦獲得讀取結(jié)果，就可將該終止堿基化學(xué)中和，以使得聚合作用得以繼續(xù)進(jìn)行。此外，堿基與標(biāo)記之間的脂質(zhì)鏈(脂鏈)可以被化學(xué)或光化學(xué)切割，以便除去先前結(jié)合的標(biāo)記以使得能夠讀出隨后結(jié)合的標(biāo)記。通過連接進(jìn)行的測序包括將熒光團(tuán)標(biāo)記的探針連接至未知的序列，其中通過能夠與其連接的探針的序列來確定該序列。此外，通過逐步連接與切割進(jìn)行的測序(Brenner等，US5，714，330，通過引用將其結(jié)合于本文)涉及稍加變化的方法的集合，該方法基于探針的使用，該探針具有核酸酶識別位點，該核酸酶的切割位點與識別位點不同(分開)。因此，可以通過與其結(jié)合的探針序列或通過連接于插入到DNA序列中的核酸堿基的標(biāo)記來測定該DNA序列，然后探針中的核酸酶識別位點能夠誘導(dǎo)待測定的DNA序列的切割以釋放探針和/或結(jié)合的核苷酸以縮短序列，從而能夠測定其后的(一個或多個)核苷酸。然而，上文描述的測序方法都有其局限性。一些方法導(dǎo)致“相移”(“d印hasing”)或異步性(asynchronism),這種“相移”或異步性產(chǎn)生結(jié)果的拖尾現(xiàn)象(smearing),這限制了可被測序的鏈的長度。其他方法具有長讀取時間?，F(xiàn)有技術(shù)中為了越過(address)這些局限性而嘗試使用的替代方法需要使用昂貴的設(shè)備(例如高數(shù)值孔徑激光掃描共焦顯微鏡)或由于延遲(stalling)而僅限于讀出短序列，延遲的發(fā)生是由于使用修飾的核苷酸。因此，需要一種不需要使用昂貴的設(shè)備并且能夠?qū)﹂L鏈進(jìn)行測序的測序方法?，F(xiàn)在本發(fā)明人提供了一種新型測序方法，其中在測序反應(yīng)中使用珠粒作為標(biāo)記。因此，在本發(fā)明中，用珠粒標(biāo)記可插入的堿基和/或探針，該堿基和/或探針包含一個或多個互補(bǔ)于待測定的靶多核苷酸中的堿基或序列的堿基。如下文中描述的，能夠很容易檢測已插入到多核苷酸中的連接于堿基或探針的單一珠粒的存在，這使得能夠識別已結(jié)合的互補(bǔ)堿基和/或探針，并且因此識別在多核苷酸中堿基和/或探針結(jié)合的堿基或序列。與現(xiàn)有技術(shù)和傳統(tǒng)上使用熒光團(tuán)標(biāo)記的測序方法相比，在測序反應(yīng)中使用珠粒作為標(biāo)記提供了很多優(yōu)點。首先，珠粒容易檢測，因為它們比熒光團(tuán)大，這使得它們能夠被應(yīng)用在單分子測序中。此外，當(dāng)使用珠粒作為標(biāo)記時不再存在低信號水平問題。而且，不需使用昂貴的設(shè)備來檢測珠粒，例如在集成電路中使用電子珠檢測裝置或基于光或磁性來檢測珠粒。可以從反應(yīng)中容易且快速地除去珠粒，尤其是當(dāng)珠粒是順磁性時，并且因此當(dāng)使用珠粒標(biāo)記時不存在噪聲問題，這與熒光標(biāo)記相反。此外，可以使用機(jī)械切割，從而避免了如一些現(xiàn)有技術(shù)測序方法中需要的化學(xué)除去。之前沒有人提出過將珠粒用于標(biāo)記與待識別的堿基或序列互補(bǔ)的核苷酸或探針，其中在反復(fù)測序反應(yīng)期間該核苷酸或探針結(jié)合至靶序列。尤其是，之前沒有披露過使用單一珠粒作為標(biāo)記來確定反復(fù)測序反應(yīng)中的多核苷酸中的特定位置處的一個或多個核苷酸的特性，尤其是當(dāng)靶分子的序列未知的時候。Stahl等人(Genomics, 2007, 90, 741-745)使用鏈霉親和素包被的珠粒來檢測雜交至固定于陣列的寡核苷酸的生物素標(biāo)記(生物素化，biotinylated)的DNA。可在PCR期間用生物素標(biāo)記DNA或者在雜交至陣列上的互補(bǔ)寡核苷酸之后利用蛋白酶介導(dǎo)的等位基因特異性延伸反應(yīng)(PrASE)隨后標(biāo)記DNA，其中使用了生物素化的核苷酸并且將其結(jié)合于表面連接的具有匹配的3’末端的寡核苷酸。還提出了聯(lián)合使用鏈霉親和素包被的珠粒與PrASE反應(yīng)用于測序。然而，該方法需要在陣列上的單一位點處固定四種不同的寡核苷酸，其中每一種寡核苷酸的末端堿基是不同的。然后添加 待測序的PCR產(chǎn)物，使得3’末端僅與一種寡核苷酸完全雜交(perfecthybridisation)。然后利用生物素化的核苷酸進(jìn)行PrASe反應(yīng)，其中僅有具有3’端完全(perfectly)匹配的寡核苷酸發(fā)生延伸。加入多重鏈霉親和素包被的珠粒使得延伸的產(chǎn)物能夠可視化。相對于本發(fā)明，該方法具有一些缺點并且采取了不同的程序進(jìn)行測序。首先，為了識別Stahl等人所述的單一核苷酸，需要產(chǎn)生雜交至靶DNA的4種不同寡核苷酸探針。因此，如果需要識別多核苷酸中的若干種核苷酸時，就需要生產(chǎn)許多不同的寡核苷酸(即，每一個位置需要4種)。在所提供的示例性實施例中，5個堿基通過結(jié)合至寡核苷酸而被重新測序，其中4個堿基是野生型的而一個堿基不同于野生類型序列。因此，產(chǎn)生了反映20種可能的排列(permutation)的20種空間分離的寡核苷酸。這需要知道它們產(chǎn)生的野生型靶序列。因此，如果序列是未知的并且該檢測不能被用于重測序或用于檢測多態(tài)性，則需要產(chǎn)生大量的測試寡核苷酸以涵蓋所有堿基的可能排列，該堿基在靶序列中與寡核苷酸結(jié)合。本發(fā)明提供了一種不同的測序方法，其中可用珠粒來標(biāo)記待結(jié)合的核苷酸堿基和/或探針，該核苷酸堿基和/或探針與待確定的堿基或序列互補(bǔ)。在該方法中，僅需要4種珠粒標(biāo)記的寡核苷酸用于對任何位點與任何序列的組合進(jìn)行測序，而不必知曉野生型。沒有人提出反復(fù)測序或可以利用Stahl等人的方法，即循環(huán)利用相同分子的測序來對連續(xù)的核苷酸進(jìn)行測序。本發(fā)明通過在每個循環(huán)期間或每個循環(huán)結(jié)束時除去珠粒使得能夠?qū)崿F(xiàn)相同分子的重復(fù)測序。另外，與在Stahl等人所述中使用大量的陣列點以使得對單一多核苷酸進(jìn)行測序相比，本發(fā)明僅需要在多核苷酸中存在單一珠粒就能識別特定的(一個或多個)堿基。對單一分子進(jìn)行測序的能力省去了任何克隆步驟且不需進(jìn)行擴(kuò)增。這使得為了獲得序列所需要的工作減少，并且進(jìn)一步防止向多核苷酸中引入不必要的錯誤。因此，本發(fā)明人首次使用珠粒來標(biāo)記核苷酸或探針，其識別與其互補(bǔ)的堿基或序列，以便能夠通過聚合酶、連接酶或逐步連接(分步連接，stepwise ligation)與切割過程來進(jìn)行測序。第一方面中，本發(fā)明提供了一種用于確定固定在固體載體上的單一多核苷酸的核苷酸序列的方法，包括以下步驟:`(i)使所述多核苷酸與至少一種測試互補(bǔ)堿基和/或至少一種探針接觸，該探針包含可與所述多核苷酸中的一個或多個堿基互補(bǔ)的部分，珠粒連接至至少一種測試互補(bǔ)堿基和/或至少一種探針或者結(jié)合對的第一結(jié)合伴侶連接至至少一種測試互補(bǔ)堿基和/或至少一種探針，并且當(dāng)所述測試互補(bǔ)堿基和/或所述測試互補(bǔ)探針的部分與所述多核苷酸中的所述一個或多個堿基互補(bǔ)時，所述的測試互補(bǔ)堿基和/或探針共價結(jié)合于所述多核苷酸；(ii)當(dāng)結(jié)合伴侶連接至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針時，將連接至所述結(jié)合對的第二結(jié)合伴侶的珠粒結(jié)合至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針，所述第一結(jié)合伴侶通過所述結(jié)合對連接至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針； (iii)可選地使用至少一種不同的測試互補(bǔ)堿基和/或探針重復(fù)步驟(i )，或步驟
(i)和步驟(ii)，直到與所述一個或多個堿基互補(bǔ)的測試堿基和/或一部分與所述一個或多個堿基互補(bǔ)的測試探針結(jié)合至所述多核苷酸；(iv)通過確定在步驟(i )至步驟(i i i )期間連接至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針的所述珠粒是否結(jié)合到所述多核苷酸，來確定哪一測試互補(bǔ)堿基和/或測試探針的互補(bǔ)部分結(jié)合至多核苷酸的所述一個或多個堿基，從而識別該多核苷酸的所述一個或個堿基；并且(V)如果在步驟(iv)期間未除去該珠粒，則除去所述珠粒；其中，步驟(i)至步驟(V)的每一個循環(huán)進(jìn)行一次或多次，并在每一個循環(huán)中識別所述序列的一個或多個堿基。在一個優(yōu)選的方面，多于一次地重復(fù)步驟(i)至步驟(V)，即進(jìn)行多于一次循環(huán)，如下文中討論的優(yōu)選至少2個循環(huán)。在一個尤其優(yōu)選的方面，重復(fù)所述步驟以用于所有測試堿基或探針組。因此，本發(fā)明的方法確定了特定的珠粒標(biāo)記的核苷酸或探針是否已插入到待測序的多核苷酸中，其中珠粒的結(jié)合指示特定的測試互補(bǔ)核苷酸或探針的插入，并且因此能夠識別在多核苷酸中與其結(jié)合的序列。待識別的所述一個或多個堿基可以是與測試探針結(jié)合的一個或多個堿基和/或與測試堿基結(jié)合的一個堿基。如本文中使用的，術(shù)語“確定核苷酸序列”是指部分序列和全長序列的確定。(該措詞可與“識別”序列中的一個堿基或多個堿基互換使用。)確定核苷酸序列包含任何序列長度，因此，通過該方法可以確定至少一個核苷酸堿基，但優(yōu)選地可確定多于一個核苷酸，例如可以確定至少 2、3、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、4000、6000或10000個或更多個核苷酸。因此，優(yōu)選地實施該方法的步驟(即每一個循環(huán))至少 2、3、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、4000、6000或10000次，或者如果在每一個反復(fù)循環(huán)中確定多個堿基時則按比例減少循環(huán)次數(shù)。確定核苷酸序列包括識別特定位點(A、T/U、G或C)處的具體堿基，即完全的識別或提供那個堿基的部分識別，例如該方法可以識別一組堿基，或識別由該堿基的選項(options)組成的一組少于·4個(S卩3個或2個)的堿基，例如A或T而不是G或C，或者A、T或G而不是C?？商鎿Q地，部分識別提供了堿基特性的信息，當(dāng)該堿基與所獲得的信息結(jié)合時(例如在其它循環(huán)中)能夠完全識別該堿基。當(dāng)在每一個循環(huán)中識別(即讀取)多于一個堿基時，即當(dāng)探針組中與靶接觸的沒有完全降解的探針堿基的數(shù)目為兩個或更多時，循環(huán)中的這種部分識別是尤其有用的。如果“步長”，即每一個循環(huán)中處理的堿基數(shù)目少于在讀取中所涉及的堿基數(shù)目時(例如，每個循環(huán)識別兩個堿基，但是靶序列在一次僅處理一個堿基(如被縮短)，例如在下個循環(huán)之前，在逐步連接中的切割可以從靶序列中除去單個堿基)，所獲得的部分識別是尤其有用的?？梢允褂脧闹丿B讀取獲得的信息的組合以便毫無疑義地或足夠無疑義地獲得有用的序列，尤其是當(dāng)作為測序材料來源的個體屬于某一物種(該物種的基因組圖譜是已知的)，并且測序的目的主要是單核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)時。事實上每一個堿基參與至少兩個讀取循環(huán)，其與探針組中探針序列的正確組合，可被用于提高信息水平以提高數(shù)據(jù)質(zhì)量，例如在一個實例中用于識別連接酶對其具有最低的選擇性和較高的確定性，而無需使用大量的探針組的堿基。因此，舉例而言，為了在每一個循環(huán)中識別兩個堿基(但是一個堿基的步長)，可以使用4個探針組而不是16個探針組，并且當(dāng)基因組圖譜已知時，在幾乎所有的情況下，仍然可以較高質(zhì)量的SNP數(shù)據(jù)來識別堿基序列。在這種情況下，盡管沒有區(qū)分，但是在每一個探針組中存在4種不同類型的探針。因此，在第一循環(huán)中能夠確定，基于包含其結(jié)合的探針的探針組，靶向二堿基序列具有4種可能性。在下一個循環(huán)中，可以識別靶向二堿基序列的類似的4種可能性。然而，由于測序反應(yīng)步驟在兩個循環(huán)之間僅推進(jìn)(forward)—個堿基，因此在這兩個循環(huán)中讀出相同的堿基。隨著測序繼續(xù)進(jìn)行以識別序列，通過識別在隨后的循環(huán)中根據(jù)所顯現(xiàn)的信息來確定的4種可能性中的哪一種的結(jié)合是正確的，能夠結(jié)合并改善該重疊信息。類似地，當(dāng)讀取循環(huán)中涉及3個堿基，但步長僅為一個堿基時，可以使用例如9個探針組來代替64個探針組。由于在這種方式中的所有堿基均已包含在3個讀取中，因此在大多數(shù)情況下會檢測到單個讀取錯誤，尤其是在基因組圖譜已知的情況下。另外，使用正確構(gòu)成的探針組經(jīng)常還可以檢測到兩個錯誤，尤其是在那些連接酶是最小特異性的情況中，即對于T4DNA連接酶而言是T/G特異性。因此，如本文中提到的“循環(huán)”是指實現(xiàn)將測試堿基或探針與靶序列結(jié)合需要的步驟，其中進(jìn)行上述步驟(i )至步驟(V)并且在該循環(huán)結(jié)束時識別所述堿基(一個或多個)可以是部分的或完全的。此外，“確定核苷酸序列”包括對已知核苷酸序列進(jìn)行重新測序，以及序列比對和已知序列中的多態(tài)性和突變研究。另外，“確定核苷酸序列”可包括確定序列中四種類型核苷酸的一種、兩種或三種的位置，例如，僅期望確定序列中的胞嘧啶的位置，以及識別4種核苷酸堿基中的任一種或全部在序列中的位置。該“多核苷酸”可以是任何多核苷酸，但優(yōu)選DNA或RNA序列，其序列以本發(fā)明的方法確定。通常，在經(jīng)歷測序之前，使RNA序列經(jīng)歷逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生拷貝DNA(copy DNA)?？商鎿Q地，如果在本發(fā)明的方法中直接使用RNA序列，則可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶/RNA聚合酶或RNA連接酶而不是DNA聚合酶或DNA連接酶( 其應(yīng)用于DNA序列)，如下文進(jìn)一步討論的，結(jié)合互補(bǔ)堿基或探針。多核苷酸序列還可以是任何長度，但是包括至少兩個核苷酸堿基，并且通常為至少3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸堿基。例如，利用本發(fā)明可以檢測至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、4000、6000 或 10000 個堿基的多核苷酸序列。如本文中提到的，“單一”多核苷酸是指通過本文所述的方法用于測序的單一分子。利用該方法可以對所期望的多于一個分子同時測序，但是該情況中通過珠粒分析來識別每一單一多核苷酸的(一個或多個)堿基。該方法依賴于珠粒的使用，以產(chǎn)生即使在僅存在一個珠粒時可檢測到的信號。如本文中提到的，“固定”是指直接或間接地固定于載體，例如通過結(jié)合于另一個結(jié)合至載體的分子。如下文中描述的，可以通過化學(xué)偶聯(lián)來實現(xiàn)直接固定，并且例如可以通過結(jié)合伴侶偶聯(lián)來實現(xiàn)間接固定，例如通過雜交至互補(bǔ)的寡核苷酸，例如通過連接分子。優(yōu)選這種形式的間接偶聯(lián)。雜交之后可以進(jìn)行連接，以便避免在高溫下或施加力時釋放靶多核苷酸，尤其是在雜交區(qū)域較短的情況下?！肮腆w載體”可以是任何固體載體，例如載片(如玻璃載片)、微陣列、微粒等，但是尤其可以是如下文中進(jìn)一步描述的用于檢測珠粒的裝置，如PCT/GB2010/00324中識別的，將其通過引用結(jié)合于本文(即用于光學(xué)檢測或用于磁檢測的芯片)。可以根據(jù)需要調(diào)整固體載體(例如芯片)以便能夠適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合靶多核苷酸，例如在特異性位點結(jié)合以便能夠?qū)嵤┰摲椒ú⑶覚z測該珠粒。如上文中討論的，測試互補(bǔ)堿基或探針結(jié)合至待確定其序列(靶序列)的多核苷酸。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸序列可以至少部分地為單鏈以便允許互補(bǔ)堿基或探針的結(jié)合。尤其是，該多核苷酸序列可以是具有5’端連接至待確定其序列的多核苷酸部分的互補(bǔ)寡核苷酸序列的單鏈，提供能夠延伸的引物多核苷酸序列，例如通過聚合作用進(jìn)行互補(bǔ)堿基結(jié)合。可替換地，多核苷酸可以大部分為雙鏈，例如，具有單鏈突出(protrusion)的雙鏈或幾個核苷酸堿基的部分(如2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多的核苷酸堿基)，探針可以通過連接(例如具有互補(bǔ)重疊的互補(bǔ)雙鏈探針)與其結(jié)合。如下文討論的，探針可以是單鏈或者可以是具有單鏈突出的雙鏈，其可與多核苷酸序列中的單鏈突出的一部分或全部結(jié)
