專利名稱：測(cè)定表皮生長(zhǎng)因子受體和HER2-neu的基因表達(dá)及其水平與存活率之間相關(guān)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有效用于醫(yī)學(xué)，特別是癌癥化療中的預(yù)測(cè)方法。更特別是，本發(fā)明涉及通過(guò)分析腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)而評(píng)估患者的存活能力。此外，腫瘤細(xì)胞對(duì)受體酪氨酸激酶定向化療方案的敏感性是通過(guò)檢測(cè)人EGFR和HER2-neu基因的mRNA表達(dá)而測(cè)定的。
背景技術(shù)：
在西方國(guó)家，不論男性還是女性，肺癌都是與癌癥有關(guān)的死亡的主要原因。在美國(guó)，每年都會(huì)診斷出大約171，000個(gè)肺癌新發(fā)病例，并有160，000例死于這種疾病。在過(guò)去的二十年中，盡管對(duì)肺癌的檢測(cè)和治療已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但總體5年存活仍低于 15 %。Ginsberg 等，In :DeVita 等，Cancer :PrincipIesinPracticeofOncoIory, Ed. 5, pp. 858-910。Philadelphia =Lipincott-RavenPublishers, 1997。為了進(jìn)一步提高非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的存活率，以分子改變?yōu)榛A(chǔ)對(duì)它們進(jìn)行預(yù)后分類是十分重要的。這種分類將提供更準(zhǔn)確和更有效的診斷工具，且最終提供更有效的治療選擇。當(dāng)正常細(xì)胞經(jīng)歷致癌性轉(zhuǎn)化并成為惡性細(xì)胞時(shí)癌癥發(fā)生。轉(zhuǎn)化的(惡性)細(xì)胞逃離可規(guī)定細(xì)胞表型并抑制細(xì)胞增殖的正常生理控制。個(gè)體機(jī)體中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞因此增殖，形成腫瘤。當(dāng)發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)，臨床目標(biāo)是選擇性地破壞惡性細(xì)胞，同時(shí)減輕在個(gè)體進(jìn)行治療過(guò)程中對(duì)正常細(xì)胞的任何損害?；煼桨甘且运幬锏氖褂脼榛A(chǔ)的，所述藥物對(duì)癌細(xì)胞是選擇毒性(細(xì)胞毒性)的。人們已經(jīng)研制出了很多類化療藥物，包括干擾核酸合成，蛋白合成，及其它重要代謝過(guò)程的藥物。這些通常被稱作抗代謝藥物。其它類的化療藥物是損害細(xì)胞的DNA。 這些類藥物通常被稱作是基因毒性的。此外，還有一類化療劑可通過(guò)細(xì)胞中的受體酪氨酸激酶(RTKs)特異性地抑制促有絲分裂信號(hào)，其中，所述細(xì)胞中的RTKs是活性過(guò)度的。 (DrugsoftheFuture,1992，17，119)。然而，個(gè)體腫瘤對(duì)預(yù)期化療藥物或藥物聯(lián)合的敏感性常常只能在治療的試驗(yàn)期之后才能準(zhǔn)確地測(cè)定。在不成功試驗(yàn)期投入的時(shí)間會(huì)在臨床處理侵入性惡性腫瘤時(shí)造成重大的危險(xiǎn)。因此，評(píng)估由特異性化療劑導(dǎo)向的遺傳決定因子的表達(dá)狀態(tài)十分重要。例如，如果腫瘤表達(dá)高水平的DNA修復(fù)基因，那么很可能腫瘤對(duì)低劑量的損傷DNA的基因毒物沒(méi)有反應(yīng)。因此，腫瘤遺傳決定因子的表達(dá)狀態(tài)將幫助臨床醫(yī)師研制出一種適當(dāng)?shù)幕煼桨?，該化療方案?duì)腫瘤的所有遺傳組成部分都是特異性的。受體酪氨酸激酶(RTKs)在促有絲分裂信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中至關(guān)重要。相對(duì)于生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)而言，RTKs是大跨膜蛋白，它具有一個(gè)胞外配體結(jié)合域和一個(gè)胞內(nèi)部分，其作為胞質(zhì)蛋白上磷酸化酪氨酸殘基的激酶發(fā)揮作用，由此介導(dǎo)細(xì)胞增殖。已知各類受體酪氨酸激酶是以結(jié)合不同受體酪氨酸激酶的生長(zhǎng)因子家族為基礎(chǔ)的。(Wilks， AdvancesinCancerResearch,1993,60,43-73)。I類激酶，如受體酪氨酸激酶的EGF-R家族包括EGF，HER2_neu，erbB, Xmrk, DER 和let23受體。這些受體經(jīng)常存在于常見(jiàn)的人類癌癥，如乳腺癌(Sainsbury等，Brit. J. Cancer, 1988,58,458 ；Guerin 等，OncogeneRes.，1988,3,21)，肺鱗狀細(xì)胞癌(Hendler 等，CancerCells，1989，7，347)，膀胱癌(Neal 等，Lancet，1985，366)，食道癌(Mukaida 等， Cancer, 1991,68,142)，胃腸癌如結(jié)腸癌，直腸癌或胃癌(Bolen 等，OncogeneRes.，1987，1， 149)，白血病(Konaka等，Cell，1984，37，1035)和卵巢癌，支氣管癌或胰腺癌(歐洲專利 EP0400586)中。隨著進(jìn)一步試驗(yàn)人腫瘤組織受體酪氨酸激酶的EGF家族，預(yù)計(jì)它的廣泛流行是建立在其它癌癥，如甲狀腺癌和子宮癌的基礎(chǔ)之上的。具體而言，在正常細(xì)胞中很少能夠檢測(cè)到EGFR酪氨酸激酶的活性，但經(jīng)常在惡性細(xì)胞中檢測(cè)到(Hunter, Cell，1987，50，823)。近來(lái)已經(jīng)表現(xiàn)出EGFR在很多人類癌癥，如腦，肺鱗狀細(xì)胞，膀胱，胃，乳腺，頭頸部，食道，婦科和甲狀腺腫瘤中過(guò)量表達(dá)。(WJGullick， Brit.Med.Bull.，1991，47，87)。受體酪氨酸激酶在其它細(xì)胞增殖性疾病，如牛皮癬中也很重要。EGFR疾病的特征在于由通常不表達(dá)EGFR的細(xì)胞表達(dá)EGFR，或會(huì)導(dǎo)致有害細(xì)胞增殖的EGFR激活的增加，和/或不適當(dāng)EGFR水平的存在。已知EGFR可被它的配體EGF及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α (TGF-α)激活。HER2-neu蛋白也是I類受體酪氨酸激酶(RTK)家族的成員之一。Yarden和 Ullrich, Annu. Rev. Biochem. 57 :443,1988 ；Ullrich 和 Schlessinger, Cell61 :203,1990。 HER2-neu 蛋白與 EGFR在結(jié)構(gòu)上相關(guān)。Carraway 等，Ce 1178 :5，1994 ；Carraway 等，J. Biol. Chem. 269 :1430. 3，1994。這些受體共有一個(gè)共同的分子結(jié)構(gòu)，且在它們的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有兩個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)和結(jié)構(gòu)上相關(guān)的酶區(qū)。HER2-neu蛋白的配體依賴性激活是由neu活化因子(NAF)介導(dǎo)的，其可直接結(jié)合 pl65(HER2-neu)并刺激酶活性。Dougall 等，0ncogene9 :2109,1994 ；Samata等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA91 :1711,1994。HER2_neu蛋白的配體非依賴性同型二聚和導(dǎo)致的受體激活都是通過(guò)HER2-neU蛋白的過(guò)量表達(dá)促進(jìn)的。激活的HER2-neU復(fù)合物可起磷酸激酶的作用， 并使不同的胞質(zhì)蛋白磷酸化。HER2-neu疾病的特征在于HER2-neu的不適當(dāng)活性或過(guò)度活性增加了 HER2-neu的表達(dá)，導(dǎo)致有害的細(xì)胞增殖，如癌癥。受體酪氨酸激酶EGFR和HER2_neU的抑制劑可作為哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞生長(zhǎng)的選擇性抑制劑使用(Yaish等，Science, 1988，242,933)。例如，erbstatin，一種EGF受體酪氨酸激酶抑制劑，在被注射到無(wú)胸腺裸鼠中后，可降低表達(dá)人乳腺癌細(xì)胞的EGFR的生長(zhǎng)，但對(duì)不表達(dá)EGFR的腫瘤的生長(zhǎng)沒(méi)有作用(Toi等，Eur. J. CancerClin. Oncol.，1990，洸，722)。各種苯乙烯衍生物也具有酪氨酸激酶抑制性(歐洲專利申請(qǐng)EP0211363，0304493和0322738)， 并可用作抗腫瘤劑。這種苯乙烯衍生物有兩種屬于I類RTK抑制劑，它們的有效性已經(jīng)通過(guò)注射到裸鼠中后，減弱了人鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)得以證實(shí)Woneda等，CancerResearch, 1991，51，4430)。從歐洲專利申請(qǐng)EP0520722和0566226可知，某些4-苯胺基喹唑啉衍生物也可用作受體酪氨酸激酶的抑制劑。這些化合物所表現(xiàn)出來(lái)的非常緊密的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系顯示出一種清楚確定的結(jié)合模式，喹唑啉環(huán)在腺嘌呤袋中結(jié)合，苯胺基環(huán)在相鄰的獨(dú)特親脂性袋中結(jié)合。有3種4-苯胺基喹唑啉類似物(兩種可逆的和一種不可逆的抑制劑)已經(jīng)在臨床上被確定為抗癌藥物。