專利名稱：一種檢測人類腸道病毒71型的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用納米金顆粒檢測人類腸道病毒71型DNA或RNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
對基因(DNA)及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(RNA)的高靈敏性、高特異性、簡單、快速的檢測，對于疾病的早期診斷和治療以及在在衛(wèi)生防疫、環(huán)境監(jiān)測、檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域都具有十分重要的意義。以往在這方面較為準(zhǔn)確靈敏的檢測方法有熒光標(biāo)記法、放射性標(biāo)記等方法，這些方法都需要復(fù)雜的操作和特殊的設(shè)備，應(yīng)用范圍很窄。1993年P(guān)E公司的Dr. Kary B. Mullis 發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR。隨后PCR技術(shù)大規(guī)模的應(yīng)用于生物科研和臨床治療中，對DNA的檢測進(jìn)入了新的時(shí)代，Dr. Mullis為此還獲得了 1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。雖然PCR方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確性高、操作較簡單等優(yōu)點(diǎn)，但由于其反應(yīng)進(jìn)行和產(chǎn)品DNA的檢測需要特殊的儀器，PCR技術(shù)的使用一直被限定在專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)院里。2001年日本榮研化學(xué)株式會社研制出了一種新型DNA擴(kuò)增方式，環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)可以在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)DNA的高效快速擴(kuò)增，該方法反應(yīng)條件簡單，DNA擴(kuò)增效率高，因此在核酸檢測方面具有明顯優(yōu)勢。但是對LAMP擴(kuò)增制備的DNA產(chǎn)物使用常規(guī)的檢測方法，如電泳法，熒光染料法等，均無法排除LAMP擴(kuò)增所帶來的假陽性問題，而且需要特殊的儀器，因此限制了 LAMP技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。人類腸道病毒71型(英文名為Human enterovirus 71)，簡稱EV71，于1969年首次從美國加利福尼亞州患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標(biāo)本中分離出來。腸病毒在病毒學(xué)上的分類是屬于微小病毒科(Picornaviridae)中的腸病毒群(enterovirus)。EV 71為目前腸病毒群中最晚發(fā)現(xiàn)的病毒，其感染性強(qiáng)且致病率高，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)方面的并發(fā)癥。 EV71主要引起手足口病，還可引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。手足口病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染是EV71感染而引起的兩大常見臨床癥狀。目前針對人類腸道病毒71型缺乏簡單、快速、便于使用和成本低廉的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種用納米金顆粒檢測人類腸道病毒71型專有的基因片段經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，從而判定人類腸道病毒71型的存在與否。本發(fā)明采用如下采用下述技術(shù)方案來解決上述問題本發(fā)明試劑盒包括兩部分 (1)標(biāo)記有可以識別人類腸道病毒71型特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴(kuò)增待檢測樣品中的人類腸道病毒71型DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴(kuò)增待檢測樣品中的人類腸道病毒71型RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。本發(fā)明中，試劑盒的工作原理為1.納米金顆粒標(biāo)記有能識別人類腸道病毒71型特定序列的分子探針，分子探針被固定在納米金顆粒的表面。2.待檢測樣品中的人類腸道病毒71型DNA分子或人類腸道病毒71型RNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)大量復(fù)制或先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過程后大量復(fù)制，人類腸道病毒71型的目標(biāo)片段被放大IO9倍，產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物DNA具有多重重復(fù)序列。3.混合納米金顆粒和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系，人類腸道病毒71型經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)以后的產(chǎn)物DNA與納米金顆粒上能識別人類腸道病毒71型特定序列的分子探針雜交。4.納米金顆粒沿環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA分子鏈形成聚集體(如附圖所示)，進(jìn)而引發(fā)納米金顆粒聚集處(例如溶液中、固體表面等)的顏色變化，依據(jù)顏色變化可以判斷待測樣品是否具有人類腸道病毒71型DNA或RNA。本發(fā)明中，納米金顆粒探針包括兩個(gè)部分，一是納米尺度的金顆粒，另一部分是固定在納米金顆粒表面的分子探針，該探針可以識別人類腸道病毒71型的特定序列。本發(fā)明中，待檢測樣品中環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增對象可以是人類腸道病毒71型DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。本發(fā)明中，納米金顆粒探針和人類腸道病毒71型環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物 DNA雜交可以和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)在相同反應(yīng)條件下、相同反應(yīng)容器中同時(shí)進(jìn)行。本發(fā)明中，納米金顆粒探針和人類腸道病毒71型環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物 DNA雜交可以發(fā)生在溶液中或者固體表面。本發(fā)明中，納米金顆粒探針與人類腸道病毒71型環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物 DNA雜交引發(fā)溶液或固體表面顏色改變，這種變化可由肉眼直接判斷，也可利用分光光度計(jì)等光學(xué)儀器檢測。本發(fā)明中，分子探針是指可以識別人類腸道病毒71型環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA的功能分子，這些分子包括DNA，RNA, PNA，蛋白質(zhì)，化學(xué)分子。本發(fā)明中，相同反應(yīng)條件包括但不限于溶液組成，成分濃度，PH值，溫度，反應(yīng)時(shí)間等。本發(fā)明的優(yōu)勢本發(fā)明試劑盒結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)和生物納米技術(shù)，提高生物分子檢測的靈敏度，是一種操作簡單、快速、準(zhǔn)確、成本低廉、不需要專業(yè)儀器設(shè)備的方法，可以廣泛應(yīng)用于家庭診斷、臨床診斷、傳染病控制、環(huán)境監(jiān)測、檢驗(yàn)檢疫，生物技術(shù)等領(lǐng)域的高靈敏度的人類腸道病毒71型檢測。