口 ο本文中提到的“接觸”是指在測試探針或堿基具有互補(bǔ)于多核苷酸中的一個或多個堿基的堿基時，在能夠形成互補(bǔ)堿基對結(jié)合的條件下，使多核苷酸與測試堿基或探針接觸。共價結(jié)合可以通過使得堿基或探針與多核苷酸序列中的其互補(bǔ)序列結(jié)合的任何方法或技術(shù)來實現(xiàn)。在一種優(yōu)選的實施方式中，通過聚合作用或通過連接作用來實現(xiàn)堿基或探針的共價結(jié)合。具體地，通過聚合作用插入單個堿基，例如使用DNA或RNA聚合酶、或轉(zhuǎn)錄酶/逆轉(zhuǎn)錄酶，并且通過連接作用插入或結(jié)合探針。這樣插入堿基或探針將以5'至
或3'至5'方向延伸多核苷酸。 如本文中使用的，“連接”是指在模板驅(qū)動的反應(yīng)中，兩個或多個核酸的末端之間形成共價鍵或連接，其中該連接可以酶促方式或化學(xué)方式發(fā)生。可以利用DNA連接酶(對于DNA序列)和RNA連接酶(對于RNA序列)來實現(xiàn)連接。如本文中使用的(可互換使用)，術(shù)語“堿基”或“核苷酸”包括天然核苷酸腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，尤其是以2’ -脫氧形式存在，或以相同的方式起作用的非天然核苷酸，即與天然核苷酸一起形成互補(bǔ)堿基對，并且能夠通過聚合作用或連接作用被插入多核苷酸序列中。對于“互補(bǔ)堿基”，是指與多核苷酸中待識別的堿基進(jìn)行特異性堿基匹配的堿基。因此，如果多核苷酸中待識別的堿基是胸腺嘧啶，則插入的互補(bǔ)堿基為腺嘌呤，或者如果多核苷酸中待識別的堿基是胞嘧啶，則插入的互補(bǔ)堿基為鳥嘌呤，反之亦然。探針中“與所述多核苷酸中的一個或多個堿基互補(bǔ)”的“部分”是指當(dāng)它們互補(bǔ)時能夠與靶多核苷酸結(jié)合的一個或多個核苷酸或堿基的序列?！皽y試”互補(bǔ)堿基或探針是指探針或堿基可以表現(xiàn)出所期望的與靶序列的互補(bǔ)性。如在下文中描述的，可能存在有限數(shù)量的排列，例如對于單個堿基僅可能存在4種排列。使用測試堿基或探針以存在不同的排列，從而確定堿基或探針是否與靶序列互補(bǔ)并且因此結(jié)合于靶序列。不存在所期望的互補(bǔ)的測試堿基或探針不能結(jié)合于靶序列。如本文中提到的，所述“至少一個測試”堿基或探針使得能夠同時包含多個不同的堿基或探針(如2、3、4、5、7或8個或更多的堿基或探針)。這種不同的堿基或探針在與研究中的一個或多個堿基互補(bǔ) 的堿基或探針部分中是不同的。在這種情況下，可通過使用可被區(qū)分開的珠粒或選擇性釋放連接于不同探針的珠粒來實現(xiàn)已結(jié)合于靶多核苷酸的堿基或探針的識別?？商鎿Q地，如在上文中討論的，可以獲得探針的特性的部分信息，可將其與在隨后的循環(huán)中獲得的信息結(jié)合。該探針可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40或50個核苷酸。在
該探針為雙鏈探針的情況下，每一條鏈可以包含這一數(shù)量的核苷酸。該探針可以為單鏈或可以至少部分地為雙鏈，這取決于該探針被使用的具體方法。如下文所述，在通過連接方法進(jìn)行的測序中使用的探針可以是單鏈，而在通過逐步連接和切割方法進(jìn)行的測序中使用的探針可以至少部分地為雙鏈。在這方面中，該探針可以是具有突出的單鏈部分的雙鏈，例如至少1、2、3、4、5或6個核苷酸堿基的突出的單鏈部分，其可以與多核苷酸序列的全部或部分突出單鏈部分互補(bǔ)。因此，探針的突出鏈?zhǔn)欠袷?'末端或3,末端并不是關(guān)鍵的，只要其能夠連接至多核苷酸的突出鏈即可。優(yōu)選地，該多核苷酸和該探針的突出鏈形成完全匹配的雙鏈。該探針可進(jìn)一步包含核酸酶(限制酶)的核酸酶識別位點，其使核酸酶能夠在遠(yuǎn)離該識別位點的位置處進(jìn)行切割。優(yōu)選地，對于在下文中的逐步切割和連接反應(yīng)中的使用，所述核酸酶是IIb型限制酶,優(yōu)選Alo1、Ars1、Bae1、Bar1、Bpi1、Bsp241、Fal1、Hin41、NmeD1、Ppi1、PsrI 或 TstI，或 IIs 型限制酶，優(yōu)選 Aar1、Acc361、Acelll、Bbsl、BfuAI> BtgZI> Eco311、Eco0441、Esp1、FokI 或 LweI 例如，核酸酶識別位點使得核酸酶能夠從核酸酶識別位點上游和/或下游至少1、2、3、4、5、6、7、10、15或20個堿基處切割。這被認(rèn)為是切割酶的“有效范圍(reach)”。在下文中所述的連接和切割方法中，優(yōu)選所述核酸酶在切割上產(chǎn)生長突出端(overhang)(單鏈區(qū)域)以用于下一個循環(huán)。在這方面，尤其是所述核酸酶是IIb型限制性位點，其在切割后產(chǎn)生5-bp的突出端。如上文討論的，涵蓋靶序列中的所有排列的測試探針之一的一部分與該多核苷酸中的一個或多個堿基互補(bǔ)。因此，該探針應(yīng)該能夠被連接至多核苷酸，以使得該探針能夠結(jié)合在其中。因而識別 多核苷酸中一個或多個堿基是可能的。在任意探針的單鏈部分中發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)于一個或多個堿基的相關(guān)測試探針的一部分，即可以連接至多核苷酸的部分。在部分雙鏈探針中，在單鏈突出部中發(fā)現(xiàn)了互補(bǔ)部分。優(yōu)選地，探針的單鏈部分與多核苷酸中的相應(yīng)區(qū)域具有100%的互補(bǔ)性，盡管這并不是必需的。例如，在其中使用探針僅識別單一核苷酸的實施方式中，完全的堿基匹配僅是識別特定核苷酸所必需的。一般地，在這種情況下，所結(jié)合(例如連接至多核苷酸)的測試探針的末端核苷酸將與多核苷酸中待識別的堿基互補(bǔ)，盡管該互補(bǔ)核苷酸可能不是位于探針的末端。在每一個循環(huán)中，如果多核苷酸中的待識別的核苷酸多于一個，則成功連接至多核苷酸的探針的至少2、3、4、5、6個(等等)核苷酸將與多核苷酸中的那些核苷酸互補(bǔ)。如在下文中討論的，在這種情況下，需要產(chǎn)生足夠的探針以涵蓋每一種排列。可以對每一個與多核苷酸成功連接的測試探針進(jìn)行測試，以便能夠識別連接的探針并因此識別多核苷酸中靶核苷酸的序列。因此，雖然在一種優(yōu)選實施方式中，成功連接至多核苷酸的探針的單鏈部分可以與該多核苷酸100%互補(bǔ)，但該探針的單鏈部分可以僅與其共享至少80%、90%或95%互補(bǔ)性。如本文中提到的，“探針組”是指一組探針，需要該探針組來識別存在于靶序列中的可能排列之一。在本發(fā)明的方法中，可以使用探針組作為測試探針(例如當(dāng)使用多于4種探針時，例如當(dāng)在每個循環(huán)中識別2個堿基時產(chǎn)生4個探針組，并且可以例如基于珠粒類型或切割特性來識別每一組中的探針)，并且因此如本文中所述的探針包括探針組。如果僅要識別單個堿基，也可以產(chǎn)生一個探針組，以使得測試探針能夠結(jié)合于未知的靶序列。產(chǎn)生每一種排列的探針組，但如果每一組探針在與靶接觸后是可區(qū)分的，例如經(jīng)由其標(biāo)記或釋放，也可以一起使用這些探針組。如果僅對靶多核苷酸中的一個堿基進(jìn)行測序，則僅存在4種可能排列并且在該情況中應(yīng)當(dāng)僅產(chǎn)生4組探針。如果同時對兩個堿基進(jìn)行測序，則在該情況中可能存在16種排列并且應(yīng)該產(chǎn)生16組探針以便具有完全的特異性。優(yōu)選地，探針中堿基的數(shù)目(或探針的單鏈部分)高于數(shù)目讀取，例如在僅確定第一堿基的特性的循環(huán)中可以使用5個堿基的探針。在每個循環(huán)中，當(dāng)探針(或其中的單鏈部分)長度大于待測序的堿基的數(shù)目時，為了能夠與靶序列結(jié)合，需要變化不與待測序堿基互補(bǔ)的堿基。因此，在這些位置處可以使用簡并堿基(degenerate base)或擺動堿基(wobblebase)。因此，例如，如果僅確定單個堿基，但是探針(或探針的單鏈部分)的長度是6個堿基，則應(yīng)在5堿基位置處使用簡并堿基或擺動堿基。在這種情況下，可能存在4種排列，但是對于每一種排列都需要一組涵蓋簡并堿基的探針。因此，在這種情況下，這4種探針組包括ANNNN、TNNNN、CNNNN和GNNNN，其中這些組中的每一個含有4 X 4 X 4 X 4=256種不同的探針。提供的探針組在未被讀取的位置中是簡并的。在這種情況下，例如通過連接方法測序所使用的，來自該方法的讀取值(readout)將是每個第五位置處存在的堿基。為了識別插入的4個堿基，通過釋放合成的鏈并在另一起點處重新開始實施該方法來重復(fù)該反應(yīng)，以便將該序列總共進(jìn)行5次以提供完整序列。當(dāng)與逐步連接和切割方法一起使用時，在每個循環(huán)中進(jìn)行一個或多個堿基的讀取，這取決于切割酶的有效范圍。使用直接珠粒結(jié)合，優(yōu)選每一組探針存在相同的珠粒上。不同排列的每一組探針可以存在于不同的珠粒上，或者如果該探針能夠通過不同于珠粒信號的手段區(qū)分，則也可以存在相同的珠粒上，例如通過對于珠粒釋放必需的條件(例如，如果每一種排列的探針具有不同機(jī)制，該機(jī)制能夠用于珠粒的釋放，例如使珠粒連接至探針的特異性限制性位點)。如上文討論的，在需要逐步連接與切割的測序方法中可以使用具有單鏈突出的部分雙鏈探針。在該方面，在雙 鏈部分中，該探針可包含核酸酶識別位點。在該方法中，探針可以攜帶用于識別多核苷酸中的互補(bǔ)核苷酸的珠粒。可在將探針(如果是互補(bǔ)的)連接至靶多核苷酸(即在切割之前)時評價該珠粒的存在和/或使切割反應(yīng)能夠發(fā)生，從而釋放該珠粒并使得能夠?qū)︶尫胚M(jìn)行檢測或使得其不存在于靶多核苷酸。同時，在優(yōu)選的方面中，該探針包括與一個或多個待檢測核苷酸互補(bǔ)的一個或多個互補(bǔ)核苷酸，該方法還包括使用珠粒標(biāo)記的核苷酸和探針，可以將該核苷酸和探針連接至核苷酸以提供核酸酶識別位點。在該情況中，可以評價珠粒的結(jié)合以知曉該珠粒是否在切割之前和/或在切割之后作為釋放的探針的一部分或通過切割在一個或多個釋放的核苷酸上連接至靶多核苷酸。結(jié)合至多核苷酸的堿基或探針可以具有終止效應(yīng)，以防止進(jìn)一步延伸或?qū)⑵渌膲A基或探針結(jié)合到序列中。因此，該堿基可以是雙脫氧核苷酸或者該探針可以在末端位置具有這樣的堿基。這樣的堿基僅在最終測序循環(huán)中是適合的，因為引入該核苷酸導(dǎo)致了永久的終止。對于終止，在序列反應(yīng)期間和最后循環(huán)之前，可以使用替換的已知可逆的修飾。在這種情況下，在借助于連接至堿基或探針的珠粒來檢測結(jié)合的堿基或探針之后，該終止效應(yīng)就能夠被化學(xué)中和，使得堿基或探針能夠進(jìn)一步插入或結(jié)合于多核苷酸序列。在本領(lǐng)域中，這種類型的終止是已知的,例如Y OH基團(tuán)的修飾(例如Jingyue等人，US2004/0185466,

圖14)。在循環(huán)結(jié)束時，可以切割這些終止基團(tuán)以使聚合反應(yīng)能夠繼續(xù)(參見，Jingyue等人:PCT/US02/09752，該專利涉及用于此方法的合適的試劑)。在加入探針以用于例如連接方法的情況中，這些探針基本上終止該反應(yīng)(例如，在連接切割方法的情況下直至發(fā)生切割反應(yīng)或通過使用探針用于特異性序列)，并且因此在所述探針上不需要終止核苷酸，但可以使用終止堿基，如其中5'是去磷酸化的。通過使用合適的激酶可以將其重新引入下一個循環(huán)?？梢酝ㄟ^切割標(biāo)記的探針來除去探針的終止效應(yīng)，例如在涉及逐步連接和切割步驟的方法中，通過核酸酶(例如限制酶如核酸酶或RNA內(nèi)切酶)進(jìn)行切割。在一個優(yōu)選的方面，如果選擇其直徑大于靶多核苷酸長度的珠粒，則互補(bǔ)的探針或堿基的結(jié)合可以具有終止效應(yīng)。在該情況下，攜帶探針或堿基的第二珠粒不能接近該靶多核苷酸，其基本上終止了任何進(jìn)一步的延伸或結(jié)合。以這種方式甚至可以正確識別同聚體，條件是珠粒上的堿基是這樣放置的，使得兩個連續(xù)的堿基不能結(jié)合在來自相同珠粒的相同靶上。利用這種方法的一個優(yōu)點是不需要液體交換，或者可以直接地再利用該液體。如果由于缺少互補(bǔ)性而使多核苷酸與不能結(jié)合的測試堿基或探針接觸，則可以使用不同的測試探針(即，具有不同的測試互補(bǔ)堿基或探針部分)直至測試堿基或探針與該多核苷酸結(jié)合，即，可以進(jìn)行步驟(iii)。如在下文中描述的，在該方法期間，可以在不同的點，尤其是在任何測試堿基或探針與該多核苷酸接觸之前和/或之后，和/或在珠粒的釋放和除去之前評價珠粒是否與多核苷酸結(jié)合。如本文中定義的，“通過確定在步驟(i)至步驟(iii)期間...所述珠粒是否與所述多核苷酸結(jié)合來確定哪個測試互補(bǔ)堿基和/或測試探針的互補(bǔ)部分結(jié)合...”是指評價在步驟(i )至步驟(iii )期間所述珠粒的存在或不存在或來自與靶多核苷酸相關(guān)的所述珠粒信號水平，其指示了該測試堿基或探針結(jié)合至多核苷酸。如在本文中使用的，“結(jié)合”于所述多核苷酸的所述珠粒 經(jīng)由測試探針或堿基的中間性(intermediacy)來結(jié)合。在步驟(i)至步驟(iii)期間，可以在不同的時間評價該珠粒的存在或不存在或信號水平以便能夠測定，例如(a)在任意結(jié)合之前可以進(jìn)行評價(即在步驟(i )開始時)，(b)在任意步驟(i)、(ii)或(iii)之后評價珠粒結(jié)合以確定珠粒是否與該多核苷酸結(jié)合，和/或(c)在釋放并除去該珠粒之后評價珠粒結(jié)合。該評價可以是定量的或定性的。例如在下文中描述的，優(yōu)選地，在確定步驟(iv)期間除去該珠粒。然而，如果尚未除去珠粒，可以在步驟(iv)結(jié)束時除去該珠粒。確定步驟包括實現(xiàn)該確定的所有必需的動作，例如包括釋放并除去該珠粒，除非這樣的步驟是單獨陳述的。如上文所述，可以使用使得能夠?qū)崿F(xiàn)步驟(iv)的測定的各種不同的方案?？蓪y帶測試探針至單一排列的其最簡單珠粒添加至該靶多核苷酸，并且可以評價與所述靶結(jié)合的珠粒的存在以便確定該靶多核苷酸中是否存在該排列(即，特異性堿基)。然后，可釋放并除去該珠粒，并且用攜帶測試探針至不同排列的珠粒重復(fù)該方法，直到通過該珠粒的結(jié)合作為證據(jù)來識別相關(guān)的排列。在這種情況下，原位檢測該珠粒。在可替換的情況下，可以在釋放時檢測該珠粒?？梢允褂眠@樣的方法，其中珠粒的釋放指示了在研究中的堿基(例如，當(dāng)不同的探針組之間的區(qū)別特征是探針與珠粒的連接時)，那么在相關(guān)條件下(例如使用正確的限制酶用于在一種排列中的探針和珠粒之間的限制性位點)釋放該珠粒并且因此該珠粒的釋放指示了(一個或多個)靶堿基。在這個優(yōu)選的方面，所述測試探針或者珠粒與所述測試互補(bǔ)探針或互補(bǔ)堿基之間的連接包括限制酶的識別位點。在使用不同珠粒的情況下，產(chǎn)生的信號類型可用來確定哪個測試探針已經(jīng)結(jié)合。優(yōu)選地，為了提高準(zhǔn)確性，在循環(huán)期間檢測來自所述珠粒的信號水平，并且可以在各時間點進(jìn)行比較。方便地，在假定的結(jié)合之前和/或之后和/或在釋放和除去之后檢測該信號。在一個尤其優(yōu)選的方面，在其中通過切割來除去珠粒(如果結(jié)合)的方法中，在所述切割步驟之前和之后測量來自珠粒的信號，并且所述水平的減少指示了所述珠粒的結(jié)合，這使得能夠借助于連接至所述珠粒的探針來識別靶標(biāo)的一個或多個堿基。