Denny, Farmaco200IJan-Feb ；56 (1-2) :51_6。近來(lái)，U. S. FDA 已經(jīng)批準(zhǔn)使用單克隆抗體trastazumab ( Herceptin )治療HER2-neu過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌。kheurle 等，AnticancerRes20 :2091-2096, 2000。因?yàn)閷?duì)腫瘤進(jìn)行有效的化療通常需要聯(lián)合給藥，而對(duì)每種單一藥物的敏感性或抗性決定因素的鑒定和測(cè)量成為設(shè)計(jì)個(gè)體聯(lián)合化療的重要工具。研究沒(méi)能成功試驗(yàn)出癌癥患者惡性細(xì)胞中EGFR和/或HER2-neU表達(dá)的相對(duì)水平與存活力之間的確實(shí)相互關(guān)聯(lián)。迄今為止，EGFR及其在NSCLC中的預(yù)后重要性仍然有爭(zhēng)議。利用結(jié)合測(cè)定法進(jìn)行的研究把EGFR表達(dá)的增加與晚期NSCLC和總體存活的縮短聯(lián)系了起來(lái)，而利用半定量技術(shù)測(cè)量EGFRmRNA或蛋白表達(dá)的研究沒(méi)能顯示出與臨床結(jié)果一致的相互關(guān)聯(lián)。Veale等， Br. J. Cancer68 :162-165,1993 ；Fujino 等，Eur. Cancer32 :2070-2074,1996 ；Rusch 等， CancerRes53 :2379-2385,1993 ；Pfeiffer 等，BrJCancer74 :86-91,1996 ；Pastorino 等， JClin0ncoll5 =2858-2865,19970利用免疫組織化學(xué)法對(duì)NSCLC腫瘤中EGFR表達(dá)進(jìn)行的研究顯示，在NSCLC腫瘤中，EGFR過(guò)量表達(dá)的頻率為32%-47%。Veale等，Br. J. Cancer 55 :513-516,1987 ；Veale 等，Br. J. Cancer68 162-165，1993 ；Fujino 等，Eur. Cancer32 2070-2074，1996 ；Rusch 等，CancerRes53 :2379-2385,1993 ；Pastorino 等，J. Clin. One. 15 2858-2865,1997 ；Tateishi 等，EurJCancer27 1372-75，1991 ；Rachwal 等，BrJCancer72 56-64,1995 ；Rusch 等，CancerResl5 :2379-85,1993 ；Pfeiffer 等，BrJCancer78 :96-9, 1998 ；Ohsaki等，OncolP印7 :603_7，2000。此外，已經(jīng)報(bào)道過(guò)組織學(xué)亞型之間EGFR表達(dá)的顯著性差異，通常與AC和LC相比，SCC中EGFR表達(dá)水平更高。Fujino等，Eur. Cancer 32: 2070-2074，1996 ；Veale 等，Br. J. Cancer55 :513-516,1987 ；Pastorino 等，J. Clin. One. 15 2858-2865，1997 ；Pfeiffer 等，BrJCancer78 :96-9,1998 ；Ohsaki 等，Oncol. Rep. & :603_7， 2000。然而，這些研究報(bào)道EGFR的過(guò)量表達(dá)與肺癌患者存活之間不存在一致的相互關(guān)聯(lián)。有關(guān)EGFR過(guò)量表達(dá)與患者存活降低之間假定相互關(guān)聯(lián)的觀察是在某些不確定的研究中進(jìn)行的。Veale等，1987 ;0hsaki等，2000。然而，Veale等，分析了僅有19名NSCLC 患者的群體。Ohsaki等，把EGFR蛋白的表達(dá)與p53過(guò)量表達(dá)的NSCLC患者中的較差預(yù)后相互關(guān)聯(lián)起來(lái)(P = 0. 024)。與EGFR —樣，HER2-neu及其在NSCLC中的預(yù)后重要性迄今還有爭(zhēng)論。HER2_neu 蛋白的過(guò)量表達(dá)已經(jīng)在NSCLC，包括鱗狀細(xì)胞癌，腺癌，和大細(xì)胞癌中得到證實(shí)。Veale等， 1987 ；Schneider 等，CancerRes49 :4968-4971，1989 ；Kern 等，CancerRes. 50 :5184-5191, 1990 ；Weiner 等，CancerRes50 :421-425,1990 ；Scheurle 等，AnticancerRes.20 2091-2096,2000。利用蛋白測(cè)定法進(jìn)行的早期研究報(bào)道了 HER2_neU蛋白的過(guò)量表達(dá)與肺腺癌(AC)較低總體存活之間的相互關(guān)聯(lián)。Kern等，CancerRes50 :5184-5191,1990 ；Kern 等，JClinInvest93 :516_20，1994。然而，與之相矛盾的研究則報(bào)道HER2_neu蛋白的過(guò)量表達(dá)與肺腺癌(AC)的較低總體存活之間沒(méi)有關(guān)聯(lián)。Pfeiffer等，Br. J. Cancer74 =86-91, 1996。另一個(gè)重要問(wèn)題是評(píng)估作為癌癥預(yù)后因素的HER2-neu和EGFR共-過(guò)量表達(dá)之間的相互關(guān)系。Tateishi 等，(Eur. J. Cancer27 1372-75，1991)，測(cè)量了 EGFR 和 HER2_neu 蛋白的共表達(dá)，在13%的AC中進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這兩種基因的共-過(guò)量表達(dá)與較低的5年存活有關(guān)。然而，與單獨(dú)的HER2-neu過(guò)量表達(dá)一樣，HER2-neu和EGFR的共表達(dá)與肺鱗狀細(xì)胞癌(SCC)和肺大細(xì)胞癌(LCC)之間的相互關(guān)聯(lián)還沒(méi)有報(bào)道。測(cè)定EGFR和HER2_neU表達(dá)水平的非一致方法是問(wèn)題的根本，測(cè)定這些基因表達(dá)至何種程度可用于預(yù)測(cè)癌癥患者的存活能力。迄今，對(duì)NSCLC中HER2-neu和EGFR表達(dá)的研究顯示出NSCLC腫瘤對(duì)EGFR和HER2-neu表達(dá)呈陽(yáng)性的頻率存在著巨大的變化。被定義為陽(yáng)性蛋白染色的HER2-neu過(guò)量表達(dá)在腺癌(AC)中為13-80%，在鱗狀細(xì)胞癌(SCC)中為2-45%，在大細(xì)胞癌(LC)中為0-20%，這是通過(guò)在光學(xué)顯微鏡載玻片上使用石蠟包埋組織和 HER2-neu 抗血清測(cè)定的。Pfeiffer 等，1996 ；Kern 等，1990 ；Kern 等，1994 ；Tateishi 等，1991 ；Shi 等，MolCarcing5 :213-8,1992 ；Bongiorno 等，JThoracCardiovascSurgl07 590-5,1994；HarpoIe 等，ClinCancerResl :659-64,1995 ；Volm 等，AnticancerResl2 11-20,1992。此外，近來(lái)的報(bào)告舉例說(shuō)明了被設(shè)計(jì)用于評(píng)估HER2-neU表達(dá)水平的當(dāng)前方案的非特異性。用于測(cè)量侵入性乳腺癌中HER2-neu表達(dá)的HercepTes t 顯示具有非常高的假陽(yáng)性。Jacobs 等，J. Clin0ncoll7 :1983-1987,1999。如果存在一種精確，正確，而且一致的測(cè)定EGFR和HER2-neu表達(dá)水平的方法，那么人們就可確定何種程度的表達(dá)水平與患者存活能力相互關(guān)聯(lián)，及受體酪氨酸激酶定向化療是否適宜。使用標(biāo)準(zhǔn)方法證實(shí)NSCLC中EGFR和/或HER2-neu的過(guò)量表達(dá)，對(duì)于建立臨床試驗(yàn)是理想的，該臨床試驗(yàn)針對(duì)的是現(xiàn)在和將來(lái)的受體酪氨酸激酶定向化療，例如化療劑， 基于抗體的藥物，它們可用于治療過(guò)量表達(dá)這些受體的癌癥。現(xiàn)在用于測(cè)量EGFR和/或HER2-neu基因表達(dá)的方案，除了對(duì)腫瘤的預(yù)后不夠準(zhǔn)確之外，還要受到第二種限制，即它們需要大量含有未降解mRNA的新鮮組織。絕大多數(shù)患者的病理樣品都是按常規(guī)固定且用石蠟包埋的(FPE)，然后用于組織學(xué)分析及隨后的存檔。 因此，絕大多數(shù)活檢組織樣品都不能用于基因表達(dá)的分析，這是因?yàn)檫@種研究需要高度完整的RNA，才能進(jìn)行基因表達(dá)的準(zhǔn)確測(cè)量。目前，基因表達(dá)水平只能通過(guò)免疫組織化學(xué)染色在這種固定且包埋的樣品中定量監(jiān)測(cè)，從而監(jiān)測(cè)蛋白表達(dá)水平。由健康護(hù)理專業(yè)人員使用冷凍組織具有相當(dāng)大的不便。在設(shè)計(jì)任何一種基于RNA 的定量遺傳標(biāo)記測(cè)定法時(shí)，迅速遞送活檢樣品，以避免組織及后來(lái)的mRNA降解是首先要考慮的。進(jìn)行活檢的健康護(hù)理專業(yè)人員必須把組織樣品迅速遞送到所裝備的設(shè)備上，從而在收到組織樣品后立即進(jìn)行RNA提取。如果沒(méi)有這種設(shè)備，臨床醫(yī)師必須迅速將樣品冷凍，從而防止mRNA降解。為了在組織和RNA降解之前使用診斷設(shè)備進(jìn)行有效的RNA提取，組織樣品必須保持冷凍，直到它到達(dá)診斷設(shè)備，但可以位于較遠(yuǎn)處。在轉(zhuǎn)移過(guò)程中，可使用帶有液氮和干冰的專用設(shè)備維持冷凍組織的完整性，但花費(fèi)較高。常規(guī)的活檢樣品通常含有基質(zhì)和腫瘤組織的不均一混合物。與新鮮或冷凍組織不同，F(xiàn)PE活檢組織樣品可很容易地被顯微解剖，分成基質(zhì)和腫瘤組織，因此優(yōu)于使用新鮮或冷凍組織。而RNA從固定組織，特別是固定且石蠟包埋組織中的分離會(huì)產(chǎn)生高度降解的 RNA，這通常被認(rèn)為不適于基因表達(dá)的研究。