專利名稱：干細(xì)胞和祖細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)、鑒定及其應(yīng)用的制作方法
干細(xì)胞和袓細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)、鑒定及其應(yīng)用本申請為分案申請，原申請的申請日為2003年4月13日，申請?zhí)枮?03813627. 9 (PCT/US03/11327)，發(fā)明名稱為“干細(xì)胞和祖細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)、鑒定及其應(yīng)用”。本申請要求2002年4月12日提交的美國臨時申請60/372348，2002年12月31日提交的美國臨時申請60/437348及2002年12月31日提交的美國臨時申請60/437350的優(yōu)先權(quán)，在此引用每一篇的全部內(nèi)容。1.介紹本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)哺乳動物干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞分化的方法。本發(fā)明的方法可用于調(diào)節(jié)和控制哺乳動物，尤其是人的干細(xì)胞沿著特定細(xì)胞和組織譜系的分化和成熟。本發(fā)明的方法涉及使用某些小的有機(jī)分子來調(diào)節(jié)干細(xì)胞或祖細(xì)胞群沿著特定細(xì)胞和組織譜系的分化，尤其是源于產(chǎn)后胎盤的胚胎樣干細(xì)胞的分化或沿著特定分化途徑，特別是粒細(xì)胞分化途徑的早期造血祖細(xì)胞的調(diào)節(jié)。本發(fā)明還涉及使用這些有機(jī)分子來調(diào)節(jié)特定譜系祖細(xì)胞，如CD34+，CD45+和CD133+祖細(xì)胞的分化。本發(fā)明還涉及祖細(xì)胞發(fā)育的時間方面，以及基于這些時間方面的體外模型。本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些得到調(diào)節(jié)的細(xì)胞在預(yù)防和治療方法中，包括在這種細(xì)胞和/或小的有機(jī)化合物的藥物組合物中的應(yīng)用。最后，本發(fā)明涉及這種分化的細(xì)胞在移植和其他醫(yī)學(xué)治療中的應(yīng)用。2.
背景技術(shù)：
在人的干細(xì)胞和祖細(xì)胞的鑒定、分離和增殖上有重要的關(guān)注。干細(xì)胞是能產(chǎn)生多種成熟細(xì)胞譜系的全能或多能前體細(xì)胞，前體細(xì)胞是能產(chǎn)生特定細(xì)胞譜系細(xì)胞的細(xì)胞。這些能力作為對于器管和組織發(fā)育必需的細(xì)胞分化和特化的基礎(chǔ)。近來在移植干細(xì)胞和祖細(xì)胞上的成功已經(jīng)提供了新的臨床工具以用于因疾病、暴露于有毒化學(xué)物質(zhì)和/或輻射的骨髓切除后的骨髓重建和/或補(bǔ)充。進(jìn)一步證據(jù)的存在證明干細(xì)胞可用于重建許多，即使不是全部的組織以及修復(fù)生理狀況和生理學(xué)和解剖學(xué)上的功能。干細(xì)胞在組織工程、基因治療傳送以及細(xì)胞療法中的應(yīng)用也正迅速地發(fā)展著。許多不同類型的哺乳動物干細(xì)胞和祖干細(xì)胞已得到鑒定。例如，已知的有胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞、成體干細(xì)胞、或定向干細(xì)胞或祖細(xì)胞。某些干細(xì)胞還未被分離和鑒定， 但已經(jīng)在允許向限定的范圍分化的條件下得到培養(yǎng)。然而，剩下一個基本問題，就是，控制和調(diào)節(jié)干細(xì)胞和祖細(xì)胞，如造血祖細(xì)胞的分化是很困難的。目前，現(xiàn)有的調(diào)節(jié)這些細(xì)胞分化的方法是不成熟的和不可控制的，從而細(xì)胞在不需要的時間分化成不需要的細(xì)胞類型。而且，細(xì)胞產(chǎn)品的產(chǎn)率一般比較低。此外，獲得足夠數(shù)量的用于治療或研究目的的人干細(xì)胞尚有問題。部分地，由于在血或組織中找到的干細(xì)胞或祖細(xì)胞的有限數(shù)量以及與獲得骨髓吸出物有關(guān)的顯著不適，分離成體組織中正常存在的干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體有技術(shù)上的困難，且費(fèi)用昂貴。一般而言，從替代性來源收獲足夠數(shù)量用于治療或研究目的的干細(xì)胞或祖細(xì)胞通常是很費(fèi)力的，包括， 例如，從供體或患者收獲細(xì)胞或組織、體外培養(yǎng)和/或傳播細(xì)胞、解離細(xì)胞等。至于干細(xì)胞尤其是從胚胎或胎兒組織，包括流產(chǎn)兒中獲得這些細(xì)胞，已上升到宗教和倫理道德的顧慮。 廣泛認(rèn)定的人胚胎或胎兒就構(gòu)成獨(dú)立生命的信念已促成在如此來源的細(xì)胞用于所有目的，包括醫(yī)學(xué)研究的用途上政府的禁止。因而，不需要應(yīng)用從胚胎或胎兒獲得的細(xì)胞的替代性來源就期望在干細(xì)胞臨床應(yīng)用中的進(jìn)一步發(fā)展。然而，很少有可用的干細(xì)胞或祖細(xì)胞，特別是人干細(xì)胞或祖細(xì)胞的替代性來源，因此，供給是有限的。Hu等(W0 00/73421，題為“人羊膜上皮細(xì)胞的分離、深低溫保藏的方法以及治療用途”，公開于2000-12-07)公開了源于分娩時胎盤的人羊膜上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、為了將來使用的深低溫保藏或誘導(dǎo)分化。按照Hu等所述，分娩后立即獲得一胎盤并從絨毛膜分離羊膜，例如通過解剖。羊膜上皮細(xì)胞按照標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞分離技術(shù)從羊膜分離。該公開的細(xì)胞可以在各種培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)、在培養(yǎng)中增殖、冷藏或被誘導(dǎo)分化。Hu等公開了羊膜上皮細(xì)胞是全能造血干細(xì)胞(也可能是多能造血干細(xì)胞)，且能分化為上皮組織，如角膜表皮組織或陰道組織。然而，該方法的缺點(diǎn)是勞動密集，且干細(xì)胞的產(chǎn)率非常低?，F(xiàn)有的細(xì)胞群體的體外增殖方法也是勞動密集型的。例如，Emerson等(Emerson 等，美國專利號63^198，題為“用于體內(nèi)干細(xì)胞的復(fù)制、造血祖細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)化以及增強(qiáng)人基質(zhì)細(xì)胞的代謝、GM-CSF分泌和/或IL-6分泌的方法和組分”，公布于2001-12-04)公開了人干細(xì)胞分裂和/或人造血祖細(xì)胞的優(yōu)化的方法及體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基條件。按照所公開的方法，源于骨髓的人干細(xì)胞或祖細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其可被替換，優(yōu)選灌注培養(yǎng)， 連續(xù)地或周期性地，以每毫升培養(yǎng)物1毫升培養(yǎng)基的速率，每約M小時至48小時為周期。 在生理上可接受的條件下維持培養(yǎng)時，除去代謝產(chǎn)物，補(bǔ)充消耗的養(yǎng)分。Kraus等(Kraus等，美國專利號6338942，題為“靶細(xì)胞群體的選擇性增殖”，公布于2002-01-15)公開了預(yù)定的靶細(xì)胞群體可選擇性地增殖，通過在生長培養(yǎng)基中引進(jìn)源于臍帶血或外周血地起始標(biāo)樣細(xì)胞，致使靶細(xì)胞群體分裂，以及在生長培養(yǎng)基中用選擇成分接觸細(xì)胞，包括對預(yù)定的細(xì)胞群體(如CD34細(xì)胞)有特定親和力的結(jié)合分子(例如CD34 細(xì)胞的單集落抗體)，以在生長培養(yǎng)基中從其他細(xì)胞選擇出預(yù)定的靶細(xì)胞群體。Rodgers等(美國專利號6335195題為“促進(jìn)造血和間充質(zhì)細(xì)胞增殖和分化的方法”公布于2002-01-01)公開了造血和間充質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)以及通過在有血管緊張素原、 血管緊張素I(AI)、AI同功異質(zhì)體、AI片段和其類似物，血管緊張素II (All)、AII同功異質(zhì)體、AII片段和其類似物或All AT2型2受體激動劑，單獨(dú)或與其他生長因子和細(xì)胞因子聯(lián)合存在下生長的譜系特異的細(xì)胞增殖和分化的誘導(dǎo)方法。該干細(xì)胞源于骨髓、外周血或臍帶血。然而，如上面所討論的，該方法的缺點(diǎn)是該體外誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖和分化的方法耗時， 也導(dǎo)致了干細(xì)胞的低產(chǎn)量。干細(xì)胞和祖細(xì)胞具有用于治療多種病癥的潛能，包括惡性腫瘤、遺傳性代謝缺陷、 血紅蛋白病及免疫缺陷。涉及源于臍帶血或胎盤的干細(xì)胞的運(yùn)用或研究的一個主要領(lǐng)域?yàn)槭褂眠@些細(xì)胞生產(chǎn)少量細(xì)胞用于骨髓及其他相關(guān)的移植術(shù)。然而，迄今為止，沒人提出生產(chǎn)大量干細(xì)胞或祖細(xì)胞，如人CD34+或CD133+祖細(xì)胞的方法。尤其是，大量的后者細(xì)胞將使使用祖細(xì)胞的治療方法變的容易。在此，本發(fā)明公開的方法涉及該需求。視黃醛衍生物，如維生素A和視黃酸(RA)，已知可影響干細(xì)胞的分化。例如，視黃酸已被用于抑制不規(guī)則定向(慢性骨髓性白血病)造血干細(xì)胞的增殖(Nadkarni等， 1984, Tumori 70 =503-505)以及在前髓白血病細(xì)胞中誘導(dǎo)分化和自我更新潛能的喪失 (Melchner等，1985，Blood 66(6) :1469-1472)。視黃酸還被用于誘導(dǎo)源于胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)元的分化以及抑制自發(fā)的中胚層分化(Slager等，Dev. Genet. 1993,14(3) :212-24, Ray等，1997，J.Biol. Chem. 272(30) 18702-18708)。視黃酸還進(jìn)一步被用于誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的生殖細(xì)胞前體(Damjanov 等，1993，Labor. Investig, 68 (2) :220-232)、胎盤細(xì)胞前體(Yan 等， 2001，Devel. Biol. 235 :422-432)、及內(nèi)皮細(xì)胞前體(Hatzopoulos 等，1998，Development 125:1457-1468)的分化。