由于通過設(shè)計或默認(rèn)切割反應(yīng)可能是不完全的(例如連接或切割)，因此這種方法是有用的。如本文中提到的，所述珠粒的“信號”是取決于所使用的珠粒的性質(zhì)而檢測的信號，例如其磁性、旋光性、熒光、顏色等。在上述的方法中，與珠粒相關(guān)的信號或信號水平指示了所研究堿基的存在或不存在。因此，在一個優(yōu)選的方面中，通過確定存在或不存在與珠粒相關(guān)的信號或信號水平來進(jìn)行步驟(iv)，其中信號的存在是所述測試堿基或探針結(jié)合的指征。在進(jìn)一步的優(yōu)選的方面中，在切割步驟之前與之后確定與所述珠粒相關(guān)的信號水平，并且在切割之后信號減少指示了所述測試堿基或探針?！俺ニ鲋榱！笔侵笍脑摪卸嗪塑账峥臻g分離該珠粒，以便能夠在結(jié)合相關(guān)的測試堿基或探針(所述珠粒所連接的)之后，將珠粒相結(jié)合的靶多核苷酸與珠粒已從其釋放且被除去的多核苷酸區(qū)別。在釋放珠粒之后除去，例如通過斷裂一個或多個相關(guān)的鍵，在斷裂之后能夠自由地將珠粒從靶多核苷酸的位點除去。通過切割一個或多個鍵方便地實現(xiàn)釋放，例如在珠粒和堿基或連接至珠粒的探針之間的鍵或結(jié)合(association)(例如,破壞結(jié)合對中結(jié)合伴侶之間的結(jié)合)或通過切割鍵使得能夠一起除去珠粒以及與其連接的一個或多個堿基，例如在限制酶切反應(yīng)中。如在下文中論述的，在釋放該珠粒之后，例如可以通過磁體或流體流動來除去該珠粒。`在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面中，可以使用束縛的(tethered)珠粒。可以將該珠粒連接至固體載體或連接至靶分子的一部分或其連接分子，條件是它不影響本文中所描述的測序方法。在該方法中，將束縛的珠粒而不是外部提供的珠粒與每一個靶相結(jié)合，這樣它們具有更高程度的自由度直到將它們連接到結(jié)合至靶序列的探針/堿基。當(dāng)通過探針/堿基結(jié)合至靶時，加入的自由度限制可以是由于與束縛相比更短的靶長度或者是由于與所聯(lián)合的靶相比束縛(束縛體，tether)的定位，這導(dǎo)致相對于一些參考位置更短的距離和/或不同的定位，當(dāng)該方法在表面中使用檢測器時其可以作為檢測點。在這種類型的方法中，將測試堿基或探針結(jié)合至所述靶多核苷酸，并且攜帶結(jié)合伴侶以便使得束縛的珠粒(該束縛的珠粒攜帶該結(jié)合對中的另一個結(jié)合伴侶)能夠結(jié)合至那些堿基或探針。然而，應(yīng)當(dāng)注意避免使堿基或探針與珠粒過多地直接結(jié)合，即，在供應(yīng)時直接結(jié)合至該珠粒，而不是在珠粒被保持在遠(yuǎn)離靶處時首次結(jié)合至該靶子，然后隨著珠粒移向靶多核苷酸或自由的被允許移動時使珠粒與該靶結(jié)合，從而到達(dá)該靶(即，每一個珠粒到達(dá)其自己的靶)。在很多情況下，在聚合或連接期間，使用最佳設(shè)計的液體(例如，對于鏈霉親和素Dynabeads，使用“結(jié)合和洗滌液體”)的結(jié)合伴侶的結(jié)合比使用酶緩沖液的結(jié)合要快得多。在使用束縛的珠粒的情況下，珠粒的除去涉及從靶多核苷酸除去該珠粒，以便能夠接近探針或堿基從而在隨后的步驟或下一個循環(huán)中結(jié)合。在上述所描述的方法中，進(jìn)行該步驟一次或多次，并在每一個循環(huán)中識別所述序列的一個或多個堿基。如在上文中提及的，循環(huán)涉及識別靶序列的一個或多個堿基需要的步驟。如果在單一步驟中靶多核苷酸存在所有互補(bǔ)堿基/探針的排列，其具有例如使得能夠區(qū)別不同珠粒的檢測，即，一起使用所有的測試探針/堿基，則可以通過僅進(jìn)行一次該步驟來完成該循環(huán)。然而，如果并不是所有的測試堿基/探針都同時地存在以用于識別堿基或序列，則需要額外的步驟以便能夠識別堿基或靶序列。在該情況下，該方法包括如上文給出的步驟，但是其中對于所使用的每一組測試堿基/探針進(jìn)行步驟(i )(或步驟(i )和步驟
(ii))、步驟(iv)和步驟(V)，直到已經(jīng)實現(xiàn)識別。如在上文指出的，一個或多個堿基的識別可以是完全的或部分的。在本發(fā)明的一種實施方式中，本發(fā)明的方法包括聚合酶的使用與通過合成法進(jìn)行的測序。因此，在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了一種用于確定固定在固體載體上的單一多核苷酸的核苷酸序列的方法，包括以下步驟:(i)使所述多核苷酸與至少一種測試互補(bǔ)堿基(其可以互補(bǔ)于所述多核苷酸中的堿基)接觸，珠?；蚪Y(jié)合對的第一結(jié)合伴侶連接至該測試互補(bǔ)堿基，并且當(dāng)所述測試互補(bǔ)堿基互補(bǔ)于所述多核苷酸中的所述堿基時，通過聚合反應(yīng)將所述測試互補(bǔ)堿基共價結(jié)合至所述多核苷酸；(ii)當(dāng)將結(jié)合伴侶結(jié)合至所述測試互補(bǔ)堿基時，將連接至所述結(jié)合對的第二結(jié)合伴侶的珠結(jié)合至所述測試互補(bǔ)堿基，通過所述結(jié)合對將所述第一結(jié)合伴侶連接至所述測試互補(bǔ)堿基；·(iii)可選地使用至少一種不同的測試互補(bǔ)堿基重復(fù)步驟(i)、或步驟(i)與步驟
(ii)，直到互補(bǔ)于所述堿基的測試堿基結(jié)合至所述多核苷酸；( iv)通過確定在步驟(i )至步驟(iii )期間連接至所述測試互補(bǔ)堿基的所述珠粒是否結(jié)合至所述多核苷酸來確定哪一個測試互補(bǔ)堿基結(jié)合至多核苷酸的所述堿基，以便識別該多核苷酸的所述堿基；以及(V)如果在步驟(iv)期間沒有除去珠粒，則除去所述珠粒；其中，步驟(i)至步驟(V)的每一個循環(huán)進(jìn)行一次或多次，并在每一個循環(huán)中識別所述序列的一個喊基。該方法還能夠確定多核苷酸中的均聚物序列。優(yōu)選地，所述方法在聚合酶如DNA聚合酶或RNA聚合酶存在下進(jìn)行。優(yōu)選地，如上所述的方法包括使用經(jīng)修飾的堿基以便防止進(jìn)一步的鏈延伸，并且在所述方法結(jié)束時優(yōu)選采用額外的步驟，其中修飾所述堿基以便能夠進(jìn)一步的延伸，例如除去防止鏈延伸的保護(hù)基團(tuán)。在這種情況下，借助于連接至測試堿基的珠粒的存在能夠確定測試堿基的結(jié)合。方便地，如果連續(xù)加入四種不同堿基(例如A、G、C、T)中的每一種，即，依次至多核苷酸，則在加入每種不同類型的堿基后研究珠粒存在或不存在的確定。以這種方式，通過連接于該處的珠粒的存在可以識別結(jié)合或插入堿基(并且因此識別多核苷酸中堿基匹配的堿基)?？商鎿Q地，如下文進(jìn)一步詳細(xì)討論的，如果將所有堿基一起添加至多核苷酸，則用于四種堿基中的每一種，可以使用不同類型的珠粒作為標(biāo)記。識別連接至插入在多核苷酸中的堿基的具體珠粒類型，例如珠粒大小或顏色，則可以指示出所結(jié)合的具體堿基。作為通過合成進(jìn)行測序，該方法通常是已知的(上述的Jingyue等)。在該測序方法中，使用堿基的珠粒標(biāo)記以使得能夠容易地識別所結(jié)合的堿基，而無需昂貴的設(shè)備。為了避免延遲(stalling)，并且能夠讀取長的部分序列，優(yōu)選不依賴于聚合酶的方法的應(yīng)用。因此，在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明包括優(yōu)選使用連接酶通過連接反應(yīng)將一個或多個探針結(jié)合至多核苷酸序列(通過連接反應(yīng)來測序)。因此，在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了一種用于測定固定在固體載體上的單一多核苷酸的核苷酸序列的方法，包括以下步驟:(i)使所述多核苷酸與至少一個測試互補(bǔ)探針接觸，該測試互補(bǔ)探針包含可以互補(bǔ)于所述多核苷酸中的一個或多個堿基的部分，珠?；蚪Y(jié)合對的第一結(jié)合伴侶連接至該探針，并且當(dāng)所述測試互補(bǔ)探針的所述部分互補(bǔ)于所述多核苷酸中的所述一個或多個堿基時，通過將所述測試探針連接至所述多核苷酸將所述互補(bǔ)探針共價結(jié)合至所述多核苷酸，；(ii)當(dāng)將結(jié)合伴侶結(jié)合至所述測試互補(bǔ)探針時，將連接至所述結(jié)合對的第二結(jié)合伴侶的珠粒結(jié)合至所述測試互補(bǔ)探針，通過所述結(jié)合對將所述第一結(jié)合伴侶連接至所述測試互補(bǔ)探針；(iii)可選地使用至少一種不同的測試互補(bǔ)探針重復(fù)步驟(i )、或步驟(i )與步驟
(ii)，直到測試探針具有互補(bǔ)于結(jié)合至所述多核苷酸的所述一個或多個堿基的部分；( iv)通過確定在步驟(i )至步驟(iii )期間連接至所述測試探針的所述珠粒是否結(jié)合至所述多核苷酸來確定哪一測試探針的互補(bǔ)部分結(jié)合至多核苷酸的所述一個或多個堿基，以便識別該多核苷酸的所述一個或多個堿基；與(V)如果在步驟(iv)期間沒有除去該珠粒，則除去所述珠粒；其中，步驟(i)至步驟(V)的各個循環(huán)進(jìn)行一次或多次，并且在每一個循環(huán)中識別所述序列的一個或多個堿基。優(yōu)選地，使用連接酶來化學(xué)或酶促獲得所述連接。用于進(jìn)行該方法的合適的連接酶包括T4DNA連接酶。在該實施方式中，初始多核苷酸模板可以是單鏈，并且可以通過沿著該單鏈模板的雙鏈延伸(duplex extension)的一次或多次重復(fù)循環(huán)來確定其核苷酸序列。尤其是，延伸可以由初始化寡核苷酸與多核苷酸模板之間形成的雙鏈體開始，其中該初始化寡核苷酸通過將寡核苷酸探針連接至其末端來形成延伸的雙鏈體，以便在起始的延伸反應(yīng)中被延伸。通過連接至成功結(jié)合的寡核苷酸探針的珠粒的存在，可以確定多核苷酸中一個或多個核苷酸的特性。選擇所使用的初始化寡核苷酸與多核苷酸一起形成高度穩(wěn)定的雙鏈體，并且初始化寡核苷酸的長度通常大于連接反應(yīng)中使用的探針(具體的長度可以是20-30個核苷酸)。此外，該初始化寡核苷酸可以富含G/C。在US5，750，341中描述了初始化寡核苷酸的選擇。連接反應(yīng)中使用的探針應(yīng)當(dāng)能夠被連接至初始化寡核苷酸，并且當(dāng)互補(bǔ)存在時應(yīng)當(dāng)在連接之前與多核苷酸一 起形成雙鏈體。優(yōu)選地，探針(或其中結(jié)合至靶多核苷酸的區(qū)域)應(yīng)當(dāng)與多核苷酸完全匹配，以便能夠成功地識別該多核苷酸序列，即該探針應(yīng)當(dāng)與待識別的序列100%互補(bǔ)。探針可以包含至少2個核苷酸堿基，并且具體地可以包含3、4、5、6、
7、8、9或10個核苷酸堿基。為了獲得連接，優(yōu)選地所述探針具有3個或更多堿基的單鏈部分，例如4、5、6或7個堿基。如上述討論的，為了識別多核苷酸中的具體序列，應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生一組用于各種排列的探針，特定長度的探針中可能存在堿基的全部不同組合的代表。例如，2個核苷酸堿基的探針可以具有核苷酸堿基的16種不同組合，因此應(yīng)當(dāng)構(gòu)建16種不同的探針用于添加至多核苷酸序列。在每一個循環(huán)中，如果探針的長度大于待檢測的堿基數(shù)目，可以產(chǎn)生對于每一個排列的探針組?？梢员舜藛为毜睾瓦B續(xù)地加入不同的探針組，并且在每一次加入之后探究珠粒的存在或可以將不同的探針標(biāo)記于不同的珠粒并同時將其加入靶多核苷酸。在這個方面，特定珠粒的檢測可以指示特定探針的結(jié)合并且因此檢測多核苷酸中的相應(yīng)序列。在進(jìn)一步的實施方式中，可以通過使用逐步連接和切割的方法來確定多核苷酸的核苷酸序列，如在US5，714，330中描述的，其中使用珠粒標(biāo)記互補(bǔ)結(jié)合的探針或核苷酸堿基。該方法能夠識別多核苷酸序列的一個或多個末端核苷酸，并從該多核苷酸的末端除去一個或多個核苷酸，以便能夠進(jìn)行更進(jìn)一步所期望的連接和切割的循環(huán)。因此，在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了一種用于確定固定在固體載體上的單一多核苷酸的核苷酸序列的方法，包括以下步驟:(i)使用至少一種測試探針與所述多核苷酸以及可選地至少一個測試互補(bǔ)堿基接觸，該測試探針的一部分可以與所述多核苷酸中的一個或多個堿基互補(bǔ)，至少一個測試互補(bǔ)堿基可以與所述多核苷酸中的堿基互補(bǔ)，珠?；蚪Y(jié)合對的第一結(jié)合伴侶連接至所述多核苷酸和至少一個測試互補(bǔ)堿基中的任一個，并且當(dāng)所述測試互補(bǔ)堿基和/或所述測試互補(bǔ)探針的部分與所述多核苷酸中的所述一個或多個堿基互補(bǔ)時，通過將所述探針連接至所述多核苷酸，將所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針共價結(jié)合至所述多核苷酸；

(ii)當(dāng)將結(jié)合伴侶結(jié)合至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針時，將連接至所述結(jié)合對的第二結(jié)合伴侶的珠粒連接至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針，通過所述結(jié)合對將所述第一結(jié)合伴侶連接至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針；(iii)可選地使用至少一個不同的測試互補(bǔ)堿基和/或探針重復(fù)步驟(i )、或步驟(i)和步驟(ii)，直到與所述一個或多個堿基互補(bǔ)的測試堿基和/或一部分與所述一個或多個堿基互補(bǔ)的測試探針結(jié)合至所述多核苷酸；(iv)在每一步驟(i)、或步驟(i)與步驟(ii)之后、或在步驟(iii)之后，如果所述測試探針結(jié)合至所述多核苷酸，則加入一種能夠除去所述珠粒的酶，該酶通過切割反應(yīng)除去測試探針的至少一部分和待測序的多核苷酸的至少一個堿基；并且(V)通過確定在步驟(i)至步驟(iii)期間連接至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針的所述珠粒是否結(jié)合至所述多核苷酸，來確定哪一個測試互補(bǔ)堿基和/或測試探針的互補(bǔ)部分結(jié)合至多核苷酸的所述一個或多個堿基，以識別該多核苷酸的所述一個或多個堿基；其中，步驟(i)至步驟(V)的各個循環(huán)進(jìn)行一次或多次，并且在每一個循環(huán)中識別所述序列的一個或多個堿基。與上文中所描述的一般方法相比，使用了加入切割酶的步驟。在先前的方法中這種步驟落在測定步驟(iv)的范圍內(nèi)，但是在該優(yōu)選的方面中是單獨陳述的。