現(xiàn)在有很多從生物樣品中純化RNA的技術(shù)，但還沒(méi)有一種可靠的從FPE樣品中分離RNA的方法。例如，Chomczynski (美國(guó)專利US5，346，994)描述了一種從組織中純化RNA 的方法，它是以液相分離為基礎(chǔ)，使用苯酚和異硫氰酸胍進(jìn)行的。在苯酚和異硫氰酸胍的水溶液中勻化生物樣品，然后將勻漿與氯仿混合。離心后，勻漿分成有機(jī)相，中間相和水相。蛋白螯合在有機(jī)相中，DNA在中間相中，RNA在水相中。RNA可從水相中沉淀出來(lái)。不幸的是， 該方法不適于固定且石蠟包埋的(FPE)組織樣品。分離RNA的其它已知技術(shù)通常是利用胍鹽或苯酚提取，如SambrookJ.等，(1989) pp. 7. 3-7. 24，和 Ausubel，F(xiàn). Μ.等，(1994)pp. 4. 0. 3-4. 4. 7 中實(shí)施例所述。同樣，在從石蠟包埋的組織樣品中分離RNA方面，還沒(méi)有一種已知方法能夠提供可再現(xiàn)的測(cè)量結(jié)果。因此，特別需要一種從石蠟包埋組織中分離RNA的技術(shù)，從而研究腫瘤組織中的基因表達(dá)，然后將某些受體或酶的表達(dá)水平用于測(cè)定特定療法成功的可能性或適合性。我們?cè)诖颂巿?bào)道了腫瘤內(nèi)高水平的EGFRmRNA和HER2_neumRNA與較低存活能力之間顯著的相互關(guān)聯(lián)。因此，本發(fā)明的目的是提供一種定量腫瘤組織中EGFR和/或 HER2-neumRNA的方法，以便為受體酪氨酸激酶定向化療提供早期的預(yù)后。本發(fā)明另一個(gè)目的是通過(guò)檢測(cè)患者腫瘤細(xì)胞中EGFR和/或HER2-neumRNA的量，并把它與預(yù)定的閾表達(dá)水平進(jìn)行比較，而提供一種評(píng)估固定且石蠟包埋(FPE)的組織中EGFR和/或HER2-neU水平， 并預(yù)測(cè)患者腫瘤對(duì)使用受體酪氨酸激酶定向化療方案進(jìn)行治療的可能敏感性的方法。發(fā)明_既述本發(fā)明一方面提供一種評(píng)估新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤細(xì)胞中EGFRmRNA表達(dá)水平的方法。本發(fā)明另一方面提供一種評(píng)估新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤細(xì)胞中HER2-neumRNA表達(dá)水平的方法。本發(fā)明另一方面提供一種測(cè)量新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的組織樣品中相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照的EGFRmRNA表達(dá)量的方法。該方法包括分離所述樣品的總mRNA，并測(cè)定相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的mRNA量的EGFRmRNA的量。本發(fā)明另一方面提供一種測(cè)量新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的組織樣品中相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照的HER2-neumRNA表達(dá)量的方法。該方法包括分離所述樣品的總 mRNA,并測(cè)定相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因mRNA量的HER2_neumRNA的量。在本發(fā)明這方面的其中一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有EGFR-1753F(SEQIDN0:1)或 EGFR-1823R(SEQIDN0 2)序列或具有基本上與其相同序列的寡核苷酸引物。本發(fā)明還提供這樣一種寡核苷酸引物，其序列在嚴(yán)格條件下可與SEQIDN0 1或SEQIDN0 2或它們的互補(bǔ)序列雜交。在本發(fā)明這方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有HER2-nei^671F(SEQIDN0:4)或 HER2-neu2699R(SEQIDN0 5)序列或具有基本上與其相同序列的寡核苷酸引物。本發(fā)明還提供這樣一種寡核苷酸引物，其序列在嚴(yán)格條件下與SEQIDN0 4或SEQIDN0 5或它們的互補(bǔ)序列雜交。本發(fā)明另一方面提供一種確定患者的受體酪氨酸激酶定向化療方案的方法，包括從新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中分離RNA;從與之相匹配的新鮮， 冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的非惡性組織樣品中分離RNA;測(cè)定兩種樣品中EGFR 的基因表達(dá)水平；用腫瘤樣品中的EGFR表達(dá)水平除以與之相匹配的非惡性組織樣品中的 EGFR表達(dá)水平，從而確定差別表達(dá)水平；把差別EGFR基因表達(dá)水平與EGFR基因的預(yù)定閾水平進(jìn)行比較；根據(jù)差別EGFR基因表達(dá)水平和預(yù)定閾水平的比較結(jié)果確定化療方案。本發(fā)明另一方面提供一種確定患者的受體酪氨酸激酶定向化療方案的方法，包括從新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中分離RNA;從與之相匹配的新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的非惡性組織樣品中分離RNA;測(cè)定兩種樣品中 HER2-neu的基因表達(dá)水平；用腫瘤樣品中的HER2_neU表達(dá)水平除以與之相匹配的非惡性組織樣品中的HER2-neU表達(dá)水平，從而確定差別表達(dá)水平；把差別HER2-neU基因表達(dá)水平與HER2-neU基因的預(yù)定閾水平進(jìn)行比較；根據(jù)差別HER2-neU基因表達(dá)水平和預(yù)定閾水平的比較結(jié)果確定化療方案。本發(fā)明另一方面提供一種確定患者的受體酪氨酸激酶定向化療方案的方法，包括從新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中分離RNA;從與之相匹配的新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的非惡性組織樣品中分離RNA;測(cè)定兩種樣品中的 HER2-neu和EGFR基因表達(dá)水平；用腫瘤樣品中的EGFR表達(dá)水平除以與之相匹配的非惡性組織樣品中的EGFR表達(dá)水平，從而確定EGFR差別表達(dá)水平；用腫瘤樣品中的HER2-neu表達(dá)水平除以與之相匹配的非惡性組織樣品中的HER2-neU表達(dá)水平，從而確定HER2-neU差別表達(dá)水平；把差別HER2-neu和EGFR基因表達(dá)水平與HER2_neu和EGFR基因的預(yù)定閾水平進(jìn)行比較；根據(jù)差別HER2-neU和EGFR基因表達(dá)水平與預(yù)定閾水平的比較結(jié)果確定化療方案。本發(fā)明另一方面提供一種測(cè)定患者存活能力的方法，包括從新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中分離RNA;從與之相匹配的新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的非惡性組織樣品中分離RNA ；測(cè)定兩種樣品中的EGFR基因表達(dá)水平；用腫瘤樣品中的EGFR表達(dá)水平除以與之相匹配的非惡性組織樣品中的EGFR表達(dá)水平，從而確定差別表達(dá)水平；把差別EGFR基因表達(dá)水平與EGFR基因的預(yù)定閾水平進(jìn)行比較；根據(jù)差別EGFR基因表達(dá)水平與預(yù)定閾水平的比較結(jié)果確定患者的存活能力。本發(fā)明另一方面提供一種測(cè)定患者存活能力的方法，包括從新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中分離RNA;從與之相匹配的新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的非惡性組織樣品中分離RNA;測(cè)定兩種樣品中的HER2-neU基因表達(dá)水平； 用腫瘤樣品中的HER2-neU表達(dá)水平除以與之相匹配的非惡性組織樣品中的HER2-neU表達(dá)水平，從而確定差別表達(dá)水平；將差別HER2-neu基因表達(dá)水平與HER2-neu基因的預(yù)定閾水平進(jìn)行比較；根據(jù)差別HER2-neU基因表達(dá)水平與預(yù)定閾水平的比較結(jié)果確定患者存活能力。本發(fā)明另一方面提供一種測(cè)定患者存活能力的方法，包括從新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中分離RNA;從與之相匹配的新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的非惡性組織樣品中分離RNA ；測(cè)定兩種樣品中的HER2-neu和EGFR基因表達(dá)水平；用腫瘤樣品中的EGn 表達(dá)水平除以與之相匹配的非惡性組織樣品中的EGFR表達(dá)水平，從而確定EGFR的差別表達(dá)水平；用腫瘤樣品中的HER2-neU表達(dá)水平除以與之相匹配的非惡性組織樣品中的HER2-neu表達(dá)水平，從而確定HER2-neu的差別表達(dá)水平；把 HER2-neu和EGFR的差別基因表達(dá)水平與HER2_neu和EGFR基因的預(yù)定閾水平進(jìn)行比較； 根據(jù)HER2-neU及EGFR基因的表達(dá)水平與預(yù)定閾水平的比較結(jié)果確定患者的存活能力。本發(fā)明還涉及一種標(biāo)準(zhǔn)化組織樣品中相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的EGFR和HER2-neu的未校正基因表達(dá)(UGE)的方法，其中所述組織樣品是使用TaqMan 技術(shù)分析的，所述方法是通過(guò)利用pre- TaqMan 技術(shù)，相對(duì)于樣品的內(nèi)部對(duì)照，對(duì)已知的EGFR和HER2-neu表達(dá)水平進(jìn)行分析而進(jìn)行的。