然而，視黃醛衍生物在分化中的作用已十分了解，其可作為控制干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)手段而使用。葉酸類似物，如氨基蝶呤和氨甲蝶呤(甲氨蝶呤)在造血干細(xì)胞分化中的作用已得到研究。葉酸類似物作為化學(xué)療法試劑用于急性成淋巴細(xì)胞貧血和其他血增殖病癥及癌癥，且表明其通過殺光某類干細(xì)胞群體來影響干細(xì)胞的分化(DeLoia等，1998，Human Reproduction 13(4) :1063-1069)，因此，不能成為用于調(diào)節(jié)給藥于患者的大量干細(xì)胞的分化的有效工具。一些細(xì)胞因子，如IL-1、IL-2、IL_3、IL_6、IL7、IL-11，與一些蛋白如促紅細(xì)胞生成素、Kit配體、M-CSF及GM-CSF，也已被顯示指導(dǎo)干細(xì)胞按造血譜系分化為特定細(xì)胞類型 (Dushnik-Levinson 等，1995，Biol. Neonate 67 :77-83)，但是，這些過程沒有得到充分了解并仍然太粗糙和不精確而不能作為控制干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)手段。迄今為止，沒人描述化合物，如下述的免疫調(diào)節(jié)劑化合物在干細(xì)胞或前體細(xì)胞分化中的應(yīng)用。尤其是，沒人證明這樣的化組合物調(diào)節(jié)祖細(xì)胞，如CD34+祖細(xì)胞，遠(yuǎn)離樹突細(xì)胞譜系分化的用途，這種分化是用于提高移植免疫耐受性的有益能力。而且，沒人描述在此所述的化合物在為了生產(chǎn)含有該細(xì)胞的醫(yī)藥組合物而增殖祖細(xì)胞群體中的用途。該增殖的祖細(xì)胞培養(yǎng)物在治療移植物抗宿主病和免疫耐受性的提高中是有用的。因?yàn)榭刂聘杉?xì)胞和前體細(xì)胞分化可生產(chǎn)在治療上有效的細(xì)胞群體，因此，對于控制和調(diào)節(jié)髓樣樹突細(xì)胞譜系細(xì)胞，或早期祖細(xì)胞，如人CD34+或CD133+祖細(xì)胞的分化的能力有所需要，以控制樹突細(xì)胞和/或粒細(xì)胞的產(chǎn)生。3.發(fā)明概述本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)哺乳動物，特別是人干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化的方法。具體地說，本發(fā)明的方法可用于調(diào)節(jié)和控制人干細(xì)胞沿著特定的細(xì)胞和組織譜系的分化和成熟。本發(fā)明包括影響該調(diào)節(jié)和控制的免疫調(diào)節(jié)小分子有機(jī)物，更優(yōu)選氨基取代的異吲哚啉化合物，尤其是Actimid 或Revimid 化合物的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在特定時段這些化合物的給藥于祖細(xì)胞，以從特定途徑調(diào)節(jié)分化。本發(fā)明的方法包括干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化成特定細(xì)胞譜系的調(diào)控，這些細(xì)胞譜系包括但不限于，間質(zhì)的、造血的、生脂的、生肝的、生神經(jīng)的、成膠質(zhì)的、生軟骨的、生血管的、生肌的、生軟骨的或生骨的譜系。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括干細(xì)胞分化為造血譜系細(xì)胞的調(diào)控。本發(fā)明還包括定向細(xì)胞成為特定細(xì)胞類型的調(diào)控，所述細(xì)胞類型是例如間充質(zhì)細(xì)胞、造血細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞、成膠質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞(EC)祖細(xì)胞、肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括定向造血祖細(xì)胞分化成紅細(xì)胞、血小板或白細(xì)胞(白血細(xì)胞)，如嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、肥大細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞或漿細(xì)胞的調(diào)控。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及調(diào)節(jié)干細(xì)胞向造血譜系細(xì)胞，尤其是， ⑶34+、⑶133+和⑶45+造血譜系的分化，以及生產(chǎn)含有該細(xì)胞的預(yù)防或治療上有益的藥物組合物的方法。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及調(diào)節(jié)早期祖細(xì)胞向樹突細(xì)胞譜系、 或粒細(xì)胞譜系、內(nèi)皮細(xì)胞譜系或心肌細(xì)胞譜系的分化。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)祖細(xì)胞向造血細(xì)胞譜系，尤其是樹突細(xì)胞譜系或粒細(xì)胞譜系、內(nèi)皮細(xì)胞譜系、神經(jīng)細(xì)胞譜系或心肌細(xì)胞譜系分化的方法。在具體的實(shí)施方案中，所述的祖細(xì)胞為CD34+或CD133+細(xì)胞。該調(diào)控通過在培養(yǎng)過程中用本發(fā)明的化合物接觸祖細(xì)胞而完成。在一個實(shí)施方案中，所述化合物為TNF-α活性抑制因子。在更具體的實(shí)施方案中，所述化合物是本文所述的免疫調(diào)節(jié)劑化合物，或沙利度胺，或更優(yōu)選地，為氨基取代的異吲哚啉化合物。在更進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，所述化合物為Actimid 或 Revimid 。在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括祖細(xì)胞分化為樹突細(xì)胞的抑制。 在另一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)在起始六天培養(yǎng)過程中的祖細(xì)胞分化的方法，其培養(yǎng)用于生產(chǎn)該祖細(xì)胞的增殖培養(yǎng)物。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括對早期祖細(xì)胞發(fā)育成粒細(xì)胞的促進(jìn)，該粒細(xì)胞可能對于抵抗感染是有效的。粒細(xì)胞譜系定向祖細(xì)胞(CD15+細(xì)胞)的增加在減輕中性白細(xì)胞減少癥和其隨后的感染并發(fā)癥中具有潛在的用途，該病癥代表了癌癥化學(xué)療法最普遍的劑量限制性毒性。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于抑制樹突細(xì)胞的分化，其對于緩和移植物抗宿主病的效應(yīng)是有效的。本發(fā)明的祖細(xì)胞，用本發(fā)明的化合物調(diào)節(jié)后，對于移植是有效的(即造血的恢復(fù))，并可作為替代細(xì)胞和組織(如胰臟、心臟、肝臟、腎臟、肝、腦、肺、膀胱、腸或肌肉細(xì)胞) 的可再生來源用于治療正常的衰老、損傷或疾病如心臟病、中風(fēng)、帕金森病和阿爾茨海默病中的再生藥物。該細(xì)胞在測定介導(dǎo)本發(fā)明的化合物的作用的胞內(nèi)生化途徑中也是有用的。 這些細(xì)胞對于篩選新的藥物和毒素也是有用的，例如，用于確定抗癌藥物的潛能，理解出生缺陷的起因等。本發(fā)明的方法可用于特異性地抑制紅血細(xì)胞或紅細(xì)胞集落(BFU-E和CFU-E)的生成，同時增加白細(xì)胞和血小板集落形成(CFU-GM)的生成以及提高總的集落形成單位的產(chǎn)量。本發(fā)明的方法不僅可用于調(diào)節(jié)干細(xì)胞和祖細(xì)胞如CD34+祖細(xì)胞的分化，還可用于刺激集落形成率，通過提高骨髓移植物移入速度而給造血干細(xì)胞移植提供重要的幫助。除人胚胎干細(xì)胞外的任何哺乳動物干細(xì)胞可按照本發(fā)明的方法而使用，包括但不限于，從臍帶血、胎盤及除人胚胎外的其他來源分離的干細(xì)胞。干細(xì)胞可以從任何哺乳動物種類中分離，例如，大鼠、小鼠、兔、豚鼠、狗、貓、豬、羊、牛、馬、猴等，更優(yōu)選地，人。干細(xì)胞可包含多能細(xì)胞，即，具有完全的分化多樣性、能自我更新以及在組織中維持休眠或靜止的細(xì)胞。干細(xì)胞還可以包括多潛能性細(xì)胞或定向祖細(xì)胞。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明利用活的、靜止的、多能性的干細(xì)胞，其存在于或隨后產(chǎn)生于足期的胎盤，就是說，該細(xì)胞可隨著成功的分娩和胎盤娩出、放血和胎盤灌注而得到回收，致使多達(dá)十億個有核細(xì)胞的產(chǎn)生和回收，其有核細(xì)胞產(chǎn)生50至100百萬的多潛能性或多能性干細(xì)胞。該細(xì)胞在此被稱為人胎盤干細(xì)胞或胚胎樣干細(xì)胞。在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方案中，細(xì)胞，例如骨髓或產(chǎn)后灌注的胎盤的內(nèi)源性細(xì)胞，包括但不限于，胚胎樣干細(xì)胞、祖細(xì)胞如CD34+或CD133+細(xì)胞、多能細(xì)胞或多潛能細(xì)胞，暴露于本發(fā)明的化合物并受到誘導(dǎo)分化。該內(nèi)源性細(xì)胞可在體外繁殖。在另一個實(shí)施方案中，內(nèi)源性細(xì)胞可從胎盤和培養(yǎng)基中收集得到，并在體外適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，且培養(yǎng)一段時間至足以按期望的細(xì)胞類型或譜系來誘導(dǎo)分化。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，干細(xì)胞或祖細(xì)胞源自其它來源如臍帶血、外周血或成人血，并暴露于本發(fā)明的化合物中被誘導(dǎo)分化。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，分化在體外合適的條件下進(jìn)行一段時間，所述時間足以誘導(dǎo)向所期望的細(xì)胞系或細(xì)胞類型分化。本發(fā)明的化合物用于通過添加，在原位產(chǎn)生或其他任何允許干細(xì)胞或祖細(xì)胞與本發(fā)明的化合物接觸的方式用于分化介質(zhì)/培養(yǎng)基中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物給藥的時間對CD34+祖細(xì)胞的分化有極深的影響。