圖1為標(biāo)記有分子探針的納米金顆粒與人類腸道病毒71型經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)以后的產(chǎn)物DNA雜交示意圖，納米金顆粒沿人類腸道病毒71型環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA分子鏈形成聚集體。
具體實(shí)施例本發(fā)明試劑盒包括2管溶液，一管中是標(biāo)記有可以識別人類腸道病毒71型特定序列的分子探針的納米金顆粒溶液50 μ 1，一管中是250 μ 1可以擴(kuò)增待檢測樣品中的人類腸道病毒71型DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴(kuò)增待檢測樣品中的人類腸道病毒71型RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。納米金顆粒溶液中含有直徑為20 nm的納米金顆粒，濃度為1.2 nM，納米金顆粒表面標(biāo)記有巰基修飾的DNA探針。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系成分如下0. 2 口皿？3和83引物，1.6 μ M FIP和BIP 引物，0.4 Mbetaine (Sigma - Aldrich, St. Louis, MO), 10 mM MgS04, 1. 4 mM dNTPs, IX ThermoPol reaction buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA), 80 U Bst DNA polymerase (New England Biolabs), 6. 25 U AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)。巰基修飾的DNA探針序列
5’-CTCAGATTCTGACGCTAAAAAAAA-SH-3’ 。人類腸道病毒71型的F3引物序列 5’-GTGATCGAGTGGCGCAATT-3’ 。人類腸道病毒71型的B3引物序列 5’-TCCACCACCATCCCTTGG-3’ 。人類腸道病毒71型的FIP引物序列
5’-AAGGCCATTCGCCATAACCGAAACTCCACTATCACCACGCA-3'。人類腸道病毒71型的BIP引物序列
5’-GGATAAACCAACGCGCCCGGCTCCCACAATTTGGTGTCCA-3’ 。操作過程如下1.向裝有環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系的管中加入10 μ 提取的核酸或者混合樣品。2.將裝有混合物的管放入60° C的水浴中30分鐘。3.再向步驟2中的管中加入納米金顆粒溶液，此時(shí)混合后的溶液為紅色。4. 60° C水浴反應(yīng)15分鐘。觀察反應(yīng)后管中溶液的顏色，溶液保持紅色不變則不含有人類腸道病毒71型感染特異性RNA或人類腸道病毒71型DNA ；如果溶液變?yōu)闇\紫色，則判定樣本中含有人類腸道病毒71型感染特異性的RNA或人類腸道病毒71型DNA。
權(quán)利要求
1.一種用納米金顆粒檢測人類腸道病毒71型經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物 DNA的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括以下部分(1)標(biāo)記有可以識別人類腸道病毒71型特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴(kuò)增待檢測樣品中的人類腸道病毒71型DNA 或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴(kuò)增待檢測樣品中的人類腸道病毒71型RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，該試劑盒的工作原理為(1)用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增待檢測樣品中的人類腸道病毒71型DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增待檢測樣品中的人類腸道病毒71型RNA ； (2)納米金顆粒探針與環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交；(3)雜交引發(fā)納米金顆粒聚集，導(dǎo)致納米金顆粒聚集處顏色改變，以此判斷待檢測樣品是否含有人類腸道病毒71型DNA或RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，納米金顆粒探針包括兩個(gè)部分，一是納米尺度的金顆粒，另一部分是固定在納米金顆粒表面的分子探針，該探針可以識別人類腸道病毒71型的特定序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2，待檢測樣品中環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增對象可以是人類腸道病毒71型DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針和人類腸道病毒71型環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交可以和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)在相同反應(yīng)條件下、相同反應(yīng)容器中同時(shí)進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針和人類腸道病毒71型環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交可以發(fā)生在溶液中或者固體表面。
7.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針與人類腸道病毒71型環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交引發(fā)溶液或固體表面顏色改變，這種變化可由肉眼直接判斷，也可利用分光光度計(jì)等光學(xué)儀器檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求3，分子探針是指可以識別人類腸道病毒71型環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA的功能分子，這些分子包括DNA，RNA, PNA，蛋白質(zhì)，化學(xué)分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求4，相同反應(yīng)條件包括但不限于溶液組成，成分濃度，PH值，溫度，反應(yīng)時(shí)間等。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用納米金顆粒檢測人類腸道病毒71型DNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)和生物納米技術(shù)，提高生物分子檢測的靈敏度，是一種操作簡單、快速、準(zhǔn)確、不需要專業(yè)儀器設(shè)備的方法，可以廣泛應(yīng)用于家庭診斷、臨床診斷、傳染病控制、環(huán)境監(jiān)測、檢驗(yàn)檢疫，生物技術(shù)等領(lǐng)域的高靈敏度的人類腸道病毒71型檢測。本發(fā)明試劑盒包括兩部分(1)標(biāo)記有可以識別人類腸道病毒71型特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴(kuò)增待檢測樣品中的人類腸道病毒71型DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴(kuò)增待檢測樣品中的人類腸道病毒71型RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。
文檔編號C12Q1/68GK102230026SQ20111015579
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者孫國明 申請人:天津朝?？萍加邢薰?br>