Sl治療性切除非小細(xì)胞癌患者的存活對(duì)HER2-neumRNA表達(dá)狀態(tài)的估計(jì)概率。與高水平HER2-neu表達(dá)組的31. 1個(gè)月(95% C. I :21. 96-40. 24)相比，低水平HER2_neu表達(dá)組沒(méi)有達(dá)到中值存活(P = 0. 004)。圖2治療件切除非小細(xì)胞癌患者的存活對(duì)EGPRmRNA表汰狀杰的估計(jì)概率。在高水平EGFR表達(dá)組中，可觀察到較低總體存活率的傾向，但沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。與高水平EGFR表達(dá)組的32. 37個(gè)月(95% C. I :8. 43-56. 31)相比，低水平EGFR表達(dá)組沒(méi)有達(dá)到中值存活(P = 0.176)。M3治療性切除非小細(xì)胞癌患者的存活對(duì)NSCLC中EGFR和HER2-neu共表達(dá)結(jié)合模式的估計(jì)概率。與高水平EGFR表達(dá)組的45. 47個(gè)月，高水平HER2-neu表達(dá)組的31. 10個(gè)月(95% C. I 14. 77-47. 43)，和高水平 HER2_neu 及 EGFR 表達(dá)組的 22. 03 個(gè)月(95% C. I 2. 30-41. 76，P = 0. 003)相比，低水平HER2_neu和EGFR表達(dá)組沒(méi)有達(dá)到中值存活。Mi表示患者和腫瘤中高水平和低水平EGFR及HER2-neu表達(dá)的表。S5表示基于臨床和分子參數(shù)的患者存活表。M6表示Cox-比例危險(xiǎn)比模型的圖。雙標(biāo)記是指EGFR和HER2_neu。圖7是舉例說(shuō)明如何計(jì)算相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的EGFR表汰的圖表。所述圖表包括用兩種試驗(yàn)樣品獲得的數(shù)據(jù)，(未知1和2)，并舉例說(shuō)明如何測(cè)定未校正基因的表達(dá)數(shù)據(jù) (UGE)。該圖表還舉例說(shuō)明了如何利用通過(guò)pre- TaqMan 技術(shù)測(cè)定的已知相對(duì)EGFR值， 標(biāo)準(zhǔn)化TaqMan 儀器所產(chǎn)生的UGE。這是通過(guò)用UGE乘以校正因子K_完成的。圖中的內(nèi)部對(duì)照基因是β -肌動(dòng)蛋白，校準(zhǔn)RNA是人肝總RNA (Stratagene，目錄號(hào)735017)。Μ8是舉例說(shuō)明如何計(jì)算相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的HER2-neu表達(dá)的圖表。所述圖表包括用兩種試驗(yàn)樣品獲得的數(shù)據(jù)，(未知1和2)，并舉例說(shuō)明如何測(cè)定未校正基因的表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)。該圖表還舉例說(shuō)明了如何利用先前公開(kāi)的HER2-neU值，標(biāo)準(zhǔn)化TaqMan 儀器所產(chǎn)生的UGE。這是通過(guò)用UGE乘以校正因子KNEK2_neu完成的。圖中的內(nèi)部對(duì)照基因是 β -肌動(dòng)蛋白，校準(zhǔn)RNA是人肝總RNA (Stratagene，目錄號(hào)#735017)。圖9是表示5名不同結(jié)腸癌患者腫瘤的校iH EGFR表達(dá)倌的圖表。所述患者正在接受CPT-11/C225受體酪氨酸激酶定向治療法。經(jīng)測(cè)定，患者1具有2.08Χ10_3的校正 EGFR表達(dá)水平且完全有效(CR)?；颊?具有8. 04Χ 10_3的校正EGFR表達(dá)水平且部分有效 (PR)?；颊?具有1. 47 ΧΙΟ"3的校正EGFR表達(dá)水平，且表現(xiàn)為部分有效(PR)?；颊?具有0. 16X 10_3的校正EGFR表達(dá)水平，且患有表現(xiàn)無(wú)效的穩(wěn)定疾病(SD)。患者5沒(méi)有EGFR 表達(dá)(0. OX 10_3)且患有進(jìn)展性疾病(PR)。發(fā)明詳述表達(dá)高水平HER2-neu和/或EGFRmRNA的腫瘤被認(rèn)為可能對(duì)受體酪氨酸激酶定向化療敏感。相反，表達(dá)低水平HER2-neu和EGFRmRNA的那些腫瘤可能對(duì)受體酪氨酸激酶定向化療不敏感?；颊叩牟顒eHER2-neu和EGFRmRNA表達(dá)狀態(tài)是通過(guò)把它與預(yù)定的閾表達(dá)水平進(jìn)行比較而確定的。本發(fā)明提供一種測(cè)量新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的組織中，HER2-neu和/或EGFRmRNA相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因表達(dá)的表達(dá)量的方法。本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了可準(zhǔn)確評(píng)估新鮮，冷凍，固定或固定且包埋組織中的HER2-neU和EGFR基因表達(dá)的寡核苷酸引物。寡核苷酸引物，EGFR-1753F(SEQIDN0 :1)，EGFR_1823R(SEQIDN0 :2)，或基本上與其相同的寡核苷酸引物，優(yōu)選與從新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中提取出來(lái)的RNA —起使用。本發(fā)明還提供寡核苷酸引物，HER2-neu2671F(SEQIDN0 4)， HER2-nei^699R(SEQIDN0 :5)，或基本上與其相同的寡核苷酸引物，優(yōu)選與從新鮮，冷凍，固定或固定且石蠟包埋(FPE)的腫瘤樣品中提取出來(lái)的RNA—起使用。然后可將HER2-neU 和/或EGFR基因表達(dá)的這種測(cè)量值用于預(yù)測(cè)受體酪氨酸激酶定向化療。本發(fā)明的該實(shí)施方案包括，一種確實(shí)可靠的，從新鮮，冷凍，固定或FPE樣品中提取RNA，通過(guò)使用一對(duì)寡核苷酸引物測(cè)定樣品中EGFRmRNA含量的方法，其中優(yōu)選寡核苷酸引物對(duì)EGFR-1753F(SEQIDN0 1)和EGFR-1823R(SEQIDN0 :2)，或基本上與其相同的寡核苷酸，用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)。本發(fā)明另一實(shí)施方案包括，一種確實(shí)可靠的，從新鮮，冷凍，固定或FPE樣品中提取RNA，通過(guò)使用一對(duì)寡核苷酸引物測(cè)定樣品中HER2-neumRNA含量的方法，其中優(yōu)選寡核苷酸引物對(duì) HER2-neu2671F(SEQIDN0 4)和 HER2_nei^699R(SEQIDN0 5)，或基本上與其相同的寡核苷酸?！盎旧舷嗤钡暮怂崾侵冈趪?yán)格條件下與靶雜交的核酸，及適當(dāng)比對(duì)時(shí)，與具有適當(dāng)核苷酸插入和缺失的核酸相比較時(shí)，至少約60%，優(yōu)選至少約70%，更優(yōu)選至少約80%，優(yōu)選至少約90%，更優(yōu)選至少約95-98%的核苷酸相同的核酸片段，或它們的互補(bǔ)鏈。當(dāng)選擇性高于特異性時(shí)，存在選擇性雜交。見(jiàn)，Kanehisa, NucleicAcidsRes. , 12 203-213(1984)。本發(fā)明的方法適用于各種腫瘤類型。它可制備個(gè)體“腫瘤表達(dá)分布”，由此在個(gè)體患者的樣品中測(cè)定HHR2-neU和/或EGFR的表達(dá)水平，并預(yù)測(cè)對(duì)各種化療的反應(yīng)。優(yōu)選，本發(fā)明的方法適用于實(shí)體瘤，最優(yōu)選NSCLC腫瘤。此處定義的“差別表達(dá)水平”是指腫瘤中的EGFR或HER2_neU表達(dá)水平和與之相匹配的非惡性組織樣品中的EGFR或HER2-neU表達(dá)水平之間的差異。差別表達(dá)水平是用腫瘤樣品特定基因的UGE除以與之相匹配的非惡性組織樣品相同基因的UGE而確定的。此處定義的EGFR表達(dá)的“預(yù)定閾水平”是一種差別EGFR表達(dá)水平，當(dāng)高于“預(yù)定閾水平”(即，高水平表達(dá))時(shí)，腫瘤可能對(duì)受體酪氨酸激酶定向化療方案敏感。高差別 EGFR表達(dá)水平預(yù)測(cè)低患者存活能力。表達(dá)水平低于閾水平的腫瘤可能不受受體酪氨酸激酶定向化療方案的影響。低差別EGFR表達(dá)水平預(yù)測(cè)高患者存活能力。不論是高于還是低于“閾水平”，差別表達(dá)都是通過(guò)Mafime等所用的方法測(cè)定的，它計(jì)算了食道鱗狀細(xì)胞癌患者的非惡性組織中，個(gè)體差別腫瘤/正常(T/N)表達(dá)的比值。Mafune等，ClinCancerReS5 4073-4078,1999。這種分析方法可產(chǎn)生每名患者的精確表達(dá)值，它是以與之相匹配的非惡性組織的個(gè)體背景表達(dá)為基礎(chǔ)的。如果用腫瘤樣品中EGFR β -肌動(dòng)蛋白的UGE除以與之相匹配的非惡性組織樣品中EGFR β -肌動(dòng)蛋白的UGE所得的值高于約1. 8的預(yù)定閾值，則認(rèn)為EGFR的差別表達(dá)是“高水平的”，并指示低存活能力。如果用腫瘤樣品中EGFR β -肌動(dòng)蛋白的UGE除以與之相匹配的非惡性組織樣品中EGFR β -肌動(dòng)蛋白的UGE所得的值低于約1. 8的預(yù)定閾值，則認(rèn)為EGFR的差別表達(dá)是“低水平的”，并指示高存活能力。