優(yōu)選地，所述酶是核酸酶，例如限制酶，該核酸酶具有與其識別位點不同的切割位點，并且所述探針包括所述核酸酶的識別位點。在這種情況下，切割導(dǎo)致從靶多核苷酸除去一個或多個堿基。這使得能夠重復(fù)該方法?？蛇x地，每一個測試探針具有不同核酸酶的識別位點。在所述方法中，如果可以在循環(huán)期間鑒別測試互補(bǔ)堿基或探針，在每一個循環(huán)中可以使用超過一種測試互補(bǔ)堿基或探針。如果同時使用多種測試互補(bǔ)探針，在步驟(iv)中可選地可以連續(xù)使用各自能夠從不同的測試互補(bǔ)探針中除去珠粒的多種酶。當(dāng)使用互補(bǔ)堿基時,該互補(bǔ)堿基可以攜帶珠?；蛴糜谶B接珠粒的部件(means)。該互補(bǔ)堿基可以是通過聚合反應(yīng)加入至延伸鏈末端的終止核苷酸。該堿基可以接近于結(jié)合至靶多核苷酸的探針。在其中還應(yīng)用了互補(bǔ)堿基的方法中，可以使用這些堿基以在自由3'末端(其中，探針結(jié)合于該位點的下游)來結(jié)合靶序列，并且可以使用合適的聚合酶通過聚合反應(yīng)來連接這些堿基。珠?？梢耘c堿基或探針相連，但是在切割時必須釋放該珠粒?？梢岳檬褂没パa(bǔ)測試堿基的各種方法。在測試堿基簡單地用于完成待切割的雙鏈部分而不是與待測序的堿基互補(bǔ)的情況中，在反應(yīng)中可以同時使用所有四種可能的堿基，并且序列的確定是基于結(jié)合的那個測試探針。在該情況下，在上述方法中，步驟(i)中還使用了聚合酶。通過連接將測試探針結(jié)合至靶多核苷酸。由于在切割時除去了插入堿基與至少一部分的測試探針(優(yōu)選所有測試探針)，(一個或多個)堿基或(一個或多個)測試探針可以攜帶珠粒。相對而言，如果待測序的堿基之一是測試堿基結(jié)合的堿基，由于探針提供了確定該探針通過其是否被連接至靶來結(jié)合并且為了切割而存在的部分(means)，因此應(yīng)當(dāng)使用具有第一測試探針的第一測試堿基，以便可以通過第一測試探針的結(jié)合和切割來識別第一測試堿基的結(jié)合。在該情況下，在切割步驟之前，應(yīng)當(dāng)加入和連接步驟(i )中的第一測試探針和與堿基，并且應(yīng)當(dāng)在加入和連接第二測試探針和堿基等之前除去過量的測試探針和堿基等。在該情況中，可以將珠粒連接至測試堿基或探針。然而，方便地，為了盡可能的簡化該方法，待檢測的(一個或多個)堿基與測試探針中的一個或多個堿基互補(bǔ)，并且沒有使用測試堿基(即該探針結(jié) 合靶多核苷酸的單鏈部分的3'末端)或者一起使用所有可能的堿基來完成所得分子的雙鏈部分，以便能夠用于隨后的切割。在這種方法中，為了能夠進(jìn)行逐步連接和切割方法，在該方法期間必須結(jié)合測試探針，并且因此在步驟(i)中，所述測試互補(bǔ)探針通過連接反應(yīng)共價結(jié)合至所述多核苷酸，如果進(jìn)行必需步驟(iii)直到一部分與所述一個或多個堿基互補(bǔ)的測試探針結(jié)合至所述多核苷酸，并且可選地測試互補(bǔ)堿基結(jié)合至所述多核苷酸。在本發(fā)明的方法中所使用的用于逐步連接和切割的測試探針優(yōu)選地包括雙鏈部分，該雙鏈部分包含核酸酶的識別位點，并且可以進(jìn)一步具有突出鏈(或單鏈部分)，該突出鏈可以與多核苷酸的互補(bǔ)突出鏈一起形成雙鏈體。以這種方式，將探針連接至具有互補(bǔ)突出部分的多核苷酸?？梢越柚谶B接至測試探針的珠?；蛘呓柚谶B接至核苷酸堿基的珠粒(在連接步驟之前將該珠粒插入多核苷酸中)來確定多核苷酸序列。不論哪一種情況，在探針的連接之后，進(jìn)行了切割，例如通過核酸酶，其識別探針內(nèi)的序列(在來自連接位點的一個或多個核苷酸處沿著多核苷酸)切割連接的復(fù)合物，留下一個末端，該末端可以參與更進(jìn)一步的連接反應(yīng)和/或聚合反應(yīng)的循環(huán)，并釋放該珠粒(具有相關(guān)的核苷酸)以便允許其除去。如本領(lǐng)域中已知的，在依賴引入切割的限制性位點的方法中，如果限制性位點出現(xiàn)在靶序列中時，則會影響測序。在固定靶之前，可以通過具有相同的限制酶或具有相同識別序列的限制酶來切割該靶以便避免該問題?？商鎿Q地，可以通過靶序列的甲基化來避免該問題。在該方法中，可以使用如在上文中描述的限制酶(IIs型或IIb型)。優(yōu)選利用IIb型限制酶，在切割時產(chǎn)生5'堿基突出端。在確定珠粒是否連接時，可以使用如在上文中描述的檢測步驟。因此，可以檢測與珠粒相關(guān)的信號的存在或不存在或水平。根據(jù)本發(fā)明，在尤其優(yōu)選的方面中，進(jìn)行定量評價來確定連接至多核苷酸的信號的水平(來自珠粒)。如本發(fā)明的其他方法一樣，該珠粒和/或它們的連接基團(tuán)對于每一個排列的堿基或探針可以是不同的，并且可以是可辨識的，以使得在該方法期間能夠一起加入它們并且進(jìn)行單獨的檢測。可替換的，用于所有測試探針的珠粒可以是相同的并且可以連續(xù)的加入每一個探針組，即可以重復(fù)步驟(i )(或步驟(i )與步驟(ii ))與步驟(iV)直到利用了與相關(guān)的互補(bǔ)探針或者喊基一起的探針組。如果可以在步驟(iv)與步驟(V)中區(qū)別探針組，可以一起加入探針組?？梢曰谔结樀闹榱；蛘呃缭谀切┨结樦械淖R別位點來區(qū)別探針。因此，例如，可以將不同的探針組結(jié)合至相同的珠?；蛘呦嗤愋偷闹榱?，但是一組或多組探針可以具有不同的限制性位點。在該情況下，可以將一組或多組探針加入至反應(yīng)中，然后可以使用連續(xù)的限制酶，該限制酶涉及特異的探針限制性位點。通過特定的限制酶的釋放將指示相關(guān)的探針結(jié)合，并且因此指示靶序列/堿基的特性。例如，該方法可以使用2種、3種、更多種限制酶，該限制酶在突出端中具有相同數(shù)量的堿基，接著，在每一次加入的前后檢測與靶相連的珠粒。在4種不同的探針組的情況下，通過不同的限制性位點可以區(qū)別每一個探針組并且可以同時加入所有的探針組隨后進(jìn)行連續(xù)的切割反應(yīng)?？商鎿Q地，在兩個不同的循環(huán)中可以使用兩個探針組，其中在每一個循環(huán)中不同的酶可以進(jìn)行兩輪的切割?？赡艽嬖诓煌M合。例如，可以使用由G和T探針組成的探針組進(jìn)行連接，隨后使用A和C探針的混合物進(jìn)行連接。如果A和G探針使用一種限制酶，而C和T探針使用另一種限制酶，則可以在兩次連接和兩次切割之后區(qū)別所用四種堿基。使用另一種分組，使用三種連接與三種切割能夠區(qū)別9組。通過被檢測的組的合適組合(該組具有兩種或更多種堿基)，即不完全改變，但是可能部分改變，能夠特異地提高數(shù)據(jù)質(zhì)量，其中該連接至少是選擇性的，如用于T/G檢測。如上所述，通過在該方法中的各種位點處評價珠粒的不存在或者存在或者與珠粒相關(guān)的信號水平，來進(jìn)行確定結(jié)合的互補(bǔ)堿基或者探針的步驟。因此，步驟(V)涉及可以在該方法中的各時間點處進(jìn)行的測定。因此，例如在結(jié)合時可以檢測該珠粒并簡單使用切割步驟來除去該珠粒?？商鎿Q地，當(dāng)進(jìn)行切割步驟(步驟(iv))時僅會顯示關(guān)于探針是否結(jié)合的信息，并且在該情況下在切割步驟之后進(jìn)行測定。然而，優(yōu)選地進(jìn)行兩個步驟以用于比較目的?？梢允褂酶鞣N的順序用于該步驟，這取決于所使用的探針與酶。因此，如果兩種或更多種探針的鑒 別可以借助于它們的珠?；蛘咚鼈兊那懈罘磻?yīng)，在切割之前可以將它們一起或者連續(xù)地加入。如果通過切割反應(yīng)鑒別它們，可以連續(xù)地加入切割酶。可替換地，可以連續(xù)加入探針并且在每次加入之后進(jìn)行切割。在這些情況中，可以在探針的加入之前、在它們的加入之后、在切割之前或者在切割之后進(jìn)行珠粒的檢測，并且可以用于每一個探針的結(jié)合或者切割步驟或者在多重探針除去之后或者多種切割步驟進(jìn)行珠粒的檢測，這取決于所使用的方案。在一個優(yōu)選的方面，在上述方法中使用多重切割酶，其能夠區(qū)別結(jié)合的探針和/或堿基。因此，在一種尤其優(yōu)選的方法中，本發(fā)明提供了一種用于確定固定在固體載體上的單一多核苷酸的核苷酸序列的方法，包括以下步驟:(i) (a)使所述多核苷酸與至少第一和第二測試探針以及可選地至少一個測試互補(bǔ)堿基接觸，每一個測試探針包括可以互補(bǔ)于所述多核苷酸中的一個或多個堿基的部分，至少一個測試互 補(bǔ)堿基中的每一個可以互補(bǔ)于所述多核苷酸中的堿基，珠?；蚪Y(jié)合對的第一結(jié)合伴侶連接至所述測試堿基和/或探針，并且當(dāng)通過將所述第一或第二探針連接至所述多核苷酸所述檢測的所述測試互補(bǔ)探針的第一或第二互補(bǔ)部分與所述多核苷酸中的所述一個或多個堿基互補(bǔ)時，將所述第一或第二測試互補(bǔ)堿基共價結(jié)合至所述多核苷酸；(b)當(dāng)將結(jié)合伴侶結(jié)合至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針時，將連接至所述結(jié)合對的第二結(jié)合伴侶的珠粒結(jié)合至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針，通過所述結(jié)合對將所述第一結(jié)合伴侶連接至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針；(ii)如果所述第一測試探針結(jié)合至所述多核苷酸，加入第一種酶，該酶能夠除去至少一部分的所述第一測試探針與至少一種通過切割反應(yīng)待測序的多核苷酸的堿基，然后如果所述第二測試探針結(jié)合至所述多核苷酸，連續(xù)加入至少第二種酶，該酶能夠除去至少部分的所述第二探針，其中，每一種酶是不同的并且特異于所述第一探針或第二探針；(iii)使用至少兩種不同的測試互補(bǔ)探針與至少兩種酶可選地重復(fù)步驟(i)與步驟(ii)，其中，所述酶對于步驟(ii)中使用的酶可以是相同的或不同的，直到部分所述一個或多個堿基互補(bǔ)的測試探針結(jié)合至所述多核苷酸，以及可選地測試互補(bǔ)堿基結(jié)合至所述多核苷酸；(iv)通過確定在步驟(i)、(ii)或(iii)期間連接至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針的所述珠粒是否結(jié)合至所述多核苷酸，來測定哪一個測試互補(bǔ)堿基和/或測試探針的互補(bǔ)部分結(jié)合至多核苷酸的所述一個或多個堿基，以便識別該多核苷酸的所述一個或多個堿基;其中，步驟(i)至步驟(iv)的各個循環(huán)進(jìn)行一次或多次，并且在每一個循環(huán)中識別所述序列的一個或多個堿基。要加入的至少兩種測試探針，可以連續(xù)加入或者一起加入或加入其組合(例如一起加入兩種探針，隨后進(jìn)一步加入兩種探針)。當(dāng)連續(xù)加入時，可以在每一次加入之后進(jìn)行連接步驟(當(dāng)還使用測試堿基時，該加入是適當(dāng)?shù)?或優(yōu)選地一旦加入所有的測試探針就進(jìn)行連接步驟。如下文討論的，在該方法中，可以使用多于四種探針，所有的探針可以連續(xù)加入和/或一起加入。在該方法的優(yōu)選方面，在步驟(i)中使用至少第一、第二、第三和第四測試探針(每一種測試探針包括可以互補(bǔ)于所述多核苷酸中的一個或多個堿基的部分)，在步驟(ii )中使用至少第一、第二、第三和第四種酶，所有的酶是不同的，并且特異于所述第一、第二、第三或第四探針。在可替換的優(yōu)選實施方式中，步驟(i )中，使用至少第一和第二測試探針，其均包含可以互補(bǔ)于所述多核苷酸中的一個或多個堿基的部分，并且在步驟(ii)中使用至少第一與第二酶。優(yōu)選地，在每一個循環(huán)中識別所述序列的多于一個堿基。在該方面的優(yōu)選實施方式中，步驟(i)至(iv)重復(fù)多于一次，即進(jìn)行多于一個循環(huán)，如在下文中討論的，優(yōu)選至少2個循環(huán)。在一個尤其優(yōu)選的方面，重復(fù)所述步驟以便測試所有的測試堿基或探針組。在所述方法中，可以在每一個循環(huán)中使用兩種或更多種測試互補(bǔ)堿基或探針。在步驟(ii)中，可以連續(xù)使用多種酶，每一種酶能夠切割不同的測試互補(bǔ)探針。根據(jù)本發(fā)明的該方面，可以通過特異于該探針的酶來切割該探針。因此，方便地，該探針包括至少一個切割酶的識別位點。該“能夠除去至少部分的所述測試探針的酶”是一種切割酶，當(dāng)該測試探針結(jié)合至靶核苷酸序列時，該切割酶識別并結(jié)合至測試探針并且切割該測試探針和/或切割在靶多核苷酸上接近于所述探針的序列，但是當(dāng)探針未結(jié)合至靶核苷酸序列時，該切割酶則不必結(jié)合或切割所述測試探針。當(dāng)所述酶切割測試探針時，該切割進(jìn)行有效切割并因此從靶多核苷酸:探針復(fù)合物中除去該探針的切割部分。當(dāng)所述酶切割相鄰的序列時，該切割發(fā)生在所述探針的上游或下游，以便在切割時將該探針(其整體)與一些靶多核苷酸序列從該靶多核苷酸:探針復(fù)合物中除去。優(yōu)選該切割與識別位點是分離的。盡管該識別位點由至少一部分的探針序列構(gòu)成，該切割位點可以不包含任何該探針序列，例如，當(dāng)切割位點在識別位點的上游或下游時，例如當(dāng)酶是限制酶時。該切割位點可以在珠粒與探針剩余部分(rest)之間，其結(jié)合至被測序的靶多核苷酸。在該情況下，根據(jù)需要，為了能夠進(jìn)行反復(fù)的測序反應(yīng)，可以需要更多的切割酶來除去剩余的部分探針和至少 一部分的靶序列來顯示用于測序的新堿基。然而，方便地，定位該切割位點以便在切割時該探針從靶多核苷酸:探針復(fù)合物以及靶多核苷酸的至少一個堿基中完全地除去。優(yōu)選地，所述酶是如在上文中描述的核酸酶，并且每一個測試探針(或探針組)具有對于不同的核酸酶的識別位點。在本發(fā)明的方法的該方面中，至少利用第一與第二探針，該探針具有特異于各自的探針的第一與第二酶。因此，當(dāng)該探針結(jié)合至待測序的多核苷酸時，第一酶識別并切割第一(而不是第二)探針，即，其特異性識別或切割第一探針而不識別或切割第二探針。方便地，通過使用含有不同識別位點的酶(和對應(yīng)的探針)來實現(xiàn)。因在，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，每一種酶是核酸酶，該核酸酶具有不同于其識別位點的切割位點，所述測試探針包括用于所述核酸酶的識別位點，并且在所述方法中使用的每一種酶具有不同的識別位點。酶的切割位點可以是相同的或不同的。優(yōu)選地，如上文討論的，所述酶是限制酶，優(yōu)選IIb型限制酶，并且在所述方法中使用的每一種酶是不同的限制酶。在上述方法中，在步驟(i)至步驟(iii)期間的各個時間點評價珠粒的存在或不存在以便能夠確定，例如(a)在任何結(jié)合(即在步驟(i)開始時)之前進(jìn)行評價，(b)在步驟
(i)或者步驟(iii)(部分(i))之后評價結(jié)合，以便確定珠粒是否結(jié)合至多核苷酸，和/或(c)在切割之后(即在步驟(ii)或者步驟(iii)(步驟(ii))之后)評價結(jié)合。由于該方法依賴于通過不同的酶來選擇性的切割，因此至少在切割步驟之后進(jìn)行測定。在該方法中，其中珠粒提供了附加的序列信息，至少在步驟(i)或步驟(iii)(部分(i))的結(jié)合之后進(jìn)行測定。本發(fā)明允許使用單一珠粒，但是也可以使用多個不同的珠粒，每一個珠粒產(chǎn)生不同類型的信號，以便識別結(jié)合的測試探針?？梢允褂眠@種方法作為額外確認(rèn)(一個或多個)靶堿基的特性，例如通過探針的切割特性與探針連接的珠粒來識別結(jié)合探針?？商鎿Q地，在該方法期間，可以使用這種方法來顯示額外的測序信息。當(dāng)使用單一類型珠粒時，在切割反應(yīng)期間使用該單一珠粒來識別哪個探針是結(jié)合的以及哪個探針被除去的。由于該珠粒獨立于切割識別位點，因此還可以使用該珠粒來提供額外的測序信息。因此，例如，對于兩種堿基的變化同樣的可以產(chǎn)生16種探針來涵蓋可能的每一個排列。然后，可以將這些探針歸類成組，其中第一(或者第二堿基)是相同的但是另一個所關(guān)心的堿基是改變的，即歸類成4種探針組，所有的探針組攜帶相同的珠粒類型但是其中基于它們的切割特性來區(qū)別4種探針的組合，即切割酶識別位點。在該方法中加入第一探針組并且評價了來自組中(切割之前)的探針的結(jié)合。如果沒有探針結(jié)合，則加入第二探針組等直到探針結(jié)合。一旦來自探針組的探針結(jié)合，則允許識別序列中的一個堿基，其是基于探針組的特性，其中第一(或第二)堿基是不變的。為了識別第二 (或者第一)堿基，即結(jié)合自4種探針組的探針內(nèi)的特異性探針的特性，使用每一個不同的切割酶進(jìn)行連續(xù)的切割反應(yīng)，直到發(fā)生切割并且釋放該珠粒。以這種方式，在單一循環(huán)中可以識別第一和第二堿基。方便地，在這種方法中還可以使用多種不同的珠粒，并且在該情況下可以同時使用所有的探針組。因此，例如在每一循環(huán)中同樣的可以確定兩個相鄰的堿基，其中一個堿基基于珠粒類型來確定，并且另一個堿基基于探針的切割特性來確定。在這種情況下，同樣可以產(chǎn)生16種探針來涵蓋兩種堿基中變化的可能存在的每一排列。可以基于不同的珠粒來區(qū)別針對第一堿基不同的4種探針組，并且可以基于4種探針組的切割特性來區(qū)別針對第二堿基不同的4種探針組。在本發(fā)明的方法中，可以一起或者連續(xù)使用該4種探針組。因此，例如，如果一起使用探針組，并且使用不同的切割酶連續(xù)切割，同樣可以檢測結(jié)合的珠粒并且需要切割酶用于切割以便識別16種探針中的哪個是結(jié)合的，并且因此在每一循環(huán)中可以測序兩種堿基。