因此， 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，CD34+祖細(xì)胞分化為樹突細(xì)胞通過一種包括使祖細(xì)胞在第一天培養(yǎng)時接觸本發(fā)明的化合物的方法而得到延遲或抑制。在另一個實(shí)施方案中，從CD34+祖細(xì)胞來的CDla+細(xì)胞的發(fā)育通過一種包括使所述祖細(xì)胞在第一天培養(yǎng)時接觸本發(fā)明的化合物的方法而得到降低或阻礙。在另一個實(shí)施方案中，源于CD34+祖細(xì)胞的CDla+細(xì)胞群體的持久性通過在無本發(fā)明的化合物存在下培養(yǎng)所述祖細(xì)胞六天后接觸該化合物而得到提高。本發(fā)明還包括調(diào)節(jié)早期祖細(xì)胞如人⑶34+和⑶133+細(xì)胞分化的方法，包括使祖細(xì)胞在增殖和分化期間的不同時間與一種或多種本發(fā)明的化合物接觸。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種調(diào)節(jié)祖細(xì)胞分化的方法，包含使所述細(xì)胞僅在培養(yǎng)第一天與本發(fā)明的一種或多種化合物接觸。在另一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞與所述化合物在培養(yǎng)的第一天至第12天中任何一天以一次劑量接觸。在另一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在0至12天，包括 0天和12天的不同天數(shù)中至少和所述化合物接觸兩次。仍在另一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在增殖和/或分化時期與一種或多種化合物接觸一天兩次、一天一次或隔一天一次。在另一個實(shí)施方案中，所述接觸在體外進(jìn)行。仍在另一個實(shí)施方案中，所述接觸在受治療者體內(nèi)進(jìn)行。在一個更具體的實(shí)施方案中，所述受治療者是人、非人的哺乳動物、鳥類或爬行動物?？偠灾稍诋a(chǎn)后灌注的胎盤中培養(yǎng)的內(nèi)源性或外源性干細(xì)胞或祖細(xì)胞暴露于本發(fā)明的化合物可以在這些細(xì)胞被培養(yǎng)于產(chǎn)后灌注的胎盤發(fā)生，或優(yōu)選地，可以將在體外細(xì)胞從胎盤中回收或移去后發(fā)生。本發(fā)明包括具有TNF-α活性的化合物作為干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞發(fā)育調(diào)節(jié)劑的用途。在一個具體的實(shí)施方案中，該化合物為免疫調(diào)節(jié)劑化合物，如已知的IMiDs 類的化合物，包括但不限于沙利度胺類似物、Actimid (Ce 1 gene Corp.，Warren，NJ)及 Revimid (Celgene Corp.，Warren, NJ)。本發(fā)明還包括經(jīng)預(yù)處理的干細(xì)胞或祖細(xì)胞用于治療和預(yù)防疾病的移植。在一個實(shí)施方案中，一需要移植的患者在移植前、中間和/或移植后菌給予化合物的藥物。本發(fā)明進(jìn)一步包括由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的祖細(xì)胞或特定類型細(xì)胞的用途。換言之，本發(fā)明包括由造血祖細(xì)胞分化制得的白細(xì)胞、粒細(xì)胞或樹突細(xì)胞的用途，其中所述祖細(xì)胞分化用本發(fā)明的化合物調(diào)節(jié)或調(diào)控。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括干細(xì)胞的控制或調(diào)控，通過在體內(nèi)以干細(xì)胞和本發(fā)明的小分子化合物給藥于其所需的患者。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含⑶34+或⑶133+祖細(xì)胞和可藥用載體的藥物組合物，其中所述祖細(xì)胞已經(jīng)在培養(yǎng)的前6天在促進(jìn)所述祖細(xì)胞增殖和分化的條件下與本發(fā)明的化合物，尤其是移植TNF-α活性的化合物接觸。在一個具體的實(shí)施方案中，藥物組合物包含六天培養(yǎng)后收集和深低溫保藏的細(xì)胞。在另一具體的實(shí)施方案中，藥物組合物中的細(xì)胞為⑶；34+⑶38XD34—或⑶34+CD38TD34+細(xì)胞。在另一個具體的實(shí)施方案中，與細(xì)胞接觸的化合物為本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑化合物，或沙利度胺或沙利度胺類似物。在另一個具體的實(shí)施方案中，與細(xì)胞接觸的化合物為Actimid 或Revimid 。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了制備藥物組合物的方法，包括用抑制 TNF-α活性的化合物接觸CD34+或CD133+祖細(xì)胞，其中所述祖細(xì)胞在允許增殖的培養(yǎng)條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)了六天，其中所述祖細(xì)胞在允許所述祖細(xì)胞增殖和分化的培養(yǎng)條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)了六天；在培養(yǎng)六天后收集所述細(xì)胞；以及將可藥用的載體與所述細(xì)胞組合。在該方法的一個具體實(shí)施方案中，所述接觸在培養(yǎng)第一天進(jìn)行。在該方法的另一個具體實(shí)施方案中，所述接觸在所述的六天培養(yǎng)中至少進(jìn)行兩次。在該方法的另一個具體實(shí)施方案中，所述化合物為本發(fā)明的小分子免疫調(diào)節(jié)劑化合物。在另一個具體實(shí)施方案中，與細(xì)胞接觸的化合物為Actimid 或Revimid 。在仍是該方法的另一個具體實(shí)施方案中，所述祖細(xì)胞在所述培養(yǎng)前已從其他的血細(xì)胞中分離。在該方法的另一個具體實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基另外還包含GM-CSF和TNF-α。在該方法的另一個更具體實(shí)施方案中，所述Actimid 或Revimid 以0. 1 μ M至10. 0μ M的濃度存在。在該方法的另一個更具體實(shí)施方案中，所述Actimid 或Revimid 以Ι.ΟμΜ的濃度存在。在該方法的另一個具體實(shí)施方案中，將所述細(xì)胞在收集后進(jìn)行深低溫保藏。本發(fā)明進(jìn)一步提供在哺乳動物受治療者中增殖祖細(xì)胞群體的方法，包括給藥以治療上有效量的⑶；34+或⑶133+祖細(xì)胞和Actimid 或Revimid 于所述受體哺乳動物受治療者。在該方法的具體實(shí)施方案中，所述祖細(xì)胞在受體哺乳動物受治療者中分化。在該方法的另一個具體實(shí)施方案中，所述祖細(xì)胞以基本上無紅血細(xì)胞的細(xì)胞制備物形式給藥于所述受治療者。在該方法的另一個具體實(shí)施方案中，所述祖細(xì)胞以包含骨髓細(xì)胞、胎盤細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞或PBMC的細(xì)胞制備物形式給藥于受體哺乳動物受治療者。在該方法的另一個具體實(shí)施方案中，所述祖細(xì)胞以與載體聯(lián)合的形式給藥于受體哺乳動物受治療者。在該方法的另一個具體實(shí)施方案中，所述祖細(xì)胞為CD34+CD133+祖細(xì)胞。在該方法的另一個具體實(shí)施方案中，所述祖細(xì)胞表達(dá)摻入的目的遺傳材料。本發(fā)明還提供由上述方法制備的作為藥物組合物的細(xì)胞。仍在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在深低溫保藏和融化后調(diào)節(jié)干細(xì)胞或祖細(xì)胞例如CD34+祖細(xì)胞，以消除深低溫保藏和暴露于冷凍保藏劑對于干細(xì)胞的有害影響的方法。 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在深低溫保藏和融化后調(diào)節(jié)干細(xì)胞，以消除暴露于冷凍保藏劑(例如，DMS0)而對干細(xì)胞增殖和遷移能力的有害影響的方法。3. 1 定義如本文所用的，術(shù)語“生物反應(yīng)器”是指用于繁殖細(xì)胞、生產(chǎn)或表達(dá)生物材料以及生長或培養(yǎng)細(xì)胞組織、類器官、病毒、蛋白、多核苷酸和微生物的體外系統(tǒng)。如本文所用的，“DC細(xì)胞”是指樹突細(xì)胞。如本文所用的，“早期祖細(xì)胞”是指CD34+祖細(xì)胞、CD133+祖細(xì)胞或哺乳動物、禽類或爬行類中的任一等效物。如本文所用的，術(shù)語“胚胎干細(xì)胞”是指源于囊胚泡(例如4-5天的人胚胎)內(nèi)生細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞，且具有多能性。如本文所用的，術(shù)語“胚胎樣干細(xì)胞”是指非源于囊胚泡內(nèi)生細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞。如本文所用的，“胚胎樣干細(xì)胞”還可能是指“胎盤干細(xì)胞”。優(yōu)選胚胎樣干細(xì)胞是多能性的。然而，可以從胎盤獲得的干細(xì)胞包括胚胎樣干細(xì)胞、多潛能性細(xì)胞及定向祖細(xì)胞。按照本發(fā)明的方法，源于胎盤的胚胎樣干細(xì)胞可從分離的胎盤中收集，其經(jīng)過了一段時間的放血和灌注，足以除去殘留細(xì)胞。優(yōu)選地，胚胎樣干細(xì)胞是人源的，雖然可來源于任何哺乳動物。如本文所用的，術(shù)語“放血的”或“放血”，當(dāng)與胎盤相關(guān)使用時，是指從胎盤除去和 /或排出基本上所有的臍帶血。按照本發(fā)明，胎盤放血可通過，例如，但并不由此限定，排出、 重力誘導(dǎo)的流出、按摩、擠壓、抽吸等等而完成。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，胎盤的放血可進(jìn)一步通過灌注、漂洗或用含或不含試劑，如抗凝劑的液體沖洗胎盤，以助于胎盤的放血而完成。如本文所用的，術(shù)語“灌注”或“灌注法”是指透過器官或組織流出或排出液體，優(yōu)選地，透過器官或組織的液體的排出具有足夠的力量或壓力以除去任何殘留細(xì)胞，即，源于器官或組織的非粘附細(xì)胞。如本文所用的，術(shù)語“灌注液”是指隨著從器官或組織排出而收集的液體。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，灌注液包含一種或多種抗凝劑。如本文所用的，術(shù)語“內(nèi)源細(xì)胞”指一種“非外源”細(xì)胞，即，一種自身的或自體同源的細(xì)胞，它源于胎盤。如本文所用的，術(shù)語“外源細(xì)胞”是指“外來的”細(xì)胞，S卩，異種細(xì)胞(即，源于非胎盤供體來源的“非自我”細(xì)胞)或源于非胎盤的器官或組織的自體同源細(xì)胞(即，源于胎盤供體的“自我細(xì)胞”)。