此處定義的HER2-neu表達(dá)的“預(yù)定閾水平”是一種差別HER2-neu表達(dá)水平，當(dāng)高于“預(yù)定閾水平”(即，高水平表達(dá))時(shí)，腫瘤可能對(duì)受體酪氨酸激酶定向化療方案敏感。 高差別HER2-neU表達(dá)水平預(yù)測(cè)低患者存活能力。表達(dá)水平低于閾水平的腫瘤可能不受受體酪氨酸激酶定向化療方案的影響。低差別HER2-neU表達(dá)水平預(yù)測(cè)高患者存活能力。 如果用腫瘤樣品中HER2-neU β-肌動(dòng)蛋白的UGE除以與之相匹配的非惡性組織樣品中 HER2-neu β -肌動(dòng)蛋白的UGE所得的值高于約1. 8的預(yù)定閾值，則認(rèn)為HER2-neu的差別表達(dá)是“高水平的”，并指示低存活能力。如果用腫瘤樣品中HER2-neU 肌動(dòng)蛋白的UGE 除以與之相匹配的非惡性組織樣品中HER2-neU β -肌動(dòng)蛋白的UGE所得的值低于約1. 8 的預(yù)定閾值，則認(rèn)為HER2-neU的差別表達(dá)是“低水平的”，并指示高存活能力。HER2-neu的“閾水平”是使用下列結(jié)果和方法測(cè)量的。以HER2-neu和β -肌動(dòng)蛋白PCR產(chǎn)物的比值表示的校正HER2-neumRNA表達(dá)在正常肺中為4. 17 X 10_3 (范圍:0. 28-23. 86X10’，在腫瘤組織中為 4. 35 X IO"3 (范圍0.21-68. 11X10’ (P = 0. 019ffilcoxon 檢驗(yàn))。通過(guò) Miller 和 Siegmund(Miller 等，Biometrics38 :1011-1016, 1982)及Halpern(Biometrics38 1017-1023，1982)的最大卡方法測(cè)定的閾值1. 8可將患者分成低和高差別HER2-neU表達(dá)。依據(jù)這種標(biāo)準(zhǔn)，四名(34.9%)患者具有高水平的差別 HER2-neu表達(dá)，54名￠5. 1% )患者具有低水平的差別HER2_neu表達(dá)。EGFR的“閾水平”是使用下列結(jié)果和方法測(cè)量的。正常肺的中值校正EGFRmRNA 表達(dá)為8. 17X IO"3(范圍0.31-46. ^X 10_3)，在腫瘤組織中為7·22Χ10_3(范圍
0.27-97. 49X10, (P = n. s.)。最大卡方法(Miller (1982) ；Halpern(1982))測(cè)定的閾值
1.8將患者分成低和高差別EGFR表達(dá)。依據(jù)這種標(biāo)準(zhǔn)，觀名(33. 7% )患者具有高水平的差別EGFR表達(dá)，55名(66. 3% )患者具有低水平的差別EGFR表達(dá)。在進(jìn)行本發(fā)明的方法時(shí)，測(cè)定患者的差別EGFR表達(dá)水平或差別HER2_neU表達(dá)水平，從而預(yù)測(cè)受體酪氨酸激酶定向化療方案的效力。此外，在本發(fā)明的方法中，測(cè)定患者的差別HER2-neU表達(dá)水平，從而預(yù)測(cè)受體酪氨酸激酶定向化療方案的效力。此外，在本發(fā)明的方法中，測(cè)定患者的差別EGFR表達(dá)水平，從而預(yù)測(cè)受體酪氨酸激酶定向化療方案的效力?？蛇x擇地，測(cè)定患者的差別EGFR表達(dá)水平和差別HER2-neU表達(dá)水平，從而預(yù)測(cè)受體酪氨酸激酶定向化療方案的效力。此處定義的“與之相匹配的非惡性樣品”是指非-癌性組織樣品，它與腫瘤樣品來(lái)源于同一個(gè)體，用于分析差別EGFR和/或差別HER2-neU表達(dá)。優(yōu)選與之相匹配的非惡性樣品和腫瘤樣品來(lái)源于相同的器官。最優(yōu)選，與之相匹配的非惡性腫瘤樣品和腫瘤樣品來(lái)源于相同的器官組織層。且，優(yōu)選與之相匹配的非惡性組織樣品和進(jìn)行活檢的腫瘤樣品在同一時(shí)間采集。在優(yōu)選實(shí)施方案中，分析了來(lái)源于下列兩個(gè)部位的樣品從距離腫瘤最遠(yuǎn)處采集的肺腫瘤和非惡性肺組織，或從距離腫瘤最遠(yuǎn)處采集的結(jié)腸腫瘤和非惡性結(jié)腸組織。在進(jìn)行本發(fā)明該實(shí)施方案的方法時(shí)，優(yōu)選分離患者的腫瘤細(xì)胞。實(shí)體或淋巴瘤或其一部分是通過(guò)手術(shù)從患者切除下來(lái)的，或通過(guò)常規(guī)的活檢獲得。從冷凍或新鮮腫瘤樣品中分離出來(lái)的RNA是通過(guò)本領(lǐng)域任何一種典型的方法從細(xì)胞中提取出來(lái)的，例如 Sambrook, Fischer 禾口 Maniatis, MolecularCloning, alaboratorymanual, (2nded.), ColdSpringHarborLaboratoryPress, NewYork, (1989)。優(yōu)選在提取過(guò)程中，注意避免 RNA 降解。
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然而，患者的組織在活檢后常常被固定，例如，通常用福爾馬林(甲醛)或 gluteraldehyde固定，或用醇浸漬。通常是使固定的生物樣品脫水，并將其包埋在石蠟或本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的其它固體支持物中。見(jiàn)Plenat等，ArmPathO12001Jan ;21(1) 29-470沒(méi)有包埋的固定組織及固定且包埋的組織都可用于本發(fā)明的方法中。將包埋固定組織的固體支持物設(shè)計(jì)為可用有機(jī)溶劑除去，隨后使保存的組織再水合。RNA是通過(guò)1999年12月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)US09/469，338中描述的任何一種方法從石蠟包埋(FPE)組織細(xì)胞中提取出來(lái)的，所述專利申請(qǐng)全部引入此處作為參考。此處所用FPE組織是指已經(jīng)固定并包埋在固體可除去的支持物中的組織，如可儲(chǔ)存或存檔的組織樣品。RNA可從存檔的病理樣品或活檢樣品中分離出來(lái)，其首先脫石蠟。代表性的脫石蠟方法包括用有機(jī)溶劑，如二甲苯洗滌石蠟包埋的樣品。脫石蠟樣品還可用低級(jí)醇的水溶液再水合。適宜的低級(jí)醇包括，例如甲醇，乙醇，丙醇和丁醇。脫石蠟樣品可用逐漸降低濃度的低級(jí)醇溶液連續(xù)洗滌而再水合。可選擇地，樣品可同時(shí)脫石蠟和再水合。然后提取樣品中的RNA。為了提取RNA，可利用機(jī)械，聲波或其它勻化工具勻化固定或固定且脫石蠟的樣品。再水合的樣品可在含有離液劑，如硫氰酸胍(也可作為異硫氰酸胍銷售)的溶液中勻化。將離液溶液中的勻化樣品加熱至約50-約100°C，所述離液溶液含有有效量的離液劑， 如胍化合物。優(yōu)選的離液劑是硫氰酸胍。“有效濃度的離液劑”的選擇是指從石蠟包埋的樣品中純化的RNA量比沒(méi)有離液劑情況下分離出來(lái)的RNA量高大約10倍。離液劑包括，如，胍化合物，脲，甲酰胺，碘化鉀，硫氰酸鉀及類似的化合物。本發(fā)明方法的優(yōu)選離液劑是胍化合物，如異硫氰酸胍(也作為硫氰酸胍銷售)和鹽酸胍。很多陰平衡離子都是有用的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可用這種適宜的陰離子制備多種胍鹽。本發(fā)明所用胍溶液的有效濃度通常約為1-5M，優(yōu)選約4M。如果RNA 已存在于溶液中，那么胍溶液的濃度可以更高，這樣，樣品中獲得的最終濃度約為1-5M。優(yōu)選用適當(dāng)?shù)纳彌_液，如Tris-HCl把胍溶液緩沖至pH約3_6，更優(yōu)選約4。離液溶液還可含有還原劑，如二硫蘇糖醇(DTT)和β-巰基乙醇(BME)。離液溶液還可含有RNA酶抑制劑。然后通過(guò)苯酚-氯仿萃取，離子交換色譜或大小排阻色譜回收離液溶液中的RNA。 然后，利用提取，電泳，層析，沉淀技術(shù)或其它適宜技術(shù)進(jìn)一步純化RNA。HER2-neu或EGFRmRNA的定量?jī)?yōu)選使用本領(lǐng)域常用的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)進(jìn)行，其中所述HER2-neu或EGFRmRNA來(lái)源于新鮮，冷凍，或固定組織的純化總 mRNA。定量HER2-neu或EGFRmRNA的其它方法包括，例如，使用多重PCR中所用的分子指標(biāo)和其它標(biāo)記探針。此外，本發(fā)明還利用沒(méi)有PCR的系統(tǒng)測(cè)量HER2-neU和/或EGFR的 mRNA，其中沒(méi)有 PCR 的系統(tǒng)使用的是與 Invader 測(cè)定(ThirdWaveTechnologies，Inc.) 中使用的探針相似的熒光標(biāo)記探針。最優(yōu)選，HER2-neu和/或EGFRcDNA及內(nèi)部對(duì)照或管家基因(例如，β-肌動(dòng)蛋白)的定量是利用基于熒光的實(shí)時(shí)檢測(cè)法(ABIPRISM 7700或 7900SequenceDetectionSystem [TaqMan ], AppliedBiosystems, FosterCity, CA.)或與 Heid 等(GenomeRes 1996 ；6 :986-994)和 Gibson 等(GenomeRes 1996 ；6 :995-1001)所述相似的系統(tǒng)進(jìn)行的。ABI7700(TaqMail hstrument)的輸出量是以Ct’ s或“循環(huán)閾”表示的。使用TaqMan 系統(tǒng)，樣品中具有較高數(shù)量靶分子的高水平表達(dá)基因產(chǎn)生一種信號(hào)，并且PCR循環(huán)(較低的Ct)比具有較少靶分子(較高的Ct)的低水平相對(duì)表達(dá)的基因要少。此處所用“管家”基因或“內(nèi)部對(duì)照”是任何一種組成型或全局型表達(dá)基因，它的存在可評(píng)估HER2-neU和/或EGFRmRNA的水平。這種評(píng)估包括測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄的總體組成型水平和RNA回收中變異的對(duì)照。“管家”基因或“內(nèi)部對(duì)照”包括，但不限制于親環(huán)蛋白基因， β-肌動(dòng)蛋白基因，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因，GAPDH基因等。