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應(yīng)當(dāng)理解，可以通過使用如上文討論的不同的鑒別技術(shù)和/或連續(xù)的加入探針或者探針組在單一循環(huán)中識別更多的堿基。通過舉例，可以通過使用連續(xù)加入的4種探針組來識別3個堿基，在第一探針組(探針組I)中每一探針在N位置是不變的，但是在探針組中提供在N+1與N+2位置的每一排列的探針。在探針組內(nèi)，可以通過用于不同改變的不同的信號方法識別在N+1處改變的探針，并且可以通過用于不同改變的不同的切割特性識別N+2位置處改變的探針。在本發(fā)明的方法中，將探針組I加入靶多核苷酸。如果在探針組I中沒有探針結(jié)合，則將探針組2與靶多核苷酸接觸等直到探針結(jié)合。一旦發(fā)生結(jié)合，檢測結(jié)合探針的信號裝置(mean)，之后使用相關(guān)的酶連續(xù)切割。通過包含結(jié)合探針的探針組顯示N位置的特性，信號裝置的特性能夠識別N+1位置并且切割以便移去至少部分探針的酶顯示了 N+2位置的特性。因此，在優(yōu)選的方面中，本方法提供了一種方法，其中所述第一與第二探針包括第一組和第二組探針，并且珠粒連接至所述探針和/或堿基，連續(xù)加入所述至少第一與第二探針組和/或堿基并且在每一次加入之后檢測與該珠粒相關(guān)的信號，以便確定結(jié)合至所述多核苷酸的那個測試互補(bǔ)堿基和/或探針，以確定所述靶序列的一個或多個堿基的序列，其中所識別的一個或多個堿基是不同于通過測定步驟(ii)期間被切割的探針來識別的一個或多個堿基。在一個尤其優(yōu)選的方面，使用的珠?？梢允遣煌?。在該情況下，可以一起加入第一和第二探針和/或堿基，并且在單一步驟中進(jìn)行測定。因此，在一個優(yōu)選的方面，所述第一和第二探針包括第一組與第二組探針，并且將不同的珠粒(該珠粒可以被鑒別)連接至探針的每一組的至少兩種探針和/或測試堿基，并檢測與所述不同的珠粒相關(guān)的信號，以便測定結(jié)合至所述多核苷酸的那個測試互補(bǔ)堿基和/或探針，以確定所述靶序列的一個或多個堿基的序列，其中所識別的一個或多個堿基不同于通過測定步驟(ii)期間被切割的探針來識別的一個或多個堿基。在這種情況下，基于第一組或第二組探針的切割特性來區(qū)別第一或第二探針組，并且基于探針的珠粒來識別在組內(nèi)的探針。方便地，使用4種探針組，每一探針組包括4種不同的探針，可以鑒別連接至不同珠粒的4種不同的探針。在本發(fā)明的方法中，互補(bǔ)堿基或探針在結(jié)合至多核苷酸之前被珠粒標(biāo)記或通過利用結(jié)合伴侶在結(jié)合至多核苷酸之后標(biāo)記珠粒。在一種具體的實施方式中，在結(jié)合至多核苷酸之后標(biāo)記該堿基或探針。如果在結(jié)合之后標(biāo)記，應(yīng)當(dāng)在確定連接至結(jié)合堿基或探針的珠粒存在的步驟之前進(jìn)行除去任何未結(jié)合珠粒的步驟。這可以通過利用磁體容易地實現(xiàn)，例如當(dāng)該珠粒為順磁性時。類似地，如果在結(jié)合之前標(biāo)記堿基/探針，則應(yīng)當(dāng)在確定連接至結(jié)合堿基或探針的珠粒的存在的步驟之前進(jìn)行除去任何未結(jié)合堿基/探針珠粒標(biāo)記的復(fù)合物的步驟。 可以在原位(即當(dāng)連接至靶序列時)或在釋放時檢測標(biāo)記的探針或者堿基。在后一種情況中，沖洗測序反應(yīng)以便從混合物中除去未連接的珠粒，并且然后如在下文中描述的釋放該珠粒。在釋放的混合物中珠粒的存在證明了在靶序列中相應(yīng)的(一個或多個)互補(bǔ)堿基的存在。在可以開始評價下一組的測試探針之前，必須從靶序列中(或者用于重復(fù)使用的釋放的探針或者堿基)釋放并且除去珠粒。在其中在原位檢測珠粒的方法中，在檢測珠粒之后必須將其釋放并且除去該珠粒?？梢酝ㄟ^任何合適的方法釋放珠粒例如通過酶切法(如使用RNA核酸內(nèi)切酶)、化學(xué)法、光化學(xué)法(參見W02004/007773和PCT/US2003/021818)或者機(jī)械切割法。當(dāng)利用逐步連接和切割的方法時，酶切包括核酸酶切割。在這種方法中，通過使用核酸酶(該核酸酶具有不同于識別位點的切割位點)使切割位點出現(xiàn)在靶多核苷酸中。在本發(fā)明的其它方法中，還可以通過酶切來釋放該珠粒。因此，可以將切割位點設(shè)置在堿基或探針與珠粒之間。尤其是，可以將限制酶位點插入在珠粒與堿基或探針之間?？梢允褂萌魏蜗拗泼福缓笫褂眠m合該位點的任何限制酶來實現(xiàn)切割。尤其是，如在上文中描述的，可以利用IIs型或IIb型限制性核酸內(nèi)切酶?？梢灾苯拥貙⑾拗莆稽c或切割位點設(shè)置在接近于堿基或探針(即在最接近于珠粒的探針部分)以便能夠與任何接頭(linker) —起切割該珠粒，或者可以直接地將其它存在的結(jié)合部分或者限制位點或者切割位點設(shè)置在接近于該珠粒以便能夠切割，并且可以再利用該珠粒。如果通過連接反應(yīng)將珠粒標(biāo)記的探針插入多核苷酸中，則可以使用切口限制酶(nicking restriction enzyme)來釋放該珠粒。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，可以使用機(jī)械切割以避免如在一些現(xiàn)有技術(shù)的測序方法中需要的化學(xué)除去。當(dāng)將該方法用于聚合測序(其中使用預(yù)標(biāo)記的珠粒或堿基)方法中時，相比于化學(xué)或者光化學(xué)切割，該方法是尤其有用的，因為在弱連接時僅僅切斷了包含的修飾堿基。在釋放的珠粒上的其它堿基沒有被切割，該堿基可能已經(jīng)發(fā)生斷裂(disruptive),同樣地通過聚合反應(yīng)可以很容易插入該堿基?？梢酝ㄟ^使用更大磁性的活性珠?；蛘咄ㄟ^加速流動池(flow cell),或來自兩種或更多種的磁性、加速度與振動的結(jié)合力借助于提高的磁力來釋放小的順磁性珠粒，后者(振動)的頻率優(yōu)選接近于靶/珠粒體系的機(jī)械共振頻率。另一種可以容易地單獨釋放珠粒的力或者與前者結(jié)合的力是產(chǎn)生自流體流動的力。采用該形式的釋放形成了本發(fā)明的優(yōu)選的方面。只要在珠粒上有足夠的剩余堿基并且焦磷酸鹽的水平足夠低，就可以再利用該液體?？梢允褂弥榱５亩ㄆ谠傺a(bǔ)給和/或焦磷酸鹽的除去。然后可以從反應(yīng)中除去切割的珠粒，例如當(dāng)該珠粒是順磁性時可以使用磁體?？商鎿Q地，可以通過分離和洗滌來實現(xiàn)除去，例如使用流體流動，如在芯片內(nèi)。可以使用這些技術(shù)的組合。在該切割的珠粒已經(jīng)被除去之后可以進(jìn)行更多珠粒的檢測或可視化步驟，以便核對已經(jīng)成功的除去所有的珠粒，在反應(yīng)之前進(jìn)行恢復(fù)，例如在鏈終止效應(yīng)中和之前并且優(yōu)選地進(jìn)行該步驟。如在本文中所使用的，術(shù)語"珠粒"是指微粒，其通常是、但不一定是球形固體載體。雖然珠粒的大小并不是關(guān)鍵的，但它們可以例如具有至少0.05,0.1,0.3,0.5、1、1.5、2、
2.5、3或3.5 μ m的直徑量級并具有不大于50、20、10、8或6 μ m的最大直徑。尤其是，在本發(fā)明中可以使用I或2.8或4.5或10 μ m的珠粒。直徑是指沿著珠粒的最長軸或沿著球形珠粒的任何軸的大小。"半徑"是指上述直徑的一半。在本文描述的方法中，對于每個單一多核苷酸，在每個循環(huán)中，僅結(jié)合單一探針/堿基和單一連接珠粒。以復(fù)數(shù)形式提及"珠粒"應(yīng)理解為單數(shù)形式或反映一起進(jìn)行的多個反應(yīng)但各自針對單一多核苷酸。

單分散性珠粒，其具有基本上均一的大小(例如具有直徑標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%的大小)，可以用于本發(fā)明，因為它們提供反應(yīng)的非常均勻的可重復(fù)性。可以由能夠形成適宜載體的任何材料制備珠粒。適用于本發(fā)明的方法的非磁性聚合物珠?？色@自Invitrogen以及可獲自Qiagen、Serotec、Merck、Promega (僅舉幾例)。非磁性珠?？梢杂杀绢I(lǐng)域公知的許多不同材料制備，例如，由塑料制備，例如由聚苯乙烯制備。然而，為了有助于操作和分離，磁珠是優(yōu)選的。如在本文中所使用的，術(shù)語"磁性的"是指珠粒能夠具有當(dāng)被放置在磁場中時賦予它的磁矩，因而在磁場的作用下是可位移的。換句話說，可以通過磁團(tuán)聚容易地除去磁珠，其提供在用測試堿基或探針溫育珠粒以后或在從多核苷酸切割它們以后快速、簡單和有效的分離任何未連接珠粒的方式。相對于在現(xiàn)有技術(shù)的許多測序方法中所使用的熒光團(tuán)，這提供明顯的優(yōu)勢。因此，通過施加磁場，例如利用永磁體，可以在適宜的表面上除去未結(jié)合的磁性顆粒。磁珠包括響應(yīng)于磁場的磁響應(yīng)材料，例如，順磁性材料、鐵磁材料、亞鐵磁材料和變磁材料。因此，可以使用鐵、鎳和鈷以及金屬氧化物如Fe304、BaFe12O19^ CoO, NiO, Μη203、Cr2O3和CoMnP。磁響應(yīng)材料可以僅是珠粒的一種成分，其余部分可以由磁響應(yīng)材料與其附著的聚合物材料組成。在珠粒中磁響應(yīng)材料的量并不是關(guān)鍵的并且可以在寬范圍內(nèi)變化,例如,整個顆粒的按重量計約1%至約75%。范圍可以是2%至50%，3%至25%或5%至15%。可以將磁響應(yīng)材料分散于整個聚合物，施加為在聚合物表面上的涂層或以任何其它方式并入或固定，其將磁響應(yīng)材料固定于聚合物。因此，磁響應(yīng)材料可以形成珠粒的核或核心。形成珠粒的其余部分的聚合物材料可以是可以形成為固體珠粒的任何材料。適宜聚合物的實例是聚酯、聚醚、聚烯烴、聚環(huán)氧烷、聚酰胺、聚氨酯、多糖、纖維素和聚異戊二烯。在許多聚合物中，交聯(lián)可用于賦予珠粒結(jié)構(gòu)完整性和剛性。還可以使用超順磁珠例如由Sintef在EP-A-106873中描述的那些超順磁珠，其使得能夠避免甚至具有高滲透性的珠粒的磁團(tuán)聚和凝集(clumping)。另外，由Invitrogen出售的作為Dynabead的磁性顆粒特別適用于本發(fā)明。使用磁珠特別有利的是，可以將珠粒"下拉"到多核苷酸上，其可以被固定于固體載體上，以能夠?qū)⒅榱?biāo)記的堿基或探針更加快速地并入多核苷酸，或能夠?qū)⒅榱８涌焖俚亟Y(jié)合于堿基或探針，其已并入多核苷酸但還未被標(biāo)記。根據(jù)在本領(lǐng)域已知的和在文獻(xiàn)中描述的技術(shù)，在并入多核苷酸以前或以后，以任何方便的方式，可以直接或間接地將珠粒連接于測試互補(bǔ)堿基或探針，但要確保珠粒并不阻止它所連接的探針或堿基進(jìn)入靶標(biāo)多核苷酸，或防止所需要的反應(yīng)發(fā)生，例如，聚合、連接或切割反應(yīng)。因此，可以直接將堿基或探針連接于珠粒。通過本領(lǐng)域已知的方法(例如偶聯(lián)化學(xué))可以容易地實現(xiàn)上述連接，以及方便地，可以將堿基或探針直接結(jié)合于珠粒，例如通過涂布(coating)?？商鎿Q地，可以·將珠粒間接連接于測試互補(bǔ)堿基或探針。因此，可以通過可以直接連接于珠粒的一個或多個其它分子將堿基或探針連接于珠粒。這些可以產(chǎn)生共價或非共價連接。在優(yōu)選方面，珠?？梢詳y帶一個或多個連接部分或間隔區(qū)(spacer),其對于堿基或探針或?qū)τ诓⑷雺A基或探針的標(biāo)記具有親和力。優(yōu)選地，經(jīng)由結(jié)合伴侶來實現(xiàn)這種間接結(jié)合。在這種情況下，珠粒可以方便地攜帶或提供有能夠結(jié)合于堿基或探針的結(jié)合部分，使得借助于結(jié)合對的至少兩個結(jié)合伴侶進(jìn)行結(jié)合。如本文所指的，"結(jié)合對"是指分子對，其形成特定的和穩(wěn)定的相互作用。實例包括DNA:DNA、配體:受體、抗體:抗原相互作用。上述結(jié)合部分在本領(lǐng)域中是公知的，例如可以使用生物素/鏈霉親和素，其中將堿基或探針結(jié)合于生物素基團(tuán)并用鏈霉親和素涂布珠粒。在優(yōu)選方面，可以將堿基或探針連接于珠粒，其中通過生物素/鏈霉親和素結(jié)合或通過生物素/抗生物素蛋白結(jié)合，其中生物素和鏈霉親和素形成結(jié)合伴侶。因此，鏈霉親和素或抗生物素蛋白涂布的珠粒，可以用來結(jié)合堿基或探針，其被連接于生物素基團(tuán)?？梢允褂玫钠渌Y(jié)合對包括異羥洋地黃毒甙元:抗異羥洋地黃毒甙元(digoxigenin:antidigoxigenin)。在特別優(yōu)選的方面，借助于可切割的連接物(優(yōu)選但不一定包括結(jié)合對)，將堿基或探針連接于所述珠粒。這使得所述珠粒能夠釋放。在進(jìn)一步優(yōu)選方面，所述可切割連接物具有可通過限制酶切割的限制位點。方便地，它的產(chǎn)生可以通過使用至少部分單鏈寡核苷酸，其是結(jié)合伴侶，在雜交以后其一起形成識別和限制位點。在結(jié)合于多核苷酸以前，可以將測試堿基或探針連接于珠粒。在這方面，可以將堿基或探針的單個拷貝或多個拷貝連接到每個珠粒。優(yōu)選地，所述珠粒，攜帶至少100、500、1000、10000或100000個探針。這些探針可以是相同或不同的，但優(yōu)選為單組探針。在不同探針被攜帶在相同珠粒上但它們并不形成單組探針(即指向單一改變)的情況下，每組的探針優(yōu)選可借助于它們的結(jié)合對區(qū)別，例如可以借助于可區(qū)別的切割位點連接它們。當(dāng)使用非終止堿基時，可以將一個以上的堿基結(jié)合于每個珠粒，但數(shù)目應(yīng)保持較低以避免均聚物并入。可替換地，在被連接于珠粒以前，可以首先將堿基或探針結(jié)合于多核苷酸序列。在這種情況下，珠粒可以方便地攜帶或提供有如上文描述的結(jié)合伴侶對中的一個。在本發(fā)明的方法中，有色的透明珠?？梢允褂貌⒖梢约右詸z測。一種或多種不同顏色的不同珠?？梢杂米鳂?biāo)記。因此，在本發(fā)明中，可以使用兩種、三種或四種不同的珠粒顏色。尤其是，可以同時使用一種或多種不同珠粒顏色并且可以加以檢測(如下文進(jìn)一步詳細(xì)描述的)。因此，不同的珠粒顏色可以用來檢測不同的測試探針或堿基是否已并入多核苷酸，例如四種堿基可以標(biāo)記有四種不同顏色的珠粒，以及連接于結(jié)合堿基的珠粒的顏色可以識別堿基，因而識別它在多核苷酸中的互補(bǔ)堿基。當(dāng)同時將所有四種堿基施用于多核苷酸時，這是特別有利的。因此，特定珠粒顏色可以具體識別特定堿基或探針?？梢酝ㄟ^它們對例如三種或四種顏色，對其存在過濾物質(zhì)，其盡可能地具有非重疊濾波曲線(filter curve)的過濾效應(yīng),來檢測不同顏色。通過以不同量結(jié)合這些物質(zhì)，例如，10種不同量，則理論上可以區(qū)分1000或10000種不同的珠粒。由于濾波曲線的某些重疊，可以需要減少數(shù)目，但可以區(qū)分256種不同珠粒，從而能夠通過利用針對256種改變的每一種的探針在任何時間讀取可達(dá)4個堿基。作為對濾波珠粒(filtering bead)的替換方案，可以通過進(jìn)行標(biāo)記來產(chǎn)生有色珠粒，例如，用染料例如熒光 染料來涂布上述珠粒。另外，可以使用不同顏色水平的珠粒。然而，優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，由珠粒攜帶的標(biāo)記是非熒光的。不同大小的珠?？梢杂米鳂?biāo)記?？梢酝瑫r使用2、3、4、5、6、7、8、9或10種不同大小的珠粒作為標(biāo)記并加以檢測。不同大小的珠粒，將能夠識別它們所連接的不同的堿基或探針，在本發(fā)明的方法中其將是特別有利的，其中同時將不同的堿基或探針加入多核苷酸。借助于它所結(jié)合的珠粒的大小可以確定并入的堿基。當(dāng)使用不同大小和/或顏色的珠粒作為用于堿基或探針的標(biāo)記時，可以必要的是，在結(jié)合于多核苷酸以前單獨地標(biāo)記堿基或探針，或使用不同的連接物或親和結(jié)合對以將特定堿基或探針特異性地結(jié)合于特定珠粒。在前一種情況下，在測序反應(yīng)以前進(jìn)行珠粒標(biāo)記，并將每組探針(例如ANNN)或堿基(例如A)連接于不同的珠粒?？梢詫⒚拷M的多個探針或堿基連接于每種珠粒以提供可達(dá)256種不同的珠粒(例如)。在結(jié)合于多核苷酸靶標(biāo)以后進(jìn)行標(biāo)記的情況下，因為珠粒類型的變化受限于可以容納的獨特的結(jié)合伴侶的數(shù)目，所以可以使用不同珠粒類型的數(shù)目并且其取決于可以使用的獨特的結(jié)合伴侶的數(shù)目。如果獨特的寡核苷酸用作結(jié)合伴侶，這可以是較大的。另外通過使用不同的珠粒大小、顏色和/或亮度(intensity)的組合,可以多路進(jìn)行(multiplex)上述方法。因此，珠粒的不同亞組，其可以是一系列的顏色、顏色水平和/或大小，可以用于本發(fā)明的方法。珠粒的上述亞組的檢測可以需要各種不同參數(shù)的測量，例如珠粒大小的磁性檢測和珠粒顏色的光檢測。因此，在用于每個堿基的每個測序循環(huán)中，可以一起或分開地加入不同組的待測試的探針或核苷酸，其取決于將使用的檢測技術(shù)。