如本文所用的，術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)劑化合物”是指下文5. 3節(jié)公開的化合物。如本文所用的，術(shù)語“類器官”是指以表面外觀形式或如任何器官或哺乳動物體， 優(yōu)選人體的腺體的實(shí)際結(jié)構(gòu)形式裝配的一種或多種細(xì)胞類型的聚集體。如本文所用的，術(shù)語“多潛能性細(xì)胞”是指具有生長為哺乳動物體約260種細(xì)胞類型任一亞類的能力的細(xì)胞。不同于多能性細(xì)胞，多潛能性細(xì)胞不具有形成所有細(xì)胞類型的能力。如本文所用的，術(shù)語“多能性細(xì)胞”是指具有完全分化多樣性的細(xì)胞，S卩，生長為哺乳動物體約260種細(xì)胞類型的能力。多能性細(xì)胞可自我更新，且能在組織中維持休眠或靜止。不同于全能性細(xì)胞(例如，受精的二倍體卵細(xì)胞)，胚胎樣干細(xì)胞通常不能形成新的囊胚泡。如本文所用的，術(shù)語“祖細(xì)胞”是指定向分化為特定細(xì)胞類型或形成特定組織的細(xì)胞。如本文所用的，術(shù)語“干細(xì)胞”是指能不確定地再生而形成組織和器官的限定細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞。干細(xì)胞是在發(fā)育上具有多能性或多潛能性的細(xì)胞。一個干細(xì)胞可分裂產(chǎn)生兩個子代干細(xì)胞，或一個子代干細(xì)胞和一個祖(轉(zhuǎn)變)細(xì)胞，其隨后增殖為組織的成熟的、完全形態(tài)的細(xì)胞。如本文所用的，術(shù)語“全能性細(xì)胞”是指能形成一個完整胚胎(例如，一個囊胚泡) 的細(xì)胞。4.附圖簡述

圖1.柱狀圖顯示了在沙利度胺(THD), Actimid ^P Revimid 以濃度1μ g/ml 和10 μ g/ml存在下培養(yǎng)臍帶血⑶34+細(xì)胞的結(jié)果。等體積的DMSO作為陰性對照。紅細(xì)胞造血爆發(fā)集落形成單位(BFU-E)、紅細(xì)胞集落形成單位(CFU-E)、粒巨噬系集落形成單位 (CFU-GM)和集落總數(shù)(CFU-Total)在光學(xué)顯微鏡下記錄。Y-軸集落數(shù)。詳見6. 1節(jié)。圖2(A_F).流式細(xì)胞圖。人臍帶血CD45+細(xì)胞暴露于Actimid 和Revimid 抑制了紅細(xì)胞的生成和⑶34+CD38_細(xì)胞的增殖。臍帶血⑶45+細(xì)胞在有細(xì)胞因子IL3、IL6、 G-CSF、Epo和KL下培養(yǎng)14天。每張細(xì)胞圖上顯示的百分比表示表達(dá)特定重組標(biāo)記的細(xì)胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C. DMS0(5yg/ml)o D.沙利度胺(“Thai” ) (5 μ g/ml)。Ε. Actimid (5 μ g/ml)。F. Revimid (5 μ g/ml)。X_ 軸: Gly-A(FLl-H)染色的相對強(qiáng)度。Y-軸⑶34 (FL2-H)染色的相對強(qiáng)度。詳見6.1節(jié)。圖3(A_F).流式細(xì)胞圖。人臍帶血CD45+細(xì)胞暴露于Actimid 和Revimid 抑制了在有細(xì)胞因子IL3、KL和G_gsf下培養(yǎng)14天的人臍帶血⑶34+細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)。每張細(xì)胞圖上顯示的百分比表示表達(dá)特定重組標(biāo)記的細(xì)胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白 (Ig)。B.對照，CD45+細(xì)胞。C. DMSO (0. 3 μ g/ml)。D. Thai (0. 3 μ g/ml)。Ε. Actimid (0. 3 μ g/ ml)。F. Revimid (0. 3 μ g/ml)。X-軸CD34(FL1_H)染色的相對強(qiáng)度。Y-軸CXCR4 (FL2-H) 染色的相對強(qiáng)度。詳見6. 2節(jié)。圖4(A_F).流式細(xì)胞圖。人臍帶血CD45+細(xì)胞暴露于Actimid 和Revimid 刺激了⑶34+和/或⑶34+CD38_細(xì)胞群體的增殖。臍帶血⑶45+細(xì)胞在有細(xì)胞因子IL3、 IL6、G-CSF, Epo和KL下培養(yǎng)14天。每張細(xì)胞圖上顯示的百分比表示表達(dá)特定重組標(biāo)記的細(xì)胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C.DMS0(0.3yg/ ml)。D. Thai (0. 3 μ g/ml)。Ε. Actimid (0. 3 μ g/ml)。F. Revimid (0. 3 μ g/ml)。X-軸 ⑶38 (FLl-H)染色的相對強(qiáng)度。Y-軸⑶34(FL2-H)染色的相對強(qiáng)度。詳見6. 2節(jié)。圖5(A_F).流式細(xì)胞圖。人臍帶血CD45+細(xì)胞暴露于Actimid 和Revimid 產(chǎn)生了人臍帶血祖細(xì)胞的重要的保存。臍帶血⑶45+細(xì)胞在有細(xì)胞因子IL3、IL6.G-CSF.Epo 和KL下培養(yǎng)14天。每張細(xì)胞圖上顯示的百分比表示表達(dá)特定重組標(biāo)記的細(xì)胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C. DMSO(5 μ g/ml) 0 D. Thai (5 μ g/ ml)。Ε. Actimid (5 μ g/ml)。F. Revimid (5 μ g/ml)。X-軸CD38 (FL1-H)染色的相對強(qiáng)度。Y-軸⑶34(FL2-H)染色的相對強(qiáng)度。詳見6. 2節(jié)。圖6 (A-F).流式細(xì)胞圖。人臍帶血CD45+細(xì)胞暴露于Actimid 和Revimid 抑制了 ⑶45+細(xì)胞的CXCR4的表達(dá)和增殖了⑶45+細(xì)胞群體。臍帶血⑶45+細(xì)胞在有細(xì)胞因子IL3、 IL6.G-CSF.Epo和KL下培養(yǎng)14天。每張細(xì)胞圖上顯示的百分比表示表達(dá)特定重組標(biāo)記的細(xì)胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C. DMSO (5 μ g/ml)。 D.Thai (5 μ g/ml)。Ε. Actimid (5 μ g/ml)。F. Revimid (5 μ g/ml)。X-軸:CD45(FL1_H)染色的相對強(qiáng)度。Y-軸CXCR4(FL2-H)染色的相對強(qiáng)度。詳見6. 2節(jié)。圖7(A_F).流式細(xì)胞圖。人臍帶血CD45+細(xì)胞暴露于Actimid 和Revimid 產(chǎn)生了 CD34+祖細(xì)胞數(shù)量上的增殖以及提高了粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的產(chǎn)量。臍帶血CD45+細(xì)胞在有細(xì)胞因子IL3、IL6、G-CSF, Epo和KL下培養(yǎng)14天。每張細(xì)胞圖上顯示的百分比表示表達(dá)特定重組標(biāo)記的細(xì)胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。 C. DMSO (5 μ g/ml)。D. Thai (5 μ g/ml)。Ε· Actimid (5 μ g/ml)。F. Revimid (5 μ g/ml)。 X-軸⑶lib (FLl-H)染色的相對強(qiáng)度。Y-軸⑶34(FL2-H)染色的相對強(qiáng)度。詳見6. 2節(jié)。圖8 (A-F).流式細(xì)胞圖。人臍帶血CD45+細(xì)胞暴露于Actimid 和Revimid 增殖了CD34+祖細(xì)胞以及消除了 DMSO介導(dǎo)的單核細(xì)胞產(chǎn)量的抑制。臍帶血CD45+細(xì)胞在有細(xì)胞因子 IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培養(yǎng)14天。每張細(xì)胞圖上顯示的百分比表示表達(dá)特定重組標(biāo)記的細(xì)胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C.DMS0(5yg/ ml)。D. Thai (5 μ g/ml)。Ε. Actimid (5 μ g/ml)。F. Revimid (5 μ g/ml)。X-軸CD14 表達(dá)(FLl-H)染色的相對強(qiáng)度。Y-軸⑶34(FL2-H)染色的相對強(qiáng)度。詳見6.3節(jié)。圖9 (A-F).流式細(xì)胞圖。人臍帶血CD45+細(xì)胞暴露于Actimid 和Revimid 顯示了在分化為B細(xì)胞上的較小的抑制效應(yīng)。臍帶血⑶45+細(xì)胞在有細(xì)胞因子IL3、IL6、G-CSF、 Epo和KL下培養(yǎng)14天。每張細(xì)胞圖上顯示的百分比表示表達(dá)特定重組標(biāo)記的細(xì)胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C. DMSO(5 μ g/ml) 0 D. Thai (5 μ g/ ml)。Ε. Actimid (5 μ g/ml)。F. Revimid (5 μ g/ml)。X-軸CD38 (FL1-H)染色的相對強(qiáng)度。Y-軸⑶19(FL2-H)染色的相對強(qiáng)度。詳見6. 3節(jié)。圖IO(A-F).流式細(xì)胞圖。人臍帶血CD45+細(xì)胞暴露于Actimid 和Revimid 克服了由暴露于DMSO而產(chǎn)生的CXCR5的抑制。臍帶血CD45+細(xì)胞在有細(xì)胞因子IL3、IL6、G-CSF, Epo和KL下培養(yǎng)14天。每張細(xì)胞圖上顯示的百分比表示表達(dá)特定重組標(biāo)記的細(xì)胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C. DMSO(5 μ g/ml) 0 D. Thai (5 μ g/ ml)。Ε. Actimid (5 μ g/ml)。F. Revimid (5 μ g/ml)。X-軸C)(CR5 (FLl-H)染色的相對強(qiáng)度。Y-軸⑶34(FL2-H)染色的相對強(qiáng)度。詳見6. 3節(jié)。圖Il(A-E).流式細(xì)胞圖。人臍帶血單核細(xì)胞(MNCs)暴露于Actimid 和Revimid 提高了 CD34+CD38+細(xì)胞群體數(shù)。每張細(xì)胞圖上顯示的百分比表示表達(dá)特定重組標(biāo)記的細(xì)胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C. DMSO (5 μ g/ml)。 D. Actimid (5 μ g/ml)。Ε. Revimid (5 μ g/ml)。X-軸:CD38 (FLl-H)染色的相對強(qiáng)度。 Y-軸⑶34(FL2-H)染色的相對強(qiáng)度。