最優(yōu)選內(nèi)部對(duì)照基因是肌動(dòng)蛋白基因，如 Eads 等，CancerResearchl999 ；59 :2302-2306 所述。RNA回收中變異的對(duì)照需要使用“校準(zhǔn)RNA”?！靶?zhǔn)RNA”可以是任何一種可得到的精確預(yù)定量的對(duì)照RNA。優(yōu)選使用人肝總RNA (Stratagene，目錄號(hào)735017)。此處所用“未校正基因表達(dá)(UGE)，，是指由TaqMan ·儀器產(chǎn)生的相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的HER2-neu和/或EGFR表達(dá)的數(shù)字輸出。用于確定UGE的公式在實(shí)施例3和4中表示，并用圖7和8的樣品計(jì)算結(jié)果舉例說(shuō)明。這些數(shù)值可用于確定差別基因表達(dá)(即，用特定腫瘤樣品的“UGE”除以與之相匹配的非-腫瘤樣品的“UGE”)是高于還是低于“預(yù)定閾”水平。EGFR和HER2-neU的預(yù)定閾水平約為1.8。本發(fā)明另一方面提供一種校準(zhǔn)化未校正基因表達(dá)(UGE)值的方法，所述未校正基因表達(dá)(UGE)值是利用源于非-TaqMan 技術(shù)的“已知相對(duì)基因表達(dá)”值，從TaqMan 儀器獲得的。優(yōu)選，源于TaqMan 的組織樣品HER2-neU和/或EGFRUGE值是相對(duì)于樣品，用已知源于非-TaqMan 的相對(duì)HER2-neu和/或EGFR β -肌動(dòng)蛋白表達(dá)值標(biāo)準(zhǔn)化的。此處所用“校正的相對(duì)EGFR表達(dá)”是指標(biāo)準(zhǔn)化的EGFR表達(dá)，UGE乘以EGFR特異性校正因子(Kkfk)得到一個(gè)值，該值可與EGFR相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的已知表達(dá)水平范圍相比較。實(shí)施例3和圖7詳細(xì)說(shuō)明了這些計(jì)算結(jié)果。對(duì)EGFR，內(nèi)部對(duì)照β-肌動(dòng)蛋白和校準(zhǔn)人肝總RNA (Stratagene，目錄號(hào)735017)特異的Kkfk為沈.95Χ10—3。這些數(shù)值還可確定用特定腫瘤樣品的“校正相對(duì)表達(dá)”除以與之相匹配的非-腫瘤樣品的“校正相對(duì)表達(dá)”所得的值(即，差別表達(dá))是高于還是低于“預(yù)定閾”水平。HER2-neU或EGFR的預(yù)定閾水平約為1.8。在確定腫瘤樣品中的EGFR或HER2-neU差別表達(dá)是否比與之相匹配的非-腫瘤樣品高1. 8倍時(shí)，人們可很容易地識(shí)別UGE值或可用的校正相對(duì)表達(dá)值。例如，如果用腫瘤的校正相對(duì)表達(dá)水平除以與之相匹配的非-腫瘤樣品的校正相對(duì)表達(dá)水平，則K-因子約去， 剩下的比值相同，就象使用了 UGE值。“已知的相對(duì)基因表達(dá)”值源于先前分析的組織樣品，且它是以靶基因的RT-PCR信號(hào)與組成型表達(dá)的內(nèi)部對(duì)照基因(例如，β-肌動(dòng)蛋白，GAPDH等)的比值為基礎(chǔ)的。優(yōu)選這種組織樣品是用福爾馬林固定并用石蠟包埋(FPE)的樣品，RNA是按照實(shí)施例1描述的方案從它們之中提取出來(lái)的。為了測(cè)量相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照的基因表達(dá)，使用了本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)定量RT-PCR技術(shù)。I^re-TaqMan 技術(shù)PCR反應(yīng)進(jìn)行固定的循環(huán)數(shù)(S卩，30次)，并報(bào)告每份樣品的終點(diǎn)值。然后按照EGFR表達(dá)與β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)的比值報(bào)道這些值。除了 β-肌動(dòng)蛋白和/或不同于人肝總RNA (Stratagene，目錄號(hào)735017)的校準(zhǔn)RNA之外，還可測(cè)定其它內(nèi)部對(duì)照基因的KEeFK。為此，人們必須校準(zhǔn)內(nèi)部對(duì)照基因和校準(zhǔn) RNA，其中已經(jīng)測(cè)定了相對(duì)于特定內(nèi)部對(duì)照基因EGFR的表達(dá)水平(即，“已知的相對(duì)基因表達(dá)”)。優(yōu)選這種組織樣品是福爾馬林固定且石蠟包埋的(FPE)樣品，RNA是按照實(shí)施例1 描述的方案從它們之中提取出來(lái)的。這種測(cè)定可使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)pre-TaqMan 定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行。根據(jù)這種測(cè)定，這種樣品具有EGFR的“已知相對(duì)基因表達(dá)”水平，可用于測(cè)定對(duì)實(shí)施例3所述的新內(nèi)部對(duì)照和/或校準(zhǔn)RNA特異的新KEeFK。
此處所用“校正的相對(duì)HER2-neu表達(dá)”是指標(biāo)準(zhǔn)化的EGFR表達(dá)，UGE乘以HER2-neU特異性校正因子(KHEK2_neu)得到一個(gè)值，該值可與相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照基因的 HER2-neU已知表達(dá)水平范圍相比較。實(shí)施例4和圖8詳細(xì)說(shuō)明了這些計(jì)算結(jié)果。對(duì)于 HER2-neu，內(nèi)部對(duì)照β-肌動(dòng)蛋白和校準(zhǔn)人肝總RNA (Stratagene，目錄號(hào)735017)特異的
KHEE2-neu 為 13. 3X 10 3。除了 β-肌動(dòng)蛋白和/或不同于人肝總RNA (Stratagene，目錄號(hào)735017)的校準(zhǔn)RNA之外，還可測(cè)定相對(duì)于其它內(nèi)部對(duì)照基因的KHEK2_neu。為此，人們必須校準(zhǔn)內(nèi)部對(duì)照基因并校準(zhǔn)RNA，其中已經(jīng)測(cè)定了相對(duì)于特定內(nèi)部對(duì)照基因HER2-neU的表達(dá)水平(即，“已知的相對(duì)基因表達(dá)”)。優(yōu)選這種組織樣品是福爾馬林固定且石蠟包埋的(FPE)樣品，且 RNA是按照此處所述的方案從它們之中提取出來(lái)的。這種測(cè)定可使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn) pre-TaqMan 定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行。根據(jù)這種測(cè)定，這種樣品具有HER2-neU的“已知相對(duì)基因表達(dá)”水平，可用于測(cè)定對(duì)實(shí)施例4所述的新內(nèi)部對(duì)照和/或校準(zhǔn)RNA特異的新
KnEE2-neu°本發(fā)明的方法可適于各種組織和腫瘤類型，可用于評(píng)估患者的臨床治療，并作為各種癌癥，包括乳腺癌，頭頸癌，肺癌，食管癌，結(jié)腸直腸癌等的診斷或預(yù)后工具。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法適于NSCLC腫瘤的預(yù)后?；熐爸委熌[瘤活檢樣品通常只對(duì)固定且石蠟包埋(FPE)的組織有效，這些組織通常只含有非常少量的不均一組織。這種FPE樣品可很容易經(jīng)過(guò)顯微解剖，這樣就可測(cè)定沒(méi)有污染非惡性基質(zhì)組織的腫瘤組織中的HER2-neU和/或EGFR基因表達(dá)。此外，比較還可在活檢組織樣品內(nèi)的非惡性基質(zhì)組織和腫瘤組織間進(jìn)行，因?yàn)檫@種樣品常常含有兩種類型的組織。通常，如SEQIDN0 :10所示，與EGFR基因的一個(gè)區(qū)側(cè)面連接的任何寡核苷酸對(duì)都可用于進(jìn)行本發(fā)明的方法。在嚴(yán)格條件下與EGFR基因的一個(gè)區(qū)雜交，用于本發(fā)明的引物可擴(kuò)增20-1000個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選50-100個(gè)堿基對(duì)，最優(yōu)選少于100個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物。本發(fā)明提供特異性的寡核苷酸引物對(duì)和與其基本上相同的寡核苷酸引物，可利用新鮮，冷凍，固定或FPE樣品精確評(píng)估EGFR表達(dá)。優(yōu)選寡核苷酸引物，EGFR-1753F (SEQIDN0 1)和EGFR-1823R(SEQIDN0 2)，(此處也稱為寡核苷酸引物對(duì)EGFR)和基本上與其相同的寡核苷酸引物。寡核苷酸引物EGFR-1753F(SEQIDN0 1)和EGFR_1823R(SEQIDN0 2)顯示出對(duì)測(cè)量EGFRmRNA的水平特別有效，所述測(cè)量是使用通過(guò)任何一種mRNA分離方法從新鮮，冷凍，固定或FPE細(xì)胞中提取出來(lái)的RNA進(jìn)行的，如實(shí)施例1所述。此外，如SEQIDN0 :11所示，與HER2-neu基因的一個(gè)區(qū)側(cè)面連接的任何寡核苷酸對(duì)都可用于進(jìn)行本發(fā)明的方法。在嚴(yán)格條件下與HER2-neU基因的一個(gè)區(qū)雜交，用于本發(fā)明的引物可擴(kuò)增20-1000個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選50-100個(gè)堿基對(duì)，最優(yōu)選少于100個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物。本發(fā)明提供特異性的寡核苷酸引物對(duì)和與其基本上相同的寡核苷酸引物， 可利用新鮮，冷凍，固定或FPE樣品精確評(píng)估HER2-neU表達(dá)。