因此，可以一起加入所有測試探針或核苷酸，如果可以借助于其所連接的珠粒來區(qū)分它們，例如，借助于4種不同類型的珠粒來表示4種可能堿基中的每一種?？商鎿Q地，可以分開地或以組的形式加入探針，如果那些組可以加以區(qū)分，例如，2種的2組，其中在每一種情況下使用2種可區(qū)別的探針。在此類型的另外的替換方案中，可以一起或以組的形式加入探針，但可以分開地或以可區(qū)別的組釋放它們。這可以例如在連接/切割方法中實現(xiàn)，其中使用具有不同核酸酶識別位點的探針，使得響應(yīng)于特定限制酶的加入的珠粒釋放能夠識別結(jié)合的探針(基于所使用的限制酶和確定的珠粒)，因而使得能夠識別靶標(biāo)核苷酸。珠粒標(biāo)記的檢測可以是通過光、磁、電或電化學(xué)方式。例如，可以借助于磁場來檢測珠粒的大小以及其存在。方便地，在芯片上實施本發(fā)明的方法。在特別優(yōu)選的實施方式中，可以利用儀器來進(jìn)行珠粒的檢測，其中上述儀器包括表面，其提供有用于檢測珠粒的裝置。上述表面可以包括一個或多個元件，其提供依賴于珠粒的存在或不存在的輸出。在優(yōu)選的實施方式中，可以通過在PCT/GB2010/00324中描述的方法來光學(xué)地檢測珠粒，例如利用其中描述的儀器。在這樣的方法中，可以將多核苷酸連接于表面，其提供有用于檢測珠粒的裝置。因此，表面可以提供有一個或多個光敏元件，其中設(shè)置每個光敏元件以檢測與其相鄰的珠粒?？商鎿Q地，可以代替或連同其 它元件一起使用光敏元件，其中上述其它元件能夠檢測珠粒例如Hall元件。在表面上或表面內(nèi)提供的一個或多個光敏元件能夠輸出依賴于珠粒的存在或不存在的信號，以及由每個光敏元件提供的信號因此將表明是否存在珠粒，因而表明是否存在并入的堿基或探針。在這種檢測方法中，通過一個或多個光敏元件直接檢測珠粒本身?？梢栽O(shè)置珠粒以發(fā)射光，其可以通過光敏元件檢測，例如，它可以是發(fā)熒光的，雖然在優(yōu)選方面，當(dāng)它阻止光到達(dá)提及的光敏元件時檢測珠粒。因此，優(yōu)選地，所述檢測是通過檢測光變化，其來自在光敏表面上珠粒的存在。因此，珠粒在元件上有效地投射陰影。使用的光源可以是背景光(ambient light)，或可以提供專用光源。通過照明表面，可以更加容易地檢測任何這樣的陰影，其產(chǎn)生自珠粒的存在或光自光敏元件的阻礙。另外，為了防止外部光源影響結(jié)果，優(yōu)選地，通過適宜的外罩(housing),使光敏元件屏蔽外界光。因此，光敏元件能夠測量由表面接收的光量，其可以確定珠粒的存在或不存在?？梢酝ㄟ^單個光敏元件或通過光敏元件組來檢測珠粒，其取決于珠粒的大小、光敏元件和珠粒離表面的距離。因此，可能的是，單個光敏元件可以檢測一個珠粒，或2、3、4個珠粒，但更可能的是，4、9、16或更多光敏元件可以檢測一個珠粒。當(dāng)不存在珠粒時，通過每個光敏元件檢測的光量和因而由光敏元件輸出的信號，可以用作參比點，相對于其可以比較其它測量結(jié)果。由光敏元件接收的光的減少(即，由珠粒的陰影所產(chǎn)生的)將導(dǎo)致信號的輸出不同于當(dāng)珠粒不存在時的輸出。如下文所討論的，當(dāng)珠粒存在時，由每個光敏元件接收的光量將取決于各種因素，其包括珠粒大小、每個光敏元件的大小和連接于表面的多核苷酸的長度。"表面"優(yōu)選提供有設(shè)置以形成陣列的多個光敏元件。光敏元件可以是在表面上或形成表面的外層或可以包括在表面內(nèi)，例如，可以存在于一個或多個其它材料層的下方。光傳感器或光敏元件的陣列是本領(lǐng)域公知的，并且包括例如在照相機(jī)或CMOS有源像素傳感器中所使用類型的電荷耦合器件。可以對上述CCD或CMOS圖像芯片進(jìn)行改進(jìn)(改性，modification)(如下文中進(jìn)一步討論的)。表面可以是上述裝置的底面?？梢詫⑵湫蛄写_定的多核苷酸連接于一個或多個光敏兀件或放置在一個或多個光敏元件(其存在于表面內(nèi)或表面上)之上，以使得能夠從連接的珠粒產(chǎn)生輸出。優(yōu)選地，單一多核苷酸可以與光敏元件或元件組有關(guān)并且可以檢測?？梢栽谝粋€以上的光敏元件或元件組上進(jìn)一步劃分多核苷酸序列，以使得能夠更容易地確定序列，即對于待確定的序列的部分，其中通過不同的光敏元件，但在每一種情況下測序單一多核苷酸。當(dāng)珠粒存在時，珠?？梢栽诒砻嫔虾驮诠饷粼蚬饷粼M上投下陰影，因而減少由光敏元件接收的光量。例如，珠粒可以減少由光敏元件接收的光量約10-100%，例如尤其是至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或95%?？梢岳斫?，提供的輸出將取決于所使用的珠粒的大小、在表面上存在的單個光敏元件的大小和拴住的珠粒與表面的距離。因此，相同大小或大于光敏元件的珠?？梢苑乐勾蠖鄶?shù)光落到光敏元件上。當(dāng)珠粒存在或連接于光敏元件時，可以通過測量輸出的信號來校準(zhǔn)每種光敏元件和珠粒大小組合?？赡艿氖?，特定珠粒大小的選擇取決于在表面內(nèi)或表面上的光敏元件的大小。尤其是，對于多核苷酸的測序，其中相對彼此順次地加入4種堿基或不同的探針，可以選擇珠粒，其對應(yīng)于在表面內(nèi)或在表面上一個或多個光敏元件的大小?？商鎿Q地，對于多核苷酸的測序，其中同時將所有4種堿基或不同的探針加入多核苷酸以及其中基于珠粒大小來區(qū)分堿基或探針，珠粒大小將優(yōu)選小于元件或元件組的大小。因此，可以選擇珠粒，當(dāng)連接于表面時其將減少光量至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或95%。例如，I μ m直徑珠?？梢赃B同1.75x1.75 μ m的光敏元件一起使用，或2.8 μ m直徑珠?？梢赃B同3.2x3.2 μ m的光敏元件一起使用。通過每個光敏元件并通過用不同顏色的光照明表面，在表面上可以檢測不同顏色珠粒。因此，通過表面并通過用不同顏色光的照明，可以檢測2種、3種、4種或更多種不同顏色珠粒。表面可以能夠?qū)λ┯玫拿糠N顏 色珠粒/光顏色組合提供輸出。光敏元件能夠?qū)⒔邮盏墓饽苻D(zhuǎn)換成電壓，其然后可以被轉(zhuǎn)換成數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)。以這種方式，包括元件的表面本身能夠檢測分子的存在，其中通過檢測連接于上述分子的珠粒。無需采用外部貴重儀器來檢測連接于分子的信號或標(biāo)記的存在。表面本身能夠檢測分子。如上所述，已知的CMOS或CXD檢測器適用于檢測珠粒。例如，在本發(fā)明的方法中，在移動電話中所使用類型的圖像芯片可以用于檢測珠粒。因此，例如CMOS或CCD圖像傳感器的表面可以形成在本發(fā)明的檢測步驟中使用的表面。已開發(fā)了 CMOS光檢測器(或有源像素傳感器)，基本上用于消費相機(jī)應(yīng)用，例如在網(wǎng)絡(luò)攝像機(jī)或移動電話中。可獲得這種檢測器的兩種變體，即裸模變體(bare dievariant)或具有用保護(hù)玻璃包裝并連接于墊片(其被連接于用于焊接的外部墊片)的模具的變體。裸模變體可以直接用于本發(fā)明，而包裝模具變體(packaged die variant)CM0S光檢測器可以通過除去玻璃蓋改進(jìn)。對于兩種變體，可以優(yōu)選的是，除去微透鏡和顏色濾波器的層，其通常覆蓋像素，這是因為在透鏡和濾波器下的表面通常是玻璃層，其是優(yōu)選的，尤其用來避免珠粒的非特異性連接?？梢灾圃霤MOS或其它光檢測器而沒有另外的微透鏡/濾光層，其是用于移動電話所需要的，直接用于本發(fā)明。因此，特別適用的CMOS圖像芯片可以用于本發(fā)明。特別地，表面可以包含至少3兆像素(2048x1536個光敏元件)或至少4、5、6、7、8、
9、10、11或12兆像素。利用標(biāo)準(zhǔn)沉積過程，可以沉積與至少1、5、10、15、20、25、30、35或37%的光敏元件有關(guān)的多核苷酸。在圖像芯片上存在的光敏元件或像素通常具有相同大小，雖然可以產(chǎn)生大小的差異。像素可以是例如0.5x0.5 μ m至10x10 μ m,例如Ixl μ m、2x2 μ m、3x3 μ m、4x4 μ m、5x5 μ m 或 6x6 μ m,以及特別地，像素可以是 1.75x1.75 μ m 或 3.2x3.2 μ m?？梢詫Ρ砻胬鐚D像芯片的表面另外進(jìn)行改性，以有助于分子連接于表面。特別地，圖像芯片可以涂布有金或可以改性以具有連接的硅烷或抗異羥洋地黃毒甙元基團(tuán)?？梢允褂玫慕饘拥暮穸炔⒉皇顷P(guān)鍵的，條件是沒有太多的光被阻止到達(dá)光敏元件。例如，金層可以為5至50nm。以這樣的方式來使表面改性的方法在本領(lǐng)域中是已知的?？梢酝ㄟ^真空沉積或通過由高度濃縮的金溶液沉積來進(jìn)行金涂布。可以通過例如在室溫下用在干丙酮中的5%氨基丙基三乙氧基硅烷(CAS:019-30-2)溫育表面I小時，來實現(xiàn)表面的氨基硅烷改性。氨基硅烷表面可以作為本身直接加入所期望的分子，或可以通過加入雙官能團(tuán)交聯(lián)劑來進(jìn)一步改性，如間-馬來酰亞胺二苯甲酰-N-羥基磺基-琥珀酰亞胺酯(m-maleididibenzoyl-N-hydroxysulfo-succinimide ester),以能夠?qū)⒎肿咏Y(jié)合于表面。通過首先用聚-1賴氨酸溶液(10%聚-1賴氨酸v/v和10%PBS)將表面涂覆底層(prime)，然后通過加入在Invitrogen CNBOO11涂層緩沖液A中的抗異輕洋地黃毒式元1:100來實現(xiàn)抗異輕洋地黃毒甙元改性。另外,表面可以配有流動池(flow cell),其使得流體能夠流動到和從表面流動。因此，流動池可以用來施加珠?；蛑榱?biāo)記堿基/探針或未標(biāo)記堿基/探針。另外，表面可以設(shè)置讀取器，其能夠檢測和讀取來自在表面內(nèi)或在表面上的每個傳感元件的信號。可以由計算機(jī)接收來自每個元件的輸出。可以容易地制作流動池以包含一個以上的芯片，例如，它可以用64個圖像芯片來產(chǎn)生。在這種情況下，可以用同一控制單元來控制所有芯片。另外或可替換地，可以改變或適應(yīng)表面的形狀，以有助于珠粒結(jié)合于并入的堿基或探針或有助于在每個位置 或像素處珠粒標(biāo)記堿基/探針的結(jié)合，以及使得能夠產(chǎn)生靈敏而準(zhǔn)確的方法。因此，可以改變或調(diào)整表面，例如具有一定形狀，以使得在每個位置處珠粒能夠結(jié)合。因此，表面可以成一定形狀以使得珠粒能夠連接或結(jié)合于每個傳感元件(例如光敏元件)。單獨的凹槽可以與每個傳感元件或傳感元件組有關(guān)或由每個傳感元件或傳感元件組所定位，其使得每個珠粒能夠連接于以及與在表面上的單個或單獨傳感元件或傳感元件組有關(guān)。凹槽可以使珠粒能夠僅定位于單個元件上以及防止珠粒在一個以上傳感元件或傳感元件組上移動?？商鎿Q地，可以用障礙物包圍每個傳感元件或傳感元件組，以確保珠粒僅連接于以及結(jié)合于上述傳感元件或傳感元件組。因此，可以在表面上圍繞一個或多個傳感元件放
置障礙物。凹槽和障礙物的組合還可以用于表面上。通常，將具有與其連接的多核苷酸的傳感元件將適合于具有與其相關(guān)聯(lián)的凹槽(recess)或障礙物?？梢允乖诒砻嫔系囊粋€或多個元件適應(yīng)，雖然通?？梢允顾性m應(yīng)，例如，以具有與其相關(guān)聯(lián)的凹槽和/或障礙物。以這種方式，表面的適應(yīng)，例如，凹槽(recess)和/或障礙物的使用，使得能夠產(chǎn)生更加靈敏而準(zhǔn)確的方法以及可以使得能夠測序更長的多核苷酸。因此，表面可以適應(yīng)以使得在每個位置處單一珠粒能夠結(jié)合。因此，每個傳感元件或傳感元件組和其周圍的障礙物或凹槽可以具有適宜的大小以結(jié)合單一珠粒。因此，可以使傳感元件和/或障礙物/凹槽適應(yīng)于和表面一起使用的任何特定珠粒大小?？梢岳帽绢I(lǐng)域公知的技術(shù)來調(diào)整表面。另外，為了使得靶標(biāo)多核苷酸能夠連接于檢測器的敏感區(qū)(例如對于光或磁性)，改性可以是必要的。這可以例如通過平版印刷法來實現(xiàn)，例如限定金層的島(island)，其可以在靶標(biāo)固定于表面的一端連接于硫醇改性，或通過限定被硅烷化的區(qū)域。可以在表面上的不同位置處同時測序不同的多核苷酸。要做到這一點，將有必要在開始測序以前確定它們在表面上的位置?？商鎿Q地，可以產(chǎn)生多核苷酸的重疊片段并隨機(jī)放置在表面上的單獨位置供測序。在這種情況下，在測序以前，不必要確定每個片段在表面上的位置，這是因為在已完成測序以后可以將重疊序列拼合在一起。通過示例的方式，上述方法可以實施如下。首先，應(yīng)分離和制備供測序的靶標(biāo)多核苷酸。然后應(yīng)直接或間接地將靶標(biāo)多核苷酸連接于固體載體(如上文描述的)。在含水反應(yīng)混合物中，在使得它們能夠結(jié)合于靶標(biāo)多核苷酸的條件下，加入在上述方法中使用的測試互補(bǔ)堿基和/或探針(其可以攜帶珠粒)。可以同時或在加入可選的珠粒標(biāo)記測試互補(bǔ)堿基和/或探針以前或以后加入為實現(xiàn)共價結(jié)合所必要的酶(例如連接酶或聚合酶)?？商鎿Q地，進(jìn)行化學(xué)連接。在已經(jīng)實現(xiàn)共價結(jié)合以后，應(yīng)洗滌復(fù)合物以除去未結(jié)合的堿基和/或探針。在此步驟以后，可以進(jìn)行珠粒檢測(如上文描述的)或可以加入信號單元以標(biāo)記復(fù)合物。在后者情況下，可以在適合于在結(jié)合伴侶之間發(fā)生結(jié)合的條件下加入攜帶有關(guān)結(jié)合伴侶的珠粒，然后在洗滌以除 去未結(jié)合的珠粒以后可以確定珠粒的存在或不存在。如果僅在它們的釋放以后檢測珠粒，則可以在沒有檢測的情況下進(jìn)行洗滌和珠粒結(jié)合步驟。進(jìn)行珠粒的釋放(如上文描述的)，例如通過化學(xué)或酶促或機(jī)械切割。在連接/切割測序的情況下，可以通過限制酶的加入來進(jìn)行切割反應(yīng)?？梢詮姆磻?yīng)混合物除去釋放的攜帶珠粒的探針和/或堿基，然后確定珠粒的特性。在其中僅使用一種類型的珠粒和釋放系統(tǒng)的情形中，在上述步驟中僅檢查單一測試探針組。在該情況下應(yīng)當(dāng)通過連續(xù)使用每一個組的探針(當(dāng)每個循環(huán)中測定單一堿基時該組探針包括4個組，或者當(dāng)在每個循環(huán)中測定2種堿基時包括16個組等)來重復(fù)該步驟。一旦已經(jīng)使用所有組的探針，或者已經(jīng)測定該堿基(一種或多種)的特性，就認(rèn)為完成了測序的循環(huán)。當(dāng)在以上步驟中一次使用多于一組的探針時，可以通過進(jìn)行那些步驟僅足夠的次數(shù)來完成循環(huán)，使得使用所有組，例如，當(dāng)16組探針連同4種區(qū)分標(biāo)記一起使用時，每組步驟可以進(jìn)行4次，其中每當(dāng)完成測序步驟時評估4組探針的結(jié)合。在完成循環(huán)并在該循環(huán)中已確定待測序的一個或多個堿基以后，可以重復(fù)循環(huán)。因此，優(yōu)選地，如上文描述的方法包括以下步驟:加入有關(guān)酶，洗滌復(fù)合物以除去未結(jié)合酶、探針、堿基或珠?！，F(xiàn)將通過非限制性實施例并參照附圖來描述本發(fā)明，其中:凰I示出了通過使用本發(fā)明的方法合成測序。將用于測定序列的多核苷酸(2)固定至固體載體(I)并且將鏈終止堿基(A、T、G和C)連續(xù)加入反應(yīng)中使用DNA聚合酶用于鏈延伸。因此，分別加入鏈終止堿基A、T、G和C。在A (3)的情況中，將互補(bǔ)堿基插入多核苷酸中并且將珠粒連接至接頭(4)，其將結(jié)合并特異于加入的插入堿基(通過結(jié)合伴侶)。因此將珠粒標(biāo)記連接至插入的堿基并且通過珠粒的存在可以檢測該堿基。