詳見6. 3節(jié)。圖 12 (A-E).流式細(xì)胞圖。MNCs 暴露于 Actimid 和 Revimid 下調(diào) CXCR4+CD45+細(xì)胞群體數(shù)，但高了 CXCR4+CD45—細(xì)胞群體數(shù)。每張細(xì)胞圖上顯示的百分比表示表達(dá)特定重組標(biāo)記的細(xì)胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C. DMSO(5 μ g/ ml)。D. Actimid (5 μ g/ml)。Ε. Revimid (5 μ g/ml)。X-軸CD45 (FL1-H)染色的相對強(qiáng)度。Y-軸CXCR4(FL2-H)染色的相對強(qiáng)度。詳見6. 3節(jié)。圖13 (A-E).流式細(xì)胞圖。沙利度胺、Actimid 和Revimid 在造血祖細(xì)胞向臍帶血成分的有核細(xì)胞分化的譜系定向化上的影響。流式細(xì)胞圖顯示Actimid 和Revimid 與對照相比提高了單核譜系細(xì)胞的百分比，表明存在分化的調(diào)節(jié)，其轉(zhuǎn)向引起淋巴樣和髓樣細(xì)胞的譜系。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B. DMSO (5 μ g/ml)。C. Thai (5 μ g/ml)。 D. Actimid (5 μ g/ml)。Ε· Revimid (5 μ g/ml)。詳見 6. 4 節(jié)。圖14. Actimid 對⑶34+細(xì)胞分化和成熟為DC細(xì)胞的影響的研究略圖。在增殖和成熟期(第1天至第12天)或成熟期(第6天至第12天)，⑶34+細(xì)胞在1. 0 μ M Actimid 和DMSO(二甲基亞砜)存在或缺乏的條件下培養(yǎng)。在第6天或第12天用FITC和PE綴合的單克隆抗體對免疫組織化學(xué)標(biāo)記進(jìn)行測試。詳見6. 6節(jié)。圖15 (A-D).流式細(xì)胞圖顯示了 6天的⑶34+細(xì)胞的表型特征，從第1天起暴露于 Actimid 。Actimid 幾乎完全抑制了 CD86+CD1+細(xì)胞的發(fā)育。細(xì)胞用CDlaFITC和CD14PE 或CDlaFITC和CD86PE雙標(biāo)記。A 用DMSO(對照)處理的CD34.細(xì)胞產(chǎn)生的CD86+CD1.細(xì)胞。B 用DMSO(對照)處理的⑶；34+細(xì)胞產(chǎn)生的⑶14+⑶1+細(xì)胞。C 用Actimid 處理的 CD34+細(xì)胞產(chǎn)生的CD86+CD1+細(xì)胞。D 用Actimid 處理的CD34+細(xì)胞產(chǎn)生的CDH+CDl+細(xì)胞。每張細(xì)胞圖上顯示的百分比表示表達(dá)特定定重組標(biāo)記的細(xì)胞群體的百分比。詳見6. 6 節(jié)。圖16(A_D).流式細(xì)胞圖顯示了在⑶34+細(xì)胞增殖期(第1天至第6天)暴露于Actimid 在第6天的影響。暴露于Actimid 的CD34+CD38—細(xì)胞在6天后分化為 CD34+CD38XD33+ 細(xì)胞。細(xì)胞用 CD33FITC 和 CD83PE 或 CD38PE 和 CD34PE 雙標(biāo)記。A 細(xì)胞用 DMSO處理，且對⑶34和⑶38標(biāo)記。B 細(xì)胞用DMSO處理，且對⑶83和⑶33標(biāo)記。C 細(xì)胞用Actimid 處理，且對⑶；34和⑶38標(biāo)記。D 細(xì)胞用處理。每張細(xì)胞圖上顯示的百分比表示表達(dá)特定重組標(biāo)記的細(xì)胞群體的百分比。詳見6. 6節(jié)。圖17.從培養(yǎng)的第0天至第6天Actimid 誘導(dǎo)⑶34+細(xì)胞來源的細(xì)胞群體的轉(zhuǎn)變。從第0天至第6天細(xì)胞在不同濃度Actimid 下培養(yǎng)，然后用⑶34和⑶38或⑶Ia和 ⑶14雙標(biāo)記。Actimid 在⑶34+0038_細(xì)胞中引起顯著的提高，在⑶Ia+⑶14_細(xì)胞中引起降低。詳見6. 6節(jié)。圖18.在不同時間用Actimid 處理的⑶34+細(xì)胞在第6天的表型改變。細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿培養(yǎng)6天。用Actimid 僅從第0天至第1天、僅第0天至第2天、僅第0天至第 3天、僅第0天至第4天、僅第0天至第5天或第0天至第6天處理細(xì)胞。對于少于6天的溫育，Actimid 在指示的那天洗去，且細(xì)胞重懸于DMSO中。在第6天，細(xì)胞用⑶34和⑶38 或CDla和CD14標(biāo)記。詳見6. 6節(jié)。圖19 (A-B).用單劑量或多劑量的Actimid 處理的⑶34+祖細(xì)胞在第6天的表型改變。圖19A 條件1 在第0天單劑量Actimid ；條件2 在第0天和第4天給藥Actimid ； 條件3 在第0天、第2天和第4天給藥Actimid 。Y軸表示表達(dá)特定標(biāo)記或重組標(biāo)記的細(xì)胞的百分比。圖19B 條件1 在第0天單劑量Actimid ;條件2 在第0天、第4天、第6天、 第8天給藥Actimid ；條件3 在第0天、第2天、第4天、第6天、第8天給藥Actimid 。 細(xì)胞由⑶Ilc和⑶15的表達(dá)而估定，其為粒細(xì)胞標(biāo)記。Y軸表示與Actimid 或DMSO(對照)接觸的⑶Ilc+⑶15_和⑶llc_CD15+細(xì)胞的百分比。詳見6. 6節(jié)。圖20 (A-F).從第1天至第12天暴露于ActimidTM(l μ Μ)的CD34+細(xì)胞產(chǎn)生的樹突細(xì)胞在第12天的流式細(xì)胞圖。與對照相比Actimid 在第12天引起⑶86和⑶80分子共刺激的降低。細(xì)胞用CDlaFITC和CD86PE抗體、CDlaFITC和CD80PE抗體或CDlaFITC和 ⑶14PE抗體雙標(biāo)記。A 細(xì)胞用DMSO處理，且在第12天對⑶86和⑶Ia染色。B 細(xì)胞用DMSO 處理，且在第12天對⑶80和⑶Ia染色。C 細(xì)胞用DMSO處理，且在第12天對⑶14和⑶Ia 染色。D 細(xì)胞用Actimid 處理，且在第12天對CD86和CDla染色。E 細(xì)胞用Actimid 處理，且在第12天對⑶80和⑶Ia染色。F 細(xì)胞用Actimid 處理，且在第12天對⑶14和 ⑶Ia染色。每張細(xì)胞圖上顯示的百分比表示表達(dá)特定重組標(biāo)記的細(xì)胞的百分比。詳見6. 6 節(jié)。圖21 (A-D).從第1天至第12天暴露于ActimicT(IyM)的CD34+細(xì)胞產(chǎn)生的樹突細(xì)胞在第12天的流式細(xì)胞圖。暴露于Actimid 導(dǎo)致CM4粘附分子表達(dá)的改變，相對于對照(與圖21D中次屏板E和F比較)，引起⑶54toight表達(dá)的降低和⑶Mdim表達(dá)的提高。A 細(xì)胞用DMSO處理，且用IgGl對HLADR染色。B 細(xì)胞用DMSO處理，且對⑶討和⑶40染色。C 細(xì)胞用Actimid 處理，且用IgGl對HLA-DR染色。D 細(xì)胞用Actimid 處理，且對CM4 和⑶40染色。每張細(xì)胞圖上顯示的百分比表示表達(dá)特定重組標(biāo)記的細(xì)胞的百分比。詳見 6. 6 節(jié)。圖22 (A-B). Actimid 促進(jìn)從CD34+祖細(xì)胞的粒細(xì)胞分化。在DMSO (圖22A)或 Actimid (圖22B)下生長12天，然后用粒細(xì)胞分子標(biāo)記⑶15的抗體標(biāo)記的⑶34+細(xì)胞的流式細(xì)胞圖。每張細(xì)胞圖上顯示的百分比表示表達(dá)特定重組標(biāo)記的細(xì)胞的百分比。詳見6. 6 節(jié)。圖23 (A-D). Actimid 并不誘導(dǎo) CDla+或 CD14+前體細(xì)胞的凋亡。CDla+CDlf 禾口 CDlaXDH+分離細(xì)胞(DC祖細(xì)胞)的流式細(xì)胞圖。CD34+祖細(xì)胞在SCF、FlOL, GMXSF和 TNF-α下經(jīng)過6天的培養(yǎng)。在第6天，通過磁性細(xì)胞分選器(Miltenyi)收集⑶la+CD14_* □)1&飛014+細(xì)胞，在存在61 ^ 和1順-0以及存在或不存在ActimicT(IyM)的條件下培養(yǎng)⑶Ia+⑶14_和⑶IaTDH+細(xì)胞群額外2天。凋亡細(xì)胞隨后用膜聯(lián)蛋白V-FITC，一種凋亡的標(biāo)記，染色，與碘化丙錠(PI)，一種活性探針，聯(lián)合使用。每張細(xì)胞圖上的百分比表示對膜聯(lián)蛋白V-FITC和/或碘化丙錠染色陽性的細(xì)胞的百分比。對膜聯(lián)蛋白V-FITC陽性的細(xì)胞數(shù)量與Actimid 處理的和對照的細(xì)胞(尤其與每張細(xì)胞圖中的B3和B4比較)作比較。 A 用DMSO處理的CDla+CDlf細(xì)胞。B 用Actimid 處理的CDla+CDlf細(xì)胞。C 用DMSO處理的CDlaTDH+細(xì)胞。D 用Actimid 處理的CDlaTDH+細(xì)胞。詳見6. 6節(jié)。圖M(A-D).在由Actimid 存在或缺乏下生長12天的CD34+細(xì)胞的流式細(xì)胞圖。 Actimid 引起甘露糖受體介導(dǎo)的胞飲作用的降低，其與DMSO對照比較，通過FITC標(biāo)記的右旋糖酐攝取的降低而得到證明。A :DMS0和40C ο B =ActimidTM ^P 4°C。C :DMS0和37°C。D ActimidTM和37°C。每張細(xì)胞圖上的百分比表示呈現(xiàn)胞飲作用的細(xì)胞分?jǐn)?shù)。詳見6. 6節(jié)。圖25 (A-D).培養(yǎng)12天的⑶34+細(xì)胞的流式細(xì)胞圖，且從第6天至第12天在存在或缺乏Actimid 下培養(yǎng)。在第1至5天Actimid 缺乏下培養(yǎng)后，在第6至12天Actimid 存在下培養(yǎng)，與DMSO對照相比，導(dǎo)致甘露糖受體介導(dǎo)的胞飲作用。每張細(xì)胞圖上的百分比表示呈現(xiàn)胞飲作用的細(xì)胞分?jǐn)?shù)。A:DMS0和4°C。B :ActimidTM和4°C。C:DMS0和37°C。D ActimidTM 和 37°C。詳見 6. 6 節(jié)。圖沈.Actimid 降低培養(yǎng)12天的⑶34+細(xì)胞呈遞抗原的能力。⑶34+細(xì)胞在存在或缺乏Actimid 下培養(yǎng)12天；Actimid 處理的細(xì)胞，在第12天，與DMSO對照比較顯示基本上降低的刺激作用指標(biāo)。圖27.對從第6天至第12天在Actimid 存在下培養(yǎng)的CDM+細(xì)胞，Actimid 具有抗原呈遞細(xì)胞(APC)減少的活性。⑶34+細(xì)胞在存在或缺乏Actimid 下培養(yǎng)5天。處理過的細(xì)胞的抗原呈遞能力與對照，DMSO處理的細(xì)胞作比較。詳見6. 6節(jié)。圖28.在GM-CSF和TNF- α存在下培養(yǎng)的⑶34+造血祖細(xì)胞的分化途徑。圖29.