優(yōu)選寡核苷酸引物， HER2-neu2671F(SEQIDN0 4)和 HER2_nei^699R(SEQIDN0 5)，(此處也稱為寡核苷酸引物對(duì) HER2-neu)和基本上與其相同的寡核苷酸引物。寡核苷酸引物HER2-nei^671F (SEQIDN0 4)和HER2-nei^699R(SEQIDN0 5)顯示出對(duì)于測(cè)量HER2_neumRNA的水平特別有效，所述測(cè)量是使用通過(guò)任何一種mRNA分離方法從新鮮，冷凍，固定或FPE細(xì)胞中提取出來(lái)的RNA進(jìn)行的，如實(shí)施例1所述。本發(fā)明包括基本上相同的寡核苷酸，其在嚴(yán)格條件下(如此處所定義的)與 EGFR-1753F(SEQIDN0 1)，其互補(bǔ)序列，或EGFR-1823F (SEQIDN0 2)，或其互補(bǔ)序列的寡核苷酸引物序列，或 HER2-nei^671F(SEQIDN0 4)，其互補(bǔ)序列，或 HER2_nei^699R(SEQIDN0 5)或其互補(bǔ)序列的核苷酸引物序列的全部或一部分雜交。在嚴(yán)格的雜交條件下，只有高度互補(bǔ)的，S卩，與此處所定義的基本上相似的核酸序列才能進(jìn)行雜交。優(yōu)選，這種條件會(huì)阻礙20個(gè)連續(xù)核苷酸中有4個(gè)或更多錯(cuò)配，更優(yōu)選20 個(gè)連續(xù)核苷酸中有2個(gè)或更多錯(cuò)配，最優(yōu)選20個(gè)相連核苷酸中有1個(gè)或更多錯(cuò)配的核酸進(jìn)行雜交。核酸的雜交部分通常至少約為10個(gè)(例如，15個(gè))核苷酸長(zhǎng)。核酸進(jìn)行雜交的部分與寡核苷酸引物EGFR-1753F(SEQIDN0 1)，其互補(bǔ)序列，或EGFR-1823F(SEQIDN0 2)，或其互補(bǔ)序列，或寡核苷酸引物HER2-nei^671F(SEQIDN0 :4)，其互補(bǔ)序列，或 HER2-neu2699R(SEQIDN0 5)或其互補(bǔ)序列的全部或一部分序列至少約80%，優(yōu)選至少約 95 %，或最優(yōu)選至少約98 %相同。寡核苷酸引物與核酸樣品在嚴(yán)格條件下的雜交在下面規(guī)定。核酸雙鏈體或雜交體的穩(wěn)定性是以解鏈溫度(Tm)表示的，它是探針從靶DNA解離下來(lái)的溫度。解鏈溫度可用于限定所需的嚴(yán)格條件。如果所要鑒定的序列與探針基本上相同，而不是相同，那么它可首先用于確定最低溫度，在最低溫度時(shí)，只有使用特殊濃度的鹽(例如，SSC或SSPE)才能進(jìn)行同源雜交。然后，假定錯(cuò)配導(dǎo)致Tm降低1°C，那么雜交反應(yīng)的最終洗滌溫度因此降低(例如，如果找到與探針的同一性>95%的序列，那么最終的洗滌溫度降低5°C)。實(shí)際上，Tm 在0. 50C -1. 50C /1%錯(cuò)配之間變化。嚴(yán)格條件包括約68°C時(shí)，在hSSC/^xDenhart，s溶液/1.0% SDS中雜交，室溫時(shí)， 在0. 2xSSC/0. 1% SDS中洗滌。中度的嚴(yán)格條件包括約42°C時(shí)，在3xSSC中洗滌。改變鹽濃度和溫度參數(shù)，可在引物和靶核酸之間獲得最佳的同一性水平。有關(guān)這種條件的其它指導(dǎo)可在本領(lǐng)域中很容易地得到，例如，Sambrook, Fischer和Maniatis，MolecularCloning， alaboratorymanual, (2nded.), ColdSpringHarborLaboratoryPress, NewYork, (1989)禾口 F. Μ. Ausubel 等編輯，CurrentProtocolsinMolecularBiology, Johnffiley 禾口 Sons (1994)。此處公開(kāi)的寡核苷酸引物能夠精確評(píng)估固定或固定且石蠟包埋的組織，及冷凍或新鮮組織中的HER2-neu和/或EGFR基因表達(dá)。FPE樣品的RNA比新鮮或冷凍組織的RNA 更破碎。因此，本發(fā)明的方法適用于測(cè)定所有組織中的HER2-neU和/或EGFR基因表達(dá)，而先前則不存在精確且一致性的測(cè)定新鮮和冷凍組織中HER2-neU和/或EGFR基因的方法， 且根本不存在利用固定組織測(cè)定HER2-neu和/或EGFR基因表達(dá)的方法。HER2-neu的過(guò)度活性是指編碼HER2-neu基因的擴(kuò)增或HER2-neu活性水平的產(chǎn)生，其與細(xì)胞增殖性疾病有關(guān)(即，隨著HER2-neU水平的增加，細(xì)胞增殖性疾病的一個(gè)或多個(gè)癥狀更加嚴(yán)重)。本發(fā)明中“受體酪氨酸激酶定向”化療或化療方案是指含有特異性干擾I類受體酪氨酸激酶功能的藥劑的化療。優(yōu)選，這種藥劑可抑制EGFR和/或HER2-neU受體酪氨酸激酶的信號(hào)傳遞活性。這種藥劑包括4-苯胺基喹唑啉，如6-丙烯酰胺基-4-苯胺基喹唑啉(Bonvini 等，CancerRes. 2001Febl5 ；61(4) :1671-7)及其衍生物，erbstatin(Toi 等，Eur. J. CancerClin. Oncol.，1990，26，722)，格爾德霉素，雙單環(huán)，二環(huán)或雜環(huán)芳基化合物(PCTW092/20642)，亞乙烯基-氮雜吲哚衍生物(PCTW094/14808)和1-環(huán)丙基_4_吡啶基-喹諾酮(美國(guó)專利US5，330，99 ，它們通常被描述為酪氨酸激酶抑制劑。且，苯乙烯基化合物(美國(guó)專禾U US5, 217，999)，苯乙烯基取代的吡啶化合物(美國(guó)專利US5, 302，606)， 某些喹唑啉衍生物(歐洲申請(qǐng)EP0566^6)，seleoindoles和硒化物(PCTW094/0;3427)，三環(huán)的多羥基化合物(PCTW092/21660)和芐基膦酸化合物(PCTW091/154%)也被描述為治療癌癥的酪氨酸激酶抑制劑。其它針對(duì)EGFR和/或HER2-neu受體酪氨酸激酶信號(hào)活性的藥劑包括經(jīng)由導(dǎo)向功能介導(dǎo)細(xì)胞毒性，從而間接抑制生長(zhǎng)因子受體生物功能的抗體。與受體復(fù)合的抗體激活血清互補(bǔ)序列和/或介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性。與受體結(jié)合的抗體還可與毒素(免疫毒素)偶聯(lián)。優(yōu)選可較大程度抑制受體功能的抗體，例如通過(guò)結(jié)合受體的配體結(jié)合位點(diǎn)的立體鄰近地區(qū)(阻斷受體)，和/或以阻礙(阻斷)配體與受體的結(jié)合的方式結(jié)合生長(zhǎng)因子。這些抗體是利用常規(guī)選擇抗體的體外方法選擇的，其中所述抗體中和受體的功能。通過(guò)模擬配體而作為配體激動(dòng)劑起作用的抗體是通過(guò)進(jìn)行對(duì)本領(lǐng)域那些技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的適當(dāng)測(cè)定而被棄去的。對(duì)于某些腫瘤細(xì)胞而言，所述抗體可抑制自分泌生長(zhǎng)周期(即，細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子，然后與相同細(xì)胞的受體結(jié)合)。既然某些配體，例如TGF-α，是在細(xì)胞膜中發(fā)現(xiàn)的，那么起導(dǎo)向功能的抗體可針對(duì)配體和/或受體。免疫毒素的細(xì)胞毒性部分可以是細(xì)胞毒性藥物，或細(xì)菌或植物來(lái)源的酶活性毒素，或這種毒素的酶活性片段。所用酶活性毒素及其片段是白喉毒素，白喉毒素的非結(jié)合活性片段，外毒素(來(lái)源于綠膿假單胞菌)，蓖麻毒蛋白，相思豆毒蛋白，modeccin，α-八疊球菌，Aleuritesfordii蛋白，dianthin蛋白，美國(guó)商陸蛋白(ΡΑΡΙ,ΡΑΡΙΙ，和PAP-S)，苦瓜抑制劑，麻瘋樹(shù)毒蛋白，巴豆毒蛋白，sapaonariaoff icinals抑制劑，gelonin，mitogellin，局限曲菌素，酚霉素，和依諾霉素。在另一實(shí)施方案中，所述抗體與小分子抗癌藥物偶聯(lián)。單克隆抗體與這種細(xì)胞毒性部分的偶聯(lián)是利用各種雙功能蛋白偶聯(lián)劑進(jìn)行的。這種試劑的例子是SPDP，IT，亞氨基酯的雙功能衍生物，如二甲基adipimidateHCl，活性酯如辛二酸二琥珀酰亞胺酯，醛如戊二醛，二疊氮基化合物，如雙(對(duì)-疊氮基苯甲?；?己二酰二胺，雙-重氮衍生物，如雙_(對(duì)-重氮苯甲?；?_乙二胺，二異氰酸酯如甲代亞苯基2，6- 二異氰酸酯，和雙-活性氟化合物如1，5_ 二氟-2，4-二硝基苯。毒素的溶解部分可與抗體的Fab片段結(jié)合。用于治療癌癥的細(xì)胞毒性放射性藥物可通過(guò)將放射性同位素與抗體偶聯(lián)而制造。 此處所用術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性部分”含有這種同位素。在另一實(shí)施方案中，用細(xì)胞毒性藥物填充脂質(zhì)體，并用特異性結(jié)合生長(zhǎng)因子受體的抗體涂覆脂質(zhì)體。因?yàn)榇嬖诤芏嗍荏w位點(diǎn)，該方法可遞送大量藥物至適宜的細(xì)胞類型。確切的制劑，給藥途徑和劑量可根據(jù)患者狀況由各主治醫(yī)師選擇。(見(jiàn)，例如，F(xiàn)ingl等，inTh ePharmacologicalBasisofTherapeutics, 1975，Ch. Ip. 1)。值得注意的是，主治醫(yī)師應(yīng)當(dāng)知道根據(jù)毒性，或器官機(jī)能障礙，如何及何時(shí)終止，中斷，或調(diào)整給藥。相反，如果臨床反應(yīng)不夠(排除毒性)，主治醫(yī)師還應(yīng)當(dāng)知道調(diào)整治療到更高的水平。在處理目標(biāo)致癌疾病時(shí)，給藥劑量的多少可根據(jù)所治療疾病的嚴(yán)重程度和給藥途徑而改變。疾病的嚴(yán)重程度可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)預(yù)后評(píng)估方法部分評(píng)估。