Ml示出了通過使用本發(fā)明的方法利用連接酶測序。將用于測定序列的多核苷酸固定至固體載體并且將珠粒標(biāo)記的探針加入到多核苷酸中，通過連接酶該珠粒標(biāo)記的探針可插入或可能不插入多核苷酸中。在這種情況下，探針中的7個堿基是完全不同的(簡并的)并因此必須產(chǎn)生代表所有不同組合的探針組。一旦加入互補(bǔ)的探針，通過連接酶將其插入序列中并且能夠通過連接至該探針的珠粒的特性來檢測。Si示出了通過逐步連接和切割的測序，其中利用本發(fā)明的方法。因此，將其序列待確定的多核苷酸(DNA)固定于固體載體，其中多核苷酸具有突出部分(AGC)。產(chǎn)生探針，其也具有突出部分(在相對于多核苷酸的突出部分的相反鏈上)，其中最外面的堿基是已知的并且其它2個喊基是簡并的。探針標(biāo)記有4種不同的珠粒,各自表不一種喊基，并被并入多核苷酸。利用連接酶，將具有相對于多核苷酸的互補(bǔ)突出部分的探針并入多核苷酸。因此借助于珠粒特性，可以檢測探針的加入以及已知的堿基。在已確定珠粒標(biāo)記以后，利用核酸酶，可以在箭頭所示位置切割多核苷酸/探針復(fù)合物。這切割了復(fù)合物，致使在原始多核苷酸中末端C殘基的除去，然后可以使少一個堿基的多核苷酸經(jīng)受另一輪的探針的連接和切割。Si示出3D印刷單元，其置于包裝的圖像芯片上以產(chǎn)生流動池。_示出流動池的橫截面，其中流動池置于粘合(glued)和結(jié)合于印刷電路板的"裸模(bare die)"圖像芯片上。_示出另一個流動池的3D圖片，其中該流動池具有較好的流體流動特性，并置于粘合和結(jié)合于印刷電路板的"裸模"圖像芯片上。圖7示出圖像芯片的完整系統(tǒng)的示意圖。圖8示出在實施例1中描沭的測序稈序。_示出在實施例1中描述的測序程序，其中使用了多種切割酶。圖10示出了如在實施例3中描述的所制備的壓花玻璃(圖案化玻璃，patternedglass)表面。圖11示出了玻璃表面的差示干涉差顯微圖像(differential interferencecontrast microscopy image),該玻璃表面攜帶如在實施例3中描述的所制備的磁珠。實施例1:通過順次連接和切割進(jìn)行的測序儀器的制備將Micron MT9T001 (Aptina) 3兆像素CMOS數(shù)字圖像傳感器焊接到印刷電路板(PCB)上并通過連接于來自Analog Devices的Blackfin微控制器來測試功能,該微控制器是一種使用PPI (并行外圍接口)的微控制器。在焊接于PCB以后，通過金剛石切割器，從CMOS數(shù)字圖像傳感器，小心除去保護(hù)玻璃，并通過用純乙醇進(jìn)行洗滌來清洗芯片表面。通過使內(nèi)室暴露于丙酮15分鐘除去微透鏡和Bayer濾波器，其后通過用塑料牙簽小心刮劃除去上層。流動池的裝配通過3D印制(printing)，由塑料制備流動池(圖4)，使得它適合與MT9T001CM0S數(shù)字圖像傳感器的大小并使得流體能夠流動到活性表面和從活性表面流動，其中通過可以經(jīng)由柔性塑料管連接的入口和出口(10)。使環(huán) 氧膠的薄層分布于邊緣，例如，通過相對于流體膠的薄層沖壓。然后將它放置在芯片上，并使得環(huán)氧膠硬化。對于一些芯片，在此階段除去微透鏡和Bayer濾波器。在定位蓋玻片以前，使連同NTC電阻器一起的電阻器網(wǎng)絡(luò)(用作溫度傳感器)適應(yīng)區(qū)室(compartment)。與控制電路的電連接是通過連接器,其突出通過在流動池中的切口(14)。將蓋玻片放置在頂部，從而覆蓋內(nèi)室和外室，并且外室通過入孔(12)填充有環(huán)氧膠，通過出孔(13)使空氣排出。從而密封內(nèi)室，并保護(hù)芯片的外區(qū)和所有開放的接合線?；诰?裸模)的芯片裝置(裸模)在裝配Bayer濾波器以及任何其它濾波器和透鏡以前，從正常生產(chǎn)線除去晶片?？商鎿Q地，這些可以在進(jìn)一步制備以前用NaOH除去。用來增強(qiáng)聚合物固定(錨定，anchorage)的任何制備現(xiàn)可以方便地進(jìn)行,例如敷金屬,其中利用保護(hù)連接區(qū)域的掩模。以正常方式測試晶片并切成芯片(裸模)。圖5和圖6示出芯片裝置。借助于金線并通過粘接
(15)將芯片(25)連接于板。將反應(yīng)室單元放置在芯片的頂部。然后首先將它粘合到芯片，接著通過入口(12)將包含粘接連接的封閉容積填充環(huán)氧膠，同時在出口(13)處放出空氣。通過塑料管(11)，將反應(yīng)容積連接于流體供給和排出單元。這可以用于在一個單元中的小批量生產(chǎn)(通過透明塑料3D印制)，同時其對于較大系列，它可以產(chǎn)生自，例如在兩側(cè)具有空腔的塑料片和扁平的透明片。通過研磨或通過模塑，前者可以產(chǎn)生自扁平片。成像裝置與控制和圖像采集單元的連接如圖7所示，連接成像裝置(17)?？梢栽贐lackfin控制單元(18)中捕獲圖像，其中利用硬件加速(從圖像芯片直接存取(memory access)到RAM)?？梢酝ㄟ^晶體或通過Blackfin來產(chǎn)生相對于圖像芯片的時鐘信號。通過利用uClinux分布,測試程序ppifcd_test,其連同程序包一起分配,可以捕捉到RAM磁盤文件。這描述于uClinux wiki,參見以下鏈接:http: //docs, blackf in.uclinux.0rg/doku.php id=frame capture device。在此鏈接中的文本的拷貝作 為附錄1，但需改性以除去非功能性連接。然后可以經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(如果使得具有以太網(wǎng)控制器的開發(fā)板)將此文件轉(zhuǎn)移到計算機(jī)
(19)，其中通過利用NFS、tftp、ftp等，或利用USB。成像裝置與流體供應(yīng)單元的連接如圖7所示，進(jìn)一步將成像裝置(17)連接于流體供應(yīng)單元。流體供應(yīng)由多個單獨的流體容器(20)組成，各自配有其自身的電機(jī)控制注射器以驅(qū)使流體通過管道(21)流到分流管(22)并進(jìn)一步到成像裝置(17)。將使用過的流體排入容器。圖像芯片的硅烷化:通過在NaOH(IM)中浸泡芯片I小時，用水沖洗并在氮氣流下干燥，來官能化表面。為了產(chǎn)生帶負(fù)電荷的表面，利用HCl(IM)代替NaOH來重復(fù)此程序。為了硅烷化，在室溫下，用在干丙酮中的5%溶液(容積/容積)(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(CAS:919-30-2)來覆蓋圖像芯片I小時。然后用丙酮洗滌圖像芯片三次，其中利用5分鐘溫育時間。然后在乙醇中沖洗芯片，并其后在N2氣體下干燥。通過異雙功能連接物間-馬來酰亞胺基苯甲酰-N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯(s-MBS) (20mM)在 PBS (0.1M NaH2PO4、0.15M NaCl, (ρΗ7.2))中的溶液中溫育圖像芯片5小時進(jìn)行交聯(lián)。然后在PBS中洗滌圖像芯片，浸泡在去離子水中，然后浸泡在乙醇中，最后在氮氣流中干燥。固定DNA到圖像芯片的制備和連接將待測序的DNA連接于在芯片表面上的固定DNA。通過共價鍵，將固定DNA連接于芯片?？梢酝ㄟ^退火兩個寡核苷酸來制備固定DNA，其中上述兩個寡核苷酸形成雙鏈DNA分子，其包含在一端的硫醇以及其中另一端是粘性的。(它還可以通過適宜質(zhì)粒的部分的PCR擴(kuò)增形成，其中引物之一被5'-硫醇化。然后利用限制酶將獲得粘性末端。)為了激活5'硫醇，需要將二硫鍵(S-S)還原成自由硫醇(H-S)。這是通過在Tris-HCl (0.1Μ，ρΗ7.5)中的還原劑 Tris (2_ 羧乙基)勝鹽酸鹽(Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)(TCEP) (IOmM)中溫育制備的固定DNA兩小時來實現(xiàn)。然后按照指導(dǎo)手冊通過Biospin30柱(Bio-Rad)并通過用 NaPi 緩沖液(NaH2PO4 (0.1M, pH6.5),NaCl (0.15Μ))洗脫 DNA 來純化固定DNA。然后在NaPi緩沖液中稀釋固定DNA至0.01 μ M的最終濃度。將還原和純化的固定DNA立即施用于圖像芯片并在潮濕環(huán)境下溫育5小時。然后用NaPi沖洗圖像芯片，在NaPi中的巰基乙醇(IOmM)中阻滯I小時，接著再次用NaPi沖洗。然后用NaCl (1.5Μ)在NaH2PO4 (IOmM, ρΗ7.0)中的溶液沖洗它，并用這種溶液溫育5分鐘，以消除多核苷酸與芯片表面的非特異性結(jié)合。其后，用5x SSC (0.075Μ檸檬酸鈉，0.75MNaCl (ρΗ7.0))、用0.1%的吐溫20、用恰好5x SSC沖洗它，并存儲于4°C下的5x SSC中直到進(jìn)一步使用。通過順次連接和切割進(jìn)行測序珠粒:鏈霉親和素涂布的2.8 μ m 0順磁珠探針:探針的4種不同的混合物由34個堿基對組成，其中在一端具有5'端突出3個喊基突出端以及在另一端具有多種生物素。在每種探針混合物(A、C、G、和T)中，一個喊基保持不變，在突出端中的其它堿基則是完全變化的。選擇用來固定的堿基是最靠近連接點的堿基。探針的5'端并不包含磷酸鹽以避免在兩個探針之間的連接。用于測序的靶標(biāo)和珠粒的制備為了確保在測序反應(yīng)中所使用的限制酶的識別序列(Earl，在圖8中)并不存在于待測序的DNA中，進(jìn)行借助于上述酶的切割步驟。然后在霧化器或HydroShear裝置(設(shè)置為3000個堿基對的平均長度)中將DNA剪切成片段。可以通過在瓊脂糖凝膠上分離DNA，接著通過純化期望長度的片段，來減小尺寸分布。在剪切過程中獲得的在DNA中的單鏈缺口需要使用T4DNA連接酶。DNA聚合酶用來填充或除去突出端(例如，DNA聚合酶I，較大(克林諾)片段)。在圖8中靶標(biāo)以標(biāo)記為31的片段示出。適配體(adapter) 32是固定適配體。在第一測序步驟中，適配體33需要用于隨后連接于測序探針。如果這些適配體具有大約相同長度，則以相同量來提供它們。適配體32包含互補(bǔ)于在載體上的固定DNA的粘性末端的區(qū)，因而可以被連接于它們。適配體33包含限制位點(陰影線區(qū)域)，其用來除去連接于生物素(空心圓)的珠粒，以及是足夠長以使得能夠酶接近珠粒進(jìn)行操作。如在來自Dynal的產(chǎn)品指南中描述的并利用程序"核酸的固定"來制備珠粒。進(jìn)一步的程序如下，參照圖8。將適配體連接于靶標(biāo):通過2步連接，將兩個適配體(32和33)連接于靶標(biāo)DNA。首先，過量供應(yīng)一種適配體，連同400粘性單元(U)的T4DNA連接酶。在25°C下進(jìn)行連接2小時。然后利用PCR純化來純化連接產(chǎn)物，其將除去非連接的適配體片段(由于它們的較小尺寸)。在純化以后，過量供應(yīng)其它適配體，連同400粘性單元(U)的T4DNA連接酶。除想要產(chǎn)物32-31-33以外，將出現(xiàn)產(chǎn)物32-31-32、33-31-33和一些自連接的靶標(biāo)DNA。在上述方法中，32-31-32和3 3-31-33產(chǎn)物并不是有害的，這是因為它們將分別僅關(guān)聯(lián)于圖像芯片或關(guān)聯(lián)于珠粒。自連接的靶標(biāo)DNA將并不關(guān)聯(lián)于芯片或珠粒。然而，如果連接在一起的兩個適配體(32-33)足夠小以致通過PCR純化被除去，則僅需要I次連接，以及通過加入過量的按比例(其使得它們以相同概率連接于31，如下文描述的)的兩種適配體來進(jìn)行。過量供應(yīng)兩種適配體，連同400粘性單元(U)的T4DNA連接酶，并按一定比例，其使得它們以相同概率連接于31。在25°C下進(jìn)行連接2小時。除想要產(chǎn)物32-31-33以外，還出現(xiàn)許多32-33連接產(chǎn)物(連接在一起的兩個適配體)、產(chǎn)物32-31-32和33_31_33，以及自連接的靶標(biāo)DNA。通過在瓊脂糖凝膠上的分離，接著DNA純化，來除去產(chǎn)物32-33和自連接的靶標(biāo)DNA。在上述方法中，32-31-32和33-31-33產(chǎn)物并不是有害的(如上文所討論的)。將產(chǎn)物加入圖像芯片:將小部分的得到的產(chǎn)物混合物加入裝配的流動池，以及400U的T4DNA連接酶。將產(chǎn)物連接于在圖像芯片上的固定DNA:將32-31-33產(chǎn)物連接于固定DNA的粘性末端(在圖8中的34)，其是在像素窗口中過量制備。在25°C下進(jìn)行連接10分鐘。此后，用適用于珠粒結(jié)合的緩沖液洗去未反應(yīng)分子和酶。加入和檢測鏈霉親和素涂布的珠粒:加入大約2xl06個珠粒并溫育30分鐘。每分鐘輕輕搖動裝配的流動池5秒。通過小心洗滌來除去所有未結(jié)合的珠粒。登記珠粒的圖像，同時施加向上磁場以穩(wěn)定珠粒。檢查珠粒密度:檢查圖像以看到5至10%的像素具有被加以定位以主要在一個像素上產(chǎn)生陰影的珠粒。如果存在太少的珠粒，則重復(fù)來自"將產(chǎn)物加入圖像芯片"的程序。利用Earl進(jìn)行切割，除去帶有切割的片段的珠粒:用限制酶緩沖液進(jìn)行洗滌，然后在它的反應(yīng)緩沖液中加入IU的核酸酶Fast Digest (FD)Earl (Fermentas)并在37°C下進(jìn)行切割5分鐘。用適合于T4DNA連接酶的緩沖液洗去連接于釋放片段的核酸酶和珠粒。登記剩余珠粒的圖像，同時施加向上磁場`。還進(jìn)行這種方法，其中使用對于適配體具有特異性的不同的限制酶。在這種情況下，用限制酶緩沖液進(jìn)行洗滌，然后在它的反應(yīng)緩沖液中加入適量的限制酶并進(jìn)行切割，直到已切割大多數(shù)探針。如上述，洗滌連接于釋放片段的核酸酶和珠粒。如上述，登記剩余珠粒的圖像。通過順序連接和切割進(jìn)行測序加入4探針混合物之一:連同400U的T4DNA連接酶和它的反應(yīng)緩沖液一起加入A型探針(35)。連接匹配探針:在25°C下溫育10分鐘期間，使得能夠匹配探針退火并連接于切割的片段。用適用于珠粒結(jié)合的反應(yīng)緩沖液洗去連接酶以及未結(jié)合的探針。加入和檢測鏈霉親和素涂布的珠粒:如上文所述，加入珠粒并登記圖像。釋放測序珠粒，登記供證實:按照早先描述為"利用Earl進(jìn)行切割，除去帶有切割的片段的珠粒"的程序。重復(fù)上述步驟，每次加入不同的(C、G或T，然后再次A)探針類型。重復(fù)進(jìn)行，直到在每個循環(huán)中登記的珠粒的數(shù)目大大減少或在大多數(shù)像素中讀取固定序列，其表明已完成大多數(shù)靶標(biāo)讀數(shù)。按照本發(fā)明的測序方法可以在逐步連接和切割方法中使用多種切割酶進(jìn)行。該方法如下進(jìn)行。所使用的方案示于圖9。如上文所述，使用探針的4種不同的混合物，其中每種探針混合物具有用于不同限制酶的限制位點。適配體(33)具有這些限制位點的一種。方法進(jìn)行如下:通過順序連接和切割進(jìn)行的測序加入4種探針混合物的一種:連同400U的T4DNA連接酶和它的反應(yīng)緩沖液一起加入探針。連接匹配探針:在25°C下溫育10分鐘期間使得能夠匹配探針退火和連接于切割的片段。用適用于珠粒結(jié)合的反應(yīng)緩沖液洗去連接酶以及未結(jié)合的探針。加入和檢測鏈霉親和素涂布的珠粒:如上文所述,加入珠粒并登記圖像。釋放測序珠粒:加入識別4種探針混合物之一的限制酶。在完成酶反應(yīng)以后，洗去酶和釋放的探針，并登記剩余珠粒的圖像，同時施加向上磁場。然后，重復(fù)此步驟，其中通過逐個地分別加入識別探針混合物2、3和4的限制酶。通過加入探針混合物重復(fù)上述步驟，直到在每個循環(huán)中登記的珠粒的數(shù)目大大減少或在大多數(shù)像素中讀取固定序列，其表明已完成大多數(shù)的靶標(biāo)讀數(shù)。實施例2:用于圖像芯片的表面改性的程序，其中通過硅烷化并利用APTE以及交聯(lián)與戊二醛此程序是娃燒化芯片表面的另一種方式。該程序是Howartere t a I (2 O O6，Langmuir，22，P I I I 42-1 11 47)、Aksyοno V e t a I (Anal.Biochem.，2006，348，pl27_138)、和 Wang e t a I (J.Agric.FoodChem.，2007，55，pl05·09-10516)的那些程序的改進(jìn)。具有Y _胺基的DNA可以結(jié)合于交聯(lián)劑的醛基團(tuán)，以及胺基可以構(gòu)成固定DNA的一部分，其是以相同方式，如同在實施例1中5'-硫醇基團(tuán)連接于固定DNA。1.在IM NaOH溶液中浸泡芯片I小時。2.用去離子水充分沖洗芯片并在氮氣流下干燥。3.用IM HCl溶液處理芯片I小時以產(chǎn)生帶負(fù)電荷的表面。4.用去離子水充分沖洗芯片并在氮氣流下干燥。5.將芯片移動到手套箱，其中濕度和氧氣水平為0.lppm。用5% (3_氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)在無水甲苯中的溶液處理芯片I小時。6.用無水甲苯?jīng)_洗。7.將芯片移動到標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，然后用甲醇并其后用去離子水沖洗。在去離子水中溫育24小時以完全水解在芯片上的APTES分子。8.在氮氣下干燥芯片。9.在 120°C下烘I小時。10.對于交聯(lián):在IOX磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液中的5%戊二醛溶液中浸泡芯片過夜。11.用去離子水洗滌并在氮氣流下干燥。12.在被干燥以后，可以將醛改性載玻片存儲在4°C的暗處。附錄IPPI架捕獲裝置