顯示以Actimid 對于在GM-CSF和TNF- α存在下培養(yǎng)的⑶；34+造血祖細(xì)胞的分化途徑的效果的總結(jié)圖表。詳見6. 6節(jié)。圖30.顯示鼠ka+LirT造血祖細(xì)胞成熟條件的圖表。細(xì)胞在存在干細(xì)胞因子(SCF)、Flt-3L、粒巨噬集落刺激因子(GM-CSF)和巨噬集落刺激因子(MCSF)及0. 1 % DMSO (對照)下生長9天，10 μ M Actimid 或10 μ M全反式視黃酸(ATRA)用以驅(qū)動細(xì)胞向 DC前體細(xì)胞表型分化。細(xì)胞隨后從第9天至第12天在GM-CSF和TNF- α存在下培養(yǎng)，加入DMS0、ACtimid 或ATRA，以驅(qū)動鼠細(xì)胞向未成熟的樹突細(xì)胞的分化。詳見6. 8節(jié)。圖31 (A-E).鼠細(xì)胞在普通培養(yǎng)條件下第9天出現(xiàn)(見實(shí)施例1，材料和方法，圖 30的描述)。細(xì)胞用CD80的抗體(圖31A)、CDll的抗體(圖31B)、CD32/16的抗體(圖 31C)、MHC II (I-Ab)的抗體(圖31D)、CD14的抗體(圖31E)或Gr-I的抗體(圖31F)標(biāo)記。細(xì)胞在第9天呈現(xiàn)出被⑶88、⑶11或⑶32/16分子標(biāo)記的抗體標(biāo)記上，被I-Ab分子標(biāo)記的抗體少許標(biāo)記上，未被⑶14或Gr-I分子標(biāo)記的抗體標(biāo)記上。詳見6.8節(jié)。圖32 (A-I).用DMS0、ACtimid 或ATRA處理的鼠細(xì)胞第12天的流式細(xì)胞圖。細(xì)胞用CD86和CDllb的抗體標(biāo)記。圖32A-32C (頂行)細(xì)胞圖顯示用DMSO (對照)、Actimid 或全反式視黃酸(ATRA)處理時表達(dá)⑶86 (Y-軸)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。圖32D-32F (中間行)在如頂行處理時，表達(dá)主要的組織相容性復(fù)合物II (MHC-II)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。圖32G-32I (底行)在如頂行處理時，表達(dá)⑶lib的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。詳見6. 8節(jié)。5.發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于意外的發(fā)現(xiàn)，即干細(xì)胞或祖細(xì)胞暴露于本發(fā)明的化合物致使產(chǎn)生一種控制干細(xì)胞或祖細(xì)胞向特定祖細(xì)胞群體分化或祖細(xì)胞向特定細(xì)胞類型，如樹突細(xì)胞、 粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞分化的可調(diào)控的方法。尤其是，干細(xì)胞或祖細(xì)胞暴露于本發(fā)明的化合物致使產(chǎn)生造血細(xì)胞特定群體，包括⑶；34+、⑶38+和⑶133+細(xì)胞的可調(diào)控的分化和增殖。這種分化的調(diào)控在沒有因細(xì)胞死亡或分化為不需要的細(xì)胞類型或細(xì)胞譜系而造成產(chǎn)量的顯著損失的情況下完成；換言之，本發(fā)明的化合物沒有引發(fā)一種或多種細(xì)胞群體的凋亡。進(jìn)一步地，造血祖細(xì)胞暴露于本發(fā)明的化合物導(dǎo)致特定細(xì)胞類型的可調(diào)控的分化和增殖。因此，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)人干細(xì)胞分化的方法，特別是⑶34+造血祖細(xì)胞和⑶133+ 祖細(xì)胞的分化。尤其是，本發(fā)明提供使用抑制TNF-α活性的小的有機(jī)分子調(diào)節(jié)祖細(xì)胞沿著特定細(xì)胞和組織譜系分化的方法。進(jìn)一步地，本發(fā)明包括增殖早期祖細(xì)胞，如人CD133+或 CD34+細(xì)胞，尤其是CD34+CD38_細(xì)胞，以移植入哺乳動物、鳥類或爬行動物中的方法，包括將造血祖細(xì)胞暴露于TNF_a抑制劑或拮抗劑，其中抑制劑或拮抗劑是小分子物質(zhì)。本發(fā)明還提供了從這些早期祖細(xì)胞產(chǎn)生其他類型細(xì)胞的方法，包括但不限于腦細(xì)胞、腎細(xì)胞、腸道細(xì)胞和肌肉細(xì)胞。本發(fā)明的化合物還對抑制從早期祖細(xì)胞，如人CD34+祖細(xì)胞的樹突細(xì)胞分化以及促進(jìn)粒細(xì)胞的分化起作用。與本發(fā)明相關(guān)地使用的小分子化合物的實(shí)例包括但不限于，抑制ΤΝΓα活性的化合物。在本發(fā)明的方法中使用的化合物在5. 3節(jié)詳細(xì)描述。在一個實(shí)施方案中，雖然也使用沙利度胺水解產(chǎn)物、代謝物和前體，優(yōu)選的化合物為沙利度胺類似物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物為 LniDsTM(Celgene)，如 Actimid 和 Revimid 。本發(fā)明的方法包括干細(xì)胞或祖細(xì)胞向特定細(xì)胞譜系分化的調(diào)控，包括但不限于間充質(zhì)的、造血的、生脂的、生肝的、生神經(jīng)的、成膠質(zhì)的、生軟骨的、生血管的、生肌的、生軟骨的或成骨的譜系，其包括優(yōu)選在體外將干細(xì)胞或祖細(xì)胞和本發(fā)明的化合物溫育足夠的一段時期，致使細(xì)胞向期望的細(xì)胞譜系的細(xì)胞分化。在一個具體的實(shí)施方案中，干細(xì)胞或祖細(xì)胞向造血譜系細(xì)胞的分化受到調(diào)節(jié)。具體地說，本發(fā)明的方法可用于以一種劑量相關(guān)的方式調(diào)節(jié)由⑶34+、⑶133+和⑶45+造血祖細(xì)胞生成血細(xì)胞集落的發(fā)生。本發(fā)明的方法還包括CD34+祖細(xì)胞向樹突細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)，其包括優(yōu)選在體外將祖細(xì)胞和本發(fā)明的化合物溫育足夠長的一段時期，致使細(xì)胞向期望的細(xì)胞譜系的細(xì)胞分化。在一個具體的實(shí)施方案中，該祖細(xì)胞向樹突細(xì)胞譜系細(xì)胞的分化通過將所述細(xì)胞接觸 Actimid 或Revimid 或其類似物或前藥而調(diào)節(jié)。在另一個具體的實(shí)施方案中，⑶34+祖細(xì)胞的分化得到調(diào)節(jié)以抑制沿著髓樣譜系的分化并支持沿著粒細(xì)胞譜系的分化。在一個更具體的實(shí)施方案中，CD34+祖細(xì)胞向粒細(xì)胞譜系細(xì)胞的分化通過包括將CD34+祖細(xì)胞和本發(fā)明的化合物在對祖細(xì)胞培養(yǎng)的第1天接觸的方法而調(diào)節(jié)。任何哺乳動物干細(xì)胞或祖細(xì)胞可以按照本發(fā)明的方法使用，包括但不限于，從臍帶血(“CB”細(xì)胞)、胎盤和其他來源分離的干細(xì)胞。干細(xì)胞可包括多能性細(xì)胞，即，具有完全的分化多樣性、能自我更新以及在組織中維持休眠或靜止的細(xì)胞。干細(xì)胞還可包括多潛能性細(xì)胞和定向祖細(xì)胞。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明利用活的、靜止的、多能性的干細(xì)胞，其存在于足期的胎盤中，可隨著導(dǎo)致多潛能性和多能性干細(xì)胞的回收的成功的分娩和胎盤娩出、放血和胎盤灌注而得以回收。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，祖細(xì)胞為早期祖細(xì)胞，尤其是CD34+或CD133+細(xì)胞。 優(yōu)選地，⑶34+或⑶133+祖細(xì)胞來源于人骨髓、胎盤或臍帶血。從其他哺乳動物來源的這些細(xì)胞的等效物也可使用。例如，在小鼠中，Sca+祖細(xì)胞可在本發(fā)明的方法中使用。從鳥類或爬行動物來源的等效的早期祖細(xì)胞也可使用。在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方案中，胎盤內(nèi)生性的或通過產(chǎn)后灌注胎盤產(chǎn)生的細(xì)胞，包括但不限于，胚胎樣干細(xì)胞、祖細(xì)胞、多能性細(xì)胞和多潛能性細(xì)胞，在分離的和灌注的胎盤中培養(yǎng)時暴露于本發(fā)明的化合物，且誘導(dǎo)分化。在產(chǎn)后灌注的胎盤中繁殖的內(nèi)生性細(xì)胞可以進(jìn)行回收，和/或生物活性分子可從灌注液、培養(yǎng)基或從胎盤細(xì)胞自身進(jìn)行回收。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，將源于除了后胎盤的其它來源的干細(xì)胞或祖細(xì)胞在體外培養(yǎng)時暴露于本發(fā)明的化合物并且進(jìn)行誘導(dǎo)分化。因此，本發(fā)明包括使哺乳動物干細(xì)胞分化為特定祖細(xì)胞的方法，其包括使干細(xì)胞在適于期望的分化的條件和/或培養(yǎng)基的情況下以及在本發(fā)明的化合物存在的情況下將干細(xì)胞進(jìn)行分化。進(jìn)一步地，本發(fā)明包括調(diào)節(jié)或調(diào)控特定祖細(xì)胞群體向特定細(xì)胞類型分化的方法， 其包括使所述祖細(xì)胞在適合所述分化的條件下以及在一種或多種本發(fā)明的化合物存在下進(jìn)行分化?？蛇x擇地，干細(xì)胞或祖細(xì)胞可暴露于本發(fā)明的化合物，隨后用合適的條件進(jìn)行分化。合適條件的實(shí)例包括用人血清和細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)補(bǔ)充的營養(yǎng)培養(yǎng)基制劑，如用生長因子補(bǔ)充的 MATRIGEL 。本發(fā)明的方法還涉及不同的細(xì)胞群體，其可通過用本發(fā)明的化合物在培養(yǎng)的不同時期，無論是增殖或分化期接觸祖細(xì)胞而產(chǎn)生。參見5. 4節(jié)，具體為下面的5. 4. 2節(jié)。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用酰胺和酰亞胺小分子，尤其是沙利度胺的氨基結(jié)合物來調(diào)節(jié)和調(diào)控在造血祖細(xì)胞移植前調(diào)節(jié)時期的血細(xì)胞生成的方法。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的小分子物質(zhì)來調(diào)節(jié)和調(diào)控在先體外后體內(nèi)造血祖細(xì)胞調(diào)節(jié)時期的血細(xì)胞生成的方法。本發(fā)明的方法包括干細(xì)胞或祖細(xì)胞體外分化的調(diào)控， 包括體外溫育化合物和干細(xì)胞或祖細(xì)胞，隨后向受治療者直接移植分化的細(xì)胞。本發(fā)明還包括通過將干細(xì)胞或祖細(xì)胞以及本發(fā)明的化合物給藥于其有需求的患者而在體內(nèi)對干細(xì)胞或祖細(xì)胞的控制和調(diào)控。本發(fā)明進(jìn)一步包括預(yù)處理的干細(xì)胞或祖細(xì)胞的移植以治療或預(yù)防疾病。在一個實(shí)施方案中，對需要移植的患者在移植前、移植中和/或移植后給藥以本發(fā)明的化合物。在另一個實(shí)施方案中，還對需要移植的患者給藥未經(jīng)處理的干細(xì)胞或祖細(xì)胞，例如臍帶血細(xì)胞、 成人血細(xì)胞、外周血細(xì)胞或骨髓細(xì)胞。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括對受治療者給藥以化合物，所述受治療者為未調(diào)節(jié)的干細(xì)胞或祖細(xì)胞的受體，以誘發(fā)出對已移植的干細(xì)胞的調(diào)節(jié)效應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括骨髓移植，其包括移植臍帶血(或從臍帶血獲得的干細(xì)胞)、外周(即，成體)血(或從外周血獲得的干細(xì)胞)，其中所述臍帶血或干細(xì)胞已用本發(fā)明的化合物預(yù)處理過。另外，本發(fā)明包括由在本發(fā)明的化合物存在下已分化的造血祖細(xì)胞制得的白細(xì)胞的用途。例如，通過分化造血祖細(xì)胞而產(chǎn)生的白細(xì)胞可用于移植或可在移植前與臍帶血或臍帶血干細(xì)胞混合。在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括骨髓移植，其包括按照本發(fā)明的方法獲得的早期祖細(xì)胞，如CD34+或CD133+祖細(xì)胞的移植，其中所述祖細(xì)胞已用本發(fā)明的化合物預(yù)處理過。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述樹突細(xì)胞的前體細(xì)胞為⑶34+⑶38_CD33+或 ⑶34+CD38TD33_前體細(xì)胞。進(jìn)一步地，本發(fā)明包括由已在本發(fā)明的化合物存在下分化的 CD34+祖細(xì)胞制得的細(xì)胞的用途。例如，通過CD34+祖細(xì)胞的分化而用本發(fā)明的化合物產(chǎn)生的CD34+CD38TD33+前體細(xì)胞、CD34+CD38XD33-前體細(xì)胞、粒細(xì)胞等，可用于移植中。用本發(fā)明的化合物從CD133+細(xì)胞分化來的細(xì)胞也為本發(fā)明所包括。本發(fā)明進(jìn)一步包括在深低溫保藏和融化后調(diào)節(jié)干細(xì)胞，以消除深低溫保藏和暴露于冷凍保藏劑對干細(xì)胞的有害影響的方法。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供跟隨深低溫保藏和融化的調(diào)節(jié)干細(xì)胞，以消除暴露于冷凍保藏劑(例如，DMS0)對干細(xì)胞的增殖和遷移能力的有害影響的方法。5. 1干細(xì)胞和⑶34+或⑶133+祖細(xì)胞的分化的調(diào)節(jié)5. 1.1 干細(xì)胞本發(fā)明提供調(diào)節(jié)人干細(xì)胞分化的方法。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括在體外干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化的調(diào)控，包括體外將干細(xì)胞與化合物一起溫育，隨后向受治療者直接移植分化的細(xì)胞。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括體內(nèi)干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化的調(diào)控，包括向未調(diào)節(jié)的干細(xì)胞受體的受治療者遞送化合物，隨后向受治療者直接給藥以化合物。通過本發(fā)明的方法獲得的胚胎樣干細(xì)胞可誘導(dǎo)向特定細(xì)胞譜系的分化，這些細(xì)胞譜系包括但不限于間充質(zhì)的、造血的、生脂的、生肝的、生神經(jīng)的、成膠質(zhì)的、生軟骨的、生血管的、生肌的、生軟骨的或成骨的譜系。在某些實(shí)施方案中，將按照本發(fā)明的方法獲得的胚胎樣干細(xì)胞誘導(dǎo)分化，以用于移植和先體外后體內(nèi)治療的方案中。在某些實(shí)施方案中，通過本發(fā)明的方法獲得的胚胎樣干細(xì)胞向特殊的細(xì)胞類型誘導(dǎo)分化，且受到遺傳操縱以提供基因治療的產(chǎn)品。在一個具體的實(shí)施方案中，通過本發(fā)明的方法獲得的胚胎樣干細(xì)胞在體外與誘導(dǎo)其分化的化合物如小的有機(jī)分子一起溫育，隨后向受治療者直接移植分化的細(xì)胞。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于控制和調(diào)控干細(xì)胞分化的化合物不是多肽、肽、蛋白、激素、細(xì)胞因子、寡核苷酸或核酸。按照本發(fā)明而使用的干細(xì)胞包括但不限于，臍帶血(CB)細(xì)胞、胎盤細(xì)胞、胚胎干 (ES)細(xì)胞、胚胎樣干細(xì)胞、滋養(yǎng)層干細(xì)胞、祖細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞及多潛能性、多能性和全能性細(xì)胞。尤其是，本發(fā)明的方法包括除間充質(zhì)干細(xì)胞外的干細(xì)胞群體向特定組織譜系分化的調(diào)控。例如，通過促進(jìn)特定肌肉骨骼的再生和修復(fù)、新血管的發(fā)生及特定肌肉組織，如心肌和骨骼肌，以及各種器官和組織的血運(yùn)重建，所述器官和組織包括但不限于腦、脊髓、肝、 肺、腎和胰臟，本發(fā)明的方法可用于調(diào)控多潛能性干細(xì)胞向生軟骨的、生血管的、生肌肉的和成骨譜系細(xì)胞的分化。本發(fā)明的方法可用于調(diào)控多潛能性干細(xì)胞向生脂、生軟骨、成骨、 生神經(jīng)或生肝的譜系的分化。用于調(diào)節(jié)分化的試劑可導(dǎo)入產(chǎn)后灌注的胎盤以誘導(dǎo)在胎盤中培養(yǎng)的細(xì)胞的分化。 選擇性地，該試劑可用于從胎盤中收集或移除細(xì)胞后在體外調(diào)節(jié)分化。本發(fā)明的方法包括祖細(xì)胞向造血譜系細(xì)胞分化的調(diào)控，包括在體外將祖細(xì)胞和化合物溫育足夠的一段時期，致使細(xì)胞向造血譜系的分化。尤其是，本發(fā)明的方法可用于以劑量相關(guān)方式調(diào)節(jié)由CD34+、CD133+和CD45+造血祖細(xì)胞生成血細(xì)胞集落的發(fā)生(關(guān)于劑量的討論，見5.7節(jié))。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法可用于特異性地抑制紅血細(xì)胞或紅細(xì)胞集落(BFU-E和 CFU-E)的生成，同時增加白細(xì)胞和血小板集落形成(CFU-GM)的生成以及提高總的集落形成單位的產(chǎn)量。本發(fā)明的方法不僅可用于調(diào)控干細(xì)胞的分化，還可刺激集落形成率，通過提高骨髓植入物的速度和白細(xì)胞和/或血小板產(chǎn)物的恢復(fù)而給造血干細(xì)胞移植提供顯著的益處。在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于調(diào)控例如神經(jīng)元前體細(xì)胞或神經(jīng)母細(xì)胞向特定的神經(jīng)細(xì)胞類型如感覺神經(jīng)元(例如，視覺細(xì)胞、嗅覺細(xì)胞、機(jī)械感應(yīng)神經(jīng)元、化學(xué)感應(yīng)神經(jīng)元等)、運(yùn)動神經(jīng)元、皮質(zhì)神經(jīng)元或中間神經(jīng)元的分化。在其它的實(shí)施方案中， 本發(fā)明的方法可用于調(diào)控包括但不限于膽堿能神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、Y-氨基丁酸能神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(包括少突膠質(zhì)細(xì)胞，其產(chǎn)生髓磷脂)和室管膜細(xì)胞(其排列于腦室系統(tǒng))細(xì)胞類型的分化。仍在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于調(diào)控為器官組分的細(xì)胞的分化，包括但不限于，心臟的普爾基涅細(xì)胞、肝的膽管上皮細(xì)胞、胰臟的β胰島細(xì)胞、 腎皮質(zhì)或髓細(xì)胞及眼睛的視覺感光細(xì)胞。按照本發(fā)明的方法獲得的干細(xì)胞分化狀態(tài)的評價可通過細(xì)胞表面標(biāo)記的存在而鑒定。例如，本發(fā)明的胚胎樣干細(xì)胞，可通過下面的細(xì)胞表面標(biāo)記0CT-4+和ABC-pt而區(qū)分。進(jìn)一步地,本發(fā)明包括具有下列標(biāo)記⑶10、⑶四、⑶44、⑶M、⑶90、SH2、SH3、SH4、0CT-4 和ABC-p或者如前所描述的缺乏下列細(xì)胞表面標(biāo)記⑶34、⑶38、⑶45、SSEA3和SSEA4的胚胎樣干細(xì)胞。這樣的細(xì)胞表面標(biāo)記可按照本領(lǐng)域熟知的方法常規(guī)測定，例如，通過流式細(xì)胞計數(shù)法，伴隨洗滌和用抗細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體染色。例如，為測定CD34或CD38的存在，細(xì)胞可在PBS中洗滌，然后用抗⑶34的藻藍(lán)蛋白和抗⑶38的異硫氰酸熒光素(Becton Dickinson, Mountain View, CA)雙染色。5. 1. 2 CD34+ 和 CD133+ 早期祖細(xì)胞本發(fā)明還提供調(diào)節(jié)人⑶34+或⑶133+細(xì)胞分化的方法。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括在體外干細(xì)胞或祖細(xì)胞的調(diào)控，包括體外溫育干細(xì)胞和化合物，隨后將分化的細(xì)胞直接移植入受治療者。通過本發(fā)明的方法獲得的祖細(xì)胞可沿著特定細(xì)胞譜系誘導(dǎo)分化，包括但不限于，對于CD34+祖細(xì)胞，沿著髓樣或粒細(xì)胞譜系，對于CD133+細(xì)胞，沿著內(nèi)皮或神經(jīng)細(xì)胞譜系。 在某些實(shí)施方案中，祖細(xì)胞被誘導(dǎo)分化以用于移植和先體外后體內(nèi)治療方案。在某些實(shí)施方案中，祖細(xì)胞向特殊的細(xì)胞類型誘導(dǎo)分化，且受到遺傳操縱以提供基因治療的產(chǎn)品。在具體的實(shí)施方案中，將祖細(xì)胞在體外與誘導(dǎo)其分化的化合物，如小的有機(jī)分子一起溫育，隨后向受治療者直接移植分化的細(xì)胞。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于控制和調(diào)控干細(xì)胞分化的化合物不是多肽、肽類、蛋白、激素、細(xì)胞因子、寡核苷酸或核酸。