PPI架捕獲裝置(PPIFCT)是CMOS相機(jī)，經(jīng)由并行外闈梓口，其連梓于Blackfin。它旨在僅捕捉單幀。目前支持兩個相機(jī)傳感器。此處參見:v41 blackfin相機(jī),對于支持若干傳感器的v41視頻驅(qū)動程序。Micron MT9T001可以利用Micron MT9T001來制備PPIFCD。它利用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)部IC總線和可編程標(biāo)志來控制相機(jī)(例如，來除去備用方式等)。使用PPIFCD的程序ppifcd_ testPPIFCD架捕獲驅(qū)動程序測試應(yīng)用(Frame Capture Driver test application)目的在于看看是否數(shù)字圖像傳感器可以有效地拍攝照片，其通過PPI端口連接于靶標(biāo)板。它記錄行時間、總幀時間、總幀捕獲時間、和拍攝的相片。如果打印的數(shù)據(jù)是如預(yù)期的，則情況合格，否則失敗。fed此程序服務(wù)基于CGI的網(wǎng)頁，其使得能夠用戶指定設(shè)置、捕獲幀、和證實相機(jī)的整體操作。配置uClinux 內(nèi)核Blackfin PPI支持若干子插件板，PPIF⑶是一種。然而，如果啟用兩者，則PPI驅(qū)動程序?qū)⑴cPPI相機(jī)幀捕獲驅(qū)動程序 發(fā)生沖突。當(dāng)PPI驅(qū)動程序試圖登記用于字符裝置(char device)的相同主設(shè)備號(major number)時,你將在內(nèi)核日志中看到這種情況(即，顯示開機(jī)信息(dmesg))。以下是用于BF533和BF537STAMP板的一些配置設(shè)置。為獲得任何一種上述程序，指定以下內(nèi)容:在定制供應(yīng)商/用戶設(shè)置下==選擇Blackfin測試程序==啟用PPIFCD測試程序==選擇Blackfin app 程序==啟用用于PPI幀捕獲驅(qū)動程序的基于CGI的測試應(yīng)用程序BF533-STAMP 板如此處描述的，已知，在以下設(shè)置下BF533-STAMP板與PPITOD —起工作:在定制內(nèi)核設(shè)置下==選擇裝置驅(qū)動程序====選擇字符裝置==啟用[*]Blackfin BF53x可編程標(biāo)志驅(qū)動程序啟用[*]Blackfin BF5xx PPI相機(jī)幀捕獲驅(qū)動程序[] Blackfin BF5xx PPI 驅(qū)動程序==選擇I2C 支持==啟用I2C支持啟用I2C設(shè)備接口選擇I2C硬件總線支持
啟用Generic Blackfin 和 HHBF533/561 開發(fā)板 I2C 支持選擇BFIN I2C SDA/SCL 選擇設(shè)置(2)SDA 是 PF
設(shè)置(I)SCL 是 PF
BF537-STAMP 板BF537具有內(nèi)置的兩線接口外圍并目.不同于BF333,并不需要通用的I2C支持。在定制內(nèi)核設(shè)置下==選擇裝置驅(qū)動程序====選擇字符裝置==啟用[*]Blackfin BF53x可編程標(biāo)志驅(qū)動程序啟用[*]Blackfin BF5xx PPI相機(jī)幀捕獲驅(qū)動程序。[] Blackfin BF5xx PPI 驅(qū)動程序==選擇I2C 支持==啟用I2C支持啟用I2C設(shè)備接口 選擇I2C硬件總線支持啟用Blackfin TWI I2C 支持實施例3:通過化學(xué)氣相沉積與平版印刷術(shù)圖案化的硅烷化在類似于芯片表面的玻璃表面上進(jìn)行。使用載玻片用于該方法。首次使用丙酮清洗該玻璃表面，然后快速通過異丙醇清洗，然后丙酮干燥，使用氮氣干燥異丙醇。然后利用氧等離子體處理(在來自Diener的Femto中，以100%氧氣流和100%功率進(jìn)行I分鐘)徹底清洗基板。圖案化將徹底清洗的基板放置在旋涂儀(spin coater)上，并且將足夠的正性抗蝕劑SPR-700(約0.25ml)放置在表面上并以參數(shù)2000RPM在250RPM/s下旋轉(zhuǎn)90秒。手動的除去邊緣珠粒并且該基板在95°C下軟烤(soft bake)60秒。然后通過掩模將基板暴露于紫外光,在215w/cm2下產(chǎn)生圖案。在115°C下進(jìn)行曝光后烘烤(post exposure bake)60秒。然后在顯影劑MF26-A中洗漆玻璃表面,無金屬離子的顯影劑(a metal ion free developer)用于Microposit S1800G2系列和SPR700系列。參見圖10，該表面具有可視的玻璃表面的正方形島。3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷的化學(xué)氣相沉積在100%氧氣氣流和100%功率下使用等離子處理基板2分鐘。處理的區(qū)域具有活性氧基團(tuán)，并且將其與容器中的0.2ml3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(GOPS) —起放置在干燥器中。使用Veeco真空泵或中心真空管線降低壓力。該基板在低壓下溫育至少2.5小時，以便確保GOPS在圖案化的正方形島上化學(xué)氣相沉積。除了在島上以外，在載玻片上圖案化的區(qū)域被劃線，然后進(jìn)行離脫(lift-off)處理以便從玻璃表面除去硅烷基團(tuán)。當(dāng)強(qiáng)力旋轉(zhuǎn)容器時，將抗蝕劑在丙酮浴中溶解3-4分鐘，然后將其移至異丙醇浴中10秒并且使用氮氣干燥。DNA的固定
將含有生物素末端的PCR產(chǎn)物液滴(20_30ml)放置在圖案化的區(qū)域并且在室溫下于潮濕空氣中溫育至少7小時。在溫育之后，在PBS-T中洗滌基板，然后在PBS中洗滌并且然后在蒸餾水中洗滌。在洗滌之后將基板放置在PH9.0包含SDS (0.1%)與氨乙醇(50mM)的Tris-HCl緩沖液(0.05M)中并且在37°C下于潮濕空氣中溫育至少8小時。這避免了鏈霉親和素偶聯(lián)的磁珠的非特異性結(jié)合。該溫育之后，再使用PBS (該PBS包含5%牛血清蛋白)進(jìn)行另一個溫育步驟。進(jìn)行該步驟以便阻斷表面區(qū)域。使用差示干涉差顯微鏡檢測根據(jù)Invitrogen手冊所提出的，制備約IOml鏈霉親和素偶聯(lián)的珠粒，Dynabeads M-270鏈霉親和素。將約30_40ml放置在玻璃表面上的劃線區(qū)域上并且在室溫下于50RPM的旋轉(zhuǎn)臺上溫育20分鐘。然后將基板放置在結(jié)合&洗滌(B&W:10mM Tris-HCl(pH7.5), ImM EDTA, 2M NaCl)溶液中并在室溫下以80RPM旋轉(zhuǎn)1_2分鐘。重復(fù)最后的步驟，并且然后在室溫下于 Panhorst 溶液(50mM Na2HPO4UOmM Tris-Base、5mMEDTA、0.1%SDS、
0.01% 月桂酰肌氨酸、0.01%Tween20、0.01%TritonX100、0.1M NaCl、0.5%PEG4000，用乙酸將pH調(diào)節(jié)至8.5)中以100RPM洗滌兩次基板。然后將基板放置在Tris-HCl緩沖液中并且使用差示干涉差顯微鏡檢 查。結(jié)果參見圖11。
權(quán)利要求
1.一種用于確定固定在固體載體上的單一多核苷酸的核苷酸序列的方法，包括以下步驟: (i)使所述多核苷酸與至少一種測試互補(bǔ)堿基和/或至少一種探針接觸，所述探針包括可與所述多核苷酸中的一個或多個堿基互補(bǔ)的部分，珠粒連接至所述至少一種測試互補(bǔ)堿基和/或至少一種探針或者結(jié)合對的第一結(jié)合伴侶連接至所述至少一種測試互補(bǔ)堿基和/或至少一種探針，并且當(dāng)所述測試互補(bǔ)堿基和/或所述測試互補(bǔ)探針的部分與所述多核苷酸中的所述一個或多個堿基互補(bǔ)時，所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針共價結(jié)合至所述多核苷酸； ( )當(dāng)結(jié)合伴侶連接至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針時，通過所述結(jié)合對，將連接至所述結(jié)合對的第二結(jié)合伴侶的珠粒結(jié)合至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針，所述第一結(jié)合伴侶連接至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針； (iii)可選地，使用至少一種不同的測試互補(bǔ)堿基和/或探針，重復(fù)步驟(i)、或步驟(i)與步驟(ii)，直到與所述一個或多個堿基互補(bǔ)的測試堿基和/或其部分與所述一個或多個堿基互補(bǔ)的測試探針已結(jié)合至所述多核苷酸； (iv)通過確定步驟(i)至步驟(iii)期間連接至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針的所述珠粒是否結(jié)合至所述多核苷酸，來確定哪種測試互補(bǔ)堿基和/或所述測試探針的哪個互補(bǔ)部分結(jié)合至所述多核苷酸的所述一個或多個堿基，從而識別所述多核苷酸的所述一個或多個喊基；以及 (v)如果在步驟(iv)期間沒有除去珠粒，則除去所述珠粒； 其中，步驟(i)至步驟(V)的每一個循環(huán)進(jìn)行一次或多次，并且在每一個循環(huán)中識別所述序列的一個或多個 堿基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中，至少進(jìn)行兩次循環(huán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的方法，其中，通過連接或聚合進(jìn)行所述互補(bǔ)堿基和/或所述探針的共價結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中，所述方法是通過合成測序、通過連接測序或通過逐步連接和切割測序中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中，所述方法包括以下步驟: (i)使所述多核苷酸與至少一種測試探針以及可選地至少一種測試互補(bǔ)堿基接觸，至少一種所述測試探針包括可與所述多核苷酸中的一個或多個堿基互補(bǔ)的部分，至少一種所述測試互補(bǔ)堿基可與所述多核苷酸中的堿基互補(bǔ)，珠粒連接至至少一種所述測試探針或至少一種所述測試互補(bǔ)堿基，或結(jié)合對的第一結(jié)合伴侶連接至至少一種所述測試探針或至少一種所述測試互補(bǔ)堿基，并且當(dāng)所述測試互補(bǔ)堿基和/或所述測試互補(bǔ)探針的部分與所述多核苷酸中的所述一個或多個堿基互補(bǔ)時，通過將所述探針連接至所述多核苷酸，將所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針共價結(jié)合至所述多核苷酸； ( )當(dāng)結(jié)合伴侶連接至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針時，通過所述結(jié)合對，將連接至所述結(jié)合對的第二結(jié)合伴侶的珠粒結(jié)合至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針，所述第一結(jié)合伴侶連接至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針；(iii)可選地，使用至少一種不同的測試互補(bǔ)堿基和/或探針重復(fù)步驟(i)、或步驟(i)與步驟(ii)，直到與所述一個或多個堿基互補(bǔ)的測試堿基和/或其部分與所述一個或多個堿基互補(bǔ)的測試探針已結(jié)合至所述多核苷酸； (iv)在每一步驟(i)、或步驟(i)與步驟(ii)之后、或在步驟(iii)之后，如果所述測試探針結(jié)合至所述多核苷酸，則加入能夠除去所述珠粒的酶，所述酶通過切割反應(yīng)除去至少一部分的所述測試探針和待測序的多核苷酸的至少一個堿基；以及 (V)通過確定步驟(i)至步驟(iii)期間連接至所述測試互補(bǔ)堿基和/或探針的所述珠粒是否結(jié)合至所述多核苷酸，來確定哪種測試互補(bǔ)堿基和/或所述測試探針的哪個互補(bǔ)部分結(jié)合至所述多核苷酸的所述一個或多個堿基，從而識別所述多核苷酸的所述一個或多個喊基； 其中，步驟(i)至步驟(V)的每一個循環(huán)進(jìn)行一次或多次，并且在每一個循環(huán)中識別所述序列的一個或多個堿基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述酶是核酸酶，所述核酸酶具有不同于其識別位點的切割位點，并且所述測試探針包括針對所述核酸酶的識別位點。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的方法，其中，所述酶是限制酶，優(yōu)選是IIb型限制酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其中，在步驟(iv)中依次使用各自能夠從不同的測試互補(bǔ)探針中除去珠粒的多種酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其中，確定步驟(iv)或步驟(V)包括確定與所述珠粒相關(guān)的信號的存在、不存在或水平，其中所述信號的存在指示所述測試堿基和/或探針的結(jié)合。
10.根據(jù)權(quán)利要求9中所述的方法，其中，確定在所述切割步驟之前和之后與所述珠粒相關(guān)的信號水平，并且切割之后信號的降低指示所述測試堿基和/或探針。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的方法，其中，所述珠粒的半徑大于所述多核苷酸的長度。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的方法，其中，所述探針或者所述珠粒與所述測試互補(bǔ)探針和/或堿基之間的連接包括針對限制酶的識別位點。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法，其中，所述珠粒是磁性的。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所述的方法，其中，所述互補(bǔ)堿基或探針在結(jié)合進(jìn)一步的互補(bǔ)堿基或探針時終止。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的方法，其中，在所述互補(bǔ)堿基和/或探針結(jié)合至所述多核苷酸之前或之后，將所述珠粒連接至所述互補(bǔ)堿基和/或所述探針。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的方法，其中，利用包括提供有用于檢測珠粒的裝置的表面的設(shè)備來檢測所述珠粒。
17.根據(jù)權(quán)利要求16中所述的方法，其中，所述表面提供有一個或多個感應(yīng)元件，優(yōu)選光敏元件。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的方法，其中，所述檢測是通過檢測源自光敏表面上所述珠粒的存在的光改變。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項所述的方法，其中，通過其磁性來除去和/或檢測所述珠粒。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項所述的方法，其中，所述固體載體是芯片。
全文摘要
本發(fā)明提供了對單一多核苷酸測序的方法，其中在測序期間插入的核苷酸堿基和/或探針用珠粒標(biāo)記，檢測該珠粒以便識別結(jié)合至單一多核苷酸的堿基和/或探針。特別地，使用包含提供有用于檢測珠粒的裝置的表面的設(shè)備，可以進(jìn)行珠粒的檢測，例如提供有一種或多種光敏元件。
文檔編號C12Q1/68GK103249843SQ201180057746
公開日2013年8月14日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者賈爾勒·科特斯巴克 申請人:金?？斯煞萦邢薰?br>