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，祖細(xì)胞促成向⑶34+⑶38TD33+或⑶34+⑶38XD33-祖細(xì)胞分化。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法可用于特異性地抑制紅血細(xì)胞或紅細(xì)胞集落(BFU-E和 CFU-E)的生成，同時增加白細(xì)胞和血小板集落形成(CFU-GM)的生成以及提高總的集落形成單位的產(chǎn)量。本發(fā)明的方法不僅可用于調(diào)控干細(xì)胞的分化，還可刺激集落形成率，通過提高骨髓植入物的速度和白細(xì)胞和/或血小板產(chǎn)物的恢復(fù)而給造血干細(xì)胞移植提供顯著的益處。在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于減少CD34+祖細(xì)胞向CDla+細(xì)胞，尤其是CD86+CDla+細(xì)胞的分化。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于減少或防止CD34+ 祖細(xì)胞向⑶14+CDla—細(xì)胞的分化。⑶14+⑶la—細(xì)胞為表皮樹突細(xì)胞或單核/巨噬祖細(xì)胞。 在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于減少在增殖的CD34+祖細(xì)胞上CD80和CD86共刺激分子的表達(dá)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于減少增殖的CD34+祖細(xì)胞向 CD54toight細(xì)胞的分化，且激勵向細(xì)胞的分化。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于增加CD133+細(xì)胞的數(shù)量，其為內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞。仍在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于減少增殖的⑶34+細(xì)胞向⑶llc_CD15+細(xì)胞的分化，且增加向⑶llc+CD15_細(xì)胞的分化，由此分化從髓樣樹突細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)變?yōu)榱＜?xì)胞譜系。按照本發(fā)明的方法獲得的干細(xì)胞分化狀態(tài)的評價可通過細(xì)胞表面標(biāo)記的存在而鑒定。例如，本發(fā)明的祖細(xì)胞，可通過⑶34+或⑶133+細(xì)胞表面標(biāo)記而區(qū)分。進(jìn)一步地，本發(fā)明包括擁有或顯示相對于對照高表達(dá)如前所描述的一種或多種下列標(biāo)記CD15、CD34、 ⑶33、⑶133或OTMdim的增殖的祖細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步包括缺乏或顯示相對于對照低表達(dá)一種或多種下列標(biāo)記HLA_DR、CDla, CDllc、CD38、CD80、CD86、CD54bright 或 CD14 的增殖的祖細(xì)胞。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的增殖的祖細(xì)胞呈現(xiàn)CD34+CD38_CD33+或 ⑶34+CD38TD33_。這樣的細(xì)胞表面標(biāo)記可按照本領(lǐng)域熟知的方法常規(guī)測定，例如，通過洗滌和用抗細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體染色，隨后經(jīng)過流式細(xì)胞計數(shù)法測定。例如，為測定CD34或 CD38的存在，細(xì)胞可在PBS中洗滌，然后用抗CD34的藻藍(lán)蛋白和抗CD38的異硫氰酸熒光素 (Becton Dickinson, Mountain View, CA)雙染色。在某些實(shí)施方案中，分化的細(xì)胞可通過鑒定分化的細(xì)胞吞噬能力而表征。例如，可通過用FITC標(biāo)記右旋糖酐及用已知的方法測定攝取量而評價已分化的或正在分化的細(xì)胞的吞噬作用。分化的或正分化的細(xì)胞刺激T細(xì)胞的能力可在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)中測定，其中假定的負(fù)載抗原的細(xì)胞與T細(xì)胞混合，然后測定T細(xì)胞的活性水平。5. 1.3細(xì)胞的鑒定和表征在某些實(shí)施方案中，已分化的細(xì)胞可通過表現(xiàn)差異表達(dá)的基因而鑒定(例如，表現(xiàn)未分化的祖細(xì)胞來源的基因庫與源于祖細(xì)胞的已分化的細(xì)胞的基因庫的差別)。例如， 核酸擴(kuò)增方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法(例如，體外轉(zhuǎn)錄(IVT))可用于展現(xiàn)在不同細(xì)胞群體中的基因表達(dá)，例如，通過使用多核苷酸微陣列。該用于展現(xiàn)差別基因表達(dá)的方法在本領(lǐng)域中是熟知的(見，例如，Wieland等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87 :2720-2724(1990) ；Lisitsyn 等，Science 259:946-951(1993) ；Lisitsyn 等 Meth. Enzymology 254 :291-304(1995)；美國專利號 5，436，142 ；美國專利號 5，501，964 ； Lisitsyn 等，Nature Genetics 6:57—63(1994) ；Hubank 禾口 Schatz，1994，Nucleic Acids Research 22 :5640-5648 ；Zeng ^,1994, Nucleic Acids Research 22 :4381-4385 ； _ 國專利號5，525，471 ；Linsley等，美國專利號6，271，002，題為“RNA擴(kuò)增方法”，公開于 2001-08-07 ；Van Gelder等，美國專利號5，716，785，題為“使用啟動子進(jìn)行基因操作的過程，，，公開于 1998-02-10 ；Stoflet 等，Science 239 :491-494,1988 ；Sarkarand Sommer, 1989，Science 244 :331-334 ；Mullis 等，美國專利號 4，683，195 ；Malek 等，美國專利號 5，130，238 ；Kacian 和 Fultz,美國專利號 5，399，491 ；Burg 等，美國專利號 5，437，990 ； R. N Van Gelder 等，(1990)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87，1663 ；D. J. Lockhart 等，1996， Nature Biotechnol. 14，1675 ；Shannon 美國專利號 6，132，997 ；Lindemann 等，美國專利號 6，235，503，題為“削減雜交和差異分析的方法”，公開于2001-05-22)。商業(yè)上現(xiàn)有的試劑盒對于基因展現(xiàn)是有用的，例如，展示PROFILE 系列試劑盒 (Qbiogene, Carlsbad, CA)，其使用基于凝膠的處理方法來展現(xiàn)基因表達(dá)。該試劑盒利用限制性片段差異顯示PCR(RFDD-PCR)在真核細(xì)胞內(nèi)比較基因表達(dá)模式。PCR-選擇性削減試劑盒(Clontech)和PCR-選擇性差示篩選試劑盒(Clontech)也可使用，其允許削減文庫中差異表達(dá)克隆的鑒定。在用POT選擇性削減試劑盒產(chǎn)生差異表達(dá)基因庫后，POT選擇性差示篩選試劑盒得到使用。用直接由檢測和驅(qū)動子集群合成的探針與削減文庫與雜交，一種產(chǎn)自削減cDNA的探針，以及一種制自反向削減cDNA(反向進(jìn)行的第二次削減)的探針。與檢測子而不是驅(qū)動子探針雜交的克隆得到差異表達(dá)；然而，未削減的探針對于檢測微量信息不夠靈敏。削減的探針為差異表達(dá)cDNA而得到大量富集，但可能給出假陽性的結(jié)果。按照制造商的(Clontech)指導(dǎo)使用削減的和未削減的探針來鑒定差異表達(dá)基因。在另一個實(shí)施方案中，分化的干細(xì)胞或祖細(xì)胞通過集落形成單位測定法而得到鑒定和表征，其在本領(lǐng)域中是通常所知的，例如Mesen Cult 培養(yǎng)基(干細(xì)胞技術(shù)，Inc., Vancouver British Columbia)。干細(xì)胞或祖細(xì)胞已分化為特殊的細(xì)胞類型的測定可通過本領(lǐng)域熟知的方法完成， 例如，使用如流式細(xì)胞計數(shù)法或免疫細(xì)胞化學(xué)(如，用組織特異性或細(xì)胞標(biāo)記特異性抗體對細(xì)胞染色)測量形態(tài)學(xué)上的和細(xì)胞表面標(biāo)記的變化，通過用光學(xué)或共聚焦顯微鏡對細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查，或使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，如PCR和基因表達(dá)展示，測量基因表達(dá)的變化。5. 2干細(xì)胞和祖細(xì)胞群體本發(fā)明提供調(diào)節(jié)人干細(xì)胞分化的方法。任何哺乳動物干細(xì)胞可在本發(fā)明的方法中使用，包括但不限于，分離自臍帶血(CB細(xì)胞)、外周血、成體血、骨髓、胎盤、間充質(zhì)干細(xì)胞及其他來源的干細(xì)胞。在非優(yōu)選的實(shí)施方案中，干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞或已從非胎盤的來源分離的細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞的來源包括骨髓、胚胎卵黃囊、胎盤、臍帶、胎兒和青少年皮膚和血液。例如，骨髓細(xì)胞可從髂骨嵴、腿節(jié)、脛節(jié)、肋骨或其他髓的空腔獲得。按照本發(fā)明的方法使用的干細(xì)胞可包括多能性細(xì)胞，S卩，具有完全的分化多樣性、能自我更新以及在組織中維持休眠或靜止的細(xì)胞。干細(xì)胞還可包括多潛能性細(xì)胞、定向祖細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的干細(xì)胞為從足期的放血灌注的胎盤分離的活的、靜止的、多能性的干細(xì)胞。干細(xì)胞群體可以由通過商業(yè)服務(wù)獲得的胎盤干細(xì)胞而組成，例如LifeBank美國(Cedar Knolls, NJ)、ViaCord(Boston ΜΑ)、Cord Blood Registry (San Bruno, CA)禾口 Cryocell (Clearwater, FL)。干細(xì)胞群體還包括按照美國申請，
發(fā)明者D·I·斯蒂爾林, K·W·H·陳, L·A·穆托-德帕塞瓦爾, R·J·哈里里 申請人:細(xì)胞基因公司