此外，劑量和大概的給藥頻率將根據(jù)年齡，體重，個(gè)體患者的反應(yīng)而改變。根據(jù)所治療的特定狀況，這種藥劑還可全身或局部配制和給藥。配制和給藥的技術(shù)可在 Remington’ sPharmaceuticalSciences, 18thed.，MackPublishingCo.，Easton, Pa. (1990)中找到。適當(dāng)?shù)耐緩娇砂诜?，直腸，經(jīng)皮，陰道，經(jīng)粘膜，或腸內(nèi)給藥；腸胃外遞送，包括，肌內(nèi)，皮下，髓內(nèi)注射，及鞘內(nèi)，直接心室內(nèi)，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，或眼內(nèi)注射。 用于注射時(shí)，本發(fā)明的藥劑可配制成水溶液，優(yōu)選生理上適合的緩沖液，如Hank’ s溶液， Ringer’ s溶液，或生理鹽水緩沖液。用于這種經(jīng)粘膜給藥時(shí)，制劑中使用了適于滲透過(guò)屏障的滲透劑。這種滲透劑通常是本領(lǐng)域已知的。上面描述了本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)際操作是通過(guò)下面給出的實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例舉例說(shuō)明的。技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到說(shuō)明實(shí)施例中使用的原料和方法可以各種方式進(jìn)行改進(jìn)。這種改進(jìn)也被認(rèn)為落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實(shí)施例實(shí)施例1從FPE組織中分離RNARNA是通過(guò)下列一般過(guò)程從石蠟包埋組織中提取出來(lái)的。A.切片的脫石蠟和水合(1)把約10 μ M的切片的一部分放在1. 5mL塑料離心管中。(2)加入600 μ L 二甲苯，室溫(約20-25°C )用力振搖混合物約10分鐘。(3)室溫時(shí)，以臺(tái)式離心機(jī)的最大速度(約10-20，OOOxg)將樣品離心約7分鐘。(4)重復(fù)步驟2和3，直到絕大部分石蠟溶解。根據(jù)原始樣品部分所含的石蠟量， 通常需要重復(fù)2次或更多次。(5)用低級(jí)醇，優(yōu)選用100%乙醇(約600μ L)用力振搖約3分鐘，除去二甲苯溶液。(6)按照步驟(3)將試管離心約7分鐘。傾出并棄去上清液。顆粒狀物變?yōu)榘咨?7)用更稀釋的乙醇溶液首先用約95%乙醇，然后用約80%乙醇，最后用約70% 乙醇連續(xù)重復(fù)步驟5和6。(8)按照步驟(3)，室溫將樣品離心7分鐘。(9)棄去上清液，室溫干燥顆粒狀物約5分鐘。B.用苯酚-氯仿分離RNA(1)加入400 μ L含0. 5%肌氨酸的異硫氰酸胍溶液和8 μ L 二硫蘇糖醇。(2)然后用組織勻菜器(Ultra-Turrax, IKA-fforks, Inc. ,Wilmington,NC)勻化樣品約2-3分鐘，速度從低速(速度1)到高速(速度幻逐漸升高。(3)然后將樣品在大約95°C時(shí)加熱約5-20分鐘。優(yōu)選在加熱到95°C之前，用細(xì)針刺入含樣品的試管的管帽?？蛇x擇地，管帽可用塑料夾子或?qū)嶒?yàn)用薄膜固定。(4)然后用pH4. 0的50 μ L2M醋酸鈉和600 μ L苯酚/氯仿/異戊醇 (10 1.93 0.036)萃取樣品，其中苯酚/氯仿/異戊醇(10 1.93 0. 036)是用18mL苯酚和3.6mLl 49的異戊醇氯仿溶液新制備的。用力振搖溶液約10秒，然后在冰上冷卻約15分鐘。(5)以最大速度將溶液離心約7分鐘。將上層的(水)相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的試管中。(6)_20°C時(shí)，用約10 μ L糖原和400 μ L異丙醇沉淀RNA30分鐘。(7)通過(guò)在臺(tái)式離心機(jī)中以最大速度離心約7分鐘，而使RNA成為顆粒狀物；傾出并棄去上清液；用大約500 μ L約70-75%的乙醇洗滌顆粒狀物。(8)以最大速度將樣品再次離心7分鐘。棄去上清液，并將顆粒狀物風(fēng)干。然后將顆粒狀物溶解在適宜的緩沖液中，用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)(例如，50pL5mMTris氯化物，pH8. 0)。實(shí)施例2mRNA的逆轉(zhuǎn)錄和PCR逆轉(zhuǎn)錄如實(shí)施例1中舉例說(shuō)明的，RNA是從顯微解剖或非-顯微解剖的福爾馬林固定的石蠟包埋(FPE)組織中分離出來(lái)的，或RNA是根據(jù)制造商的指導(dǎo)，使用 QuickPrep MicromRNA 純化試齊Ll盒(AmershamPharmaciaBiotechInc.，Piscataway, N. J.), 通過(guò)單步異氰酸胍方法，從新鮮或冷凍組織中分離出來(lái)的。用乙醇沉淀并離心后，將RNA顆粒狀物溶解在50 μ LpH8. 0的5mMTris/Cl中。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶可延伸一種寡核苷酸引物，其在脫氧核苷酸存在的情況下與單鏈RNA或DNA模板雜交，產(chǎn)生互補(bǔ)鏈。所得RNA是用來(lái)源于 LifeTechnologies的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)的六聚體逆轉(zhuǎn)錄的。逆轉(zhuǎn)錄是通過(guò)把25 μ LRNA 溶液與25. 5μ L “逆轉(zhuǎn)錄混合物”混合進(jìn)行的(見(jiàn)下面)。將反應(yīng)物放在熱循環(huán)儀中，26°C 時(shí)8分鐘(用于使隨機(jī)的六聚體與RNA結(jié)合)，42°C時(shí)45分鐘(用于M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶促反應(yīng))，95°C時(shí)5分鐘(用于DNA酶的熱滅活)?！澳孓D(zhuǎn)錄混合物”由以下成分組成10μ 15X緩沖液Q50mMTris-HCl， pH8. 3,375mMKCl,15mMMgCl2),0. 5μ 1 隨機(jī)的六聚體(500. D.溶解在 550 μ 1，ρΗ7· 5 的 IOmMTris-HCl 中)，5 μ 1IOmMdNTPs(dATP，dGTP, dCTP 禾口 dTTP)，5 μ 10. 1MDTT， 1. 25 μ IBSA(在 ρΗ7· 5 的 IOmOTris-HCL 中為 3mg/ml)，1. 25 μ 1 RNAGuard24,800U/ml (RNA 酶抑制劑)(目錄號(hào) 27-0816，AmershamPharmacia)和 2. 5 μ 1MMLV200U/ μ 1 (LifeTech 目錄號(hào) 28025-02)。反應(yīng)組分的最終濃度是50mMTris-HCl，pH8.3, 75mMKCl, 3mMMgCl2,1. OmMdNTP, 1. OmMDTT,0. 00375mg/mlBSA,0. 62U/μ IRNAGuard 和 IOU/μ 1MMLV。 mRNA表達(dá)的PCR定量化EGFRcDNA和內(nèi)部對(duì)照或管家基因(例如β -肌動(dòng)蛋白) cDNA 的定量是使用 Heid 等，(GenomeRes 1996 ；6 :986-994) ；Gibson 等，(GenomeRes 1996 ； 6 =995-1001)所述的基于熒光的實(shí)時(shí)檢測(cè)法(ABIPRISM7700或7900序列檢測(cè)系統(tǒng) [TaqMan ], AppliedBiosystems, FosterCity，CA.)進(jìn)行的。簡(jiǎn)言之，該方法使用一種雙重標(biāo)記的產(chǎn)熒光TaqMan 寡核苷酸探針，(EGFR-1773(SEQIDN0 :3)，Tm = 70 0C ； HER2-neu2657 (SEQIDN0 :6)，β-肌動(dòng)蛋白_611(SEQIDN0 :7)，其特異性地在正向和反向引物內(nèi)退火。含反應(yīng)混合物的加蓋孔內(nèi)的激光刺激引起3’猝滅劑染料(TAMRA)發(fā)射，直到探針在PCR延伸過(guò)程中被DNA聚合酶的5’ -3’核酸酶活性裂解，引起5’報(bào)道染料(6FAM)的釋放。因此，擴(kuò)增子的產(chǎn)生引起熒光信號(hào)的發(fā)射，這是通過(guò)TaqMan ，sCCD (電荷耦合器件)檢測(cè)照相機(jī)檢測(cè)的，PCR反應(yīng)純指數(shù)相內(nèi)，閾循環(huán)所產(chǎn)生的信號(hào)量可反映目標(biāo)序列的起始拷貝數(shù)。目標(biāo)序列起始拷貝數(shù)與內(nèi)部對(duì)照基因起始拷貝數(shù)的比較可提供相對(duì)基因表達(dá)水平。TaqMan 分析了產(chǎn)率的水平，它是以兩個(gè)絕對(duì)測(cè)量值間的比值(目標(biāo)基因/內(nèi)部對(duì)照基因)表示的。PCR反應(yīng)混合物由以下成分組成0. 5 μ 1含有如上制備的cDNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物， 600nM 各寡核苷酸引物 EGFR-1753F(SEQIDN0 :1，Tm = 59°C )和 EGFR_1823R(SEQIDN0 :2， Tm = 58 0C )或寡核苷酸引物 HER2-nei^671F(SEQIDN0 4)和 HER2_nei^699R(SEQIDN0 5)，200nMTaqMan 探針(SEQIDN0 :3 或 SEQIDN0 :6)，5UAmpliTaqGold聚合酶，200μM各 dATP, dCTP, dGTP, 400 μ MdTTP, 5. 5mMMgCl2，和含有參考染料的 IxTaqman 緩沖液 A，最終的體積小于或等于25 μ 1 (所有試劑，AppliedBiosystems, FosterCity，CA)。循環(huán)條件是， 95 0C 10分鐘，然后是95°C 15秒和60°C 1分鐘循環(huán)45次。用于定量?jī)?nèi)部對(duì)照基因β-肌動(dòng)蛋白的寡核苷酸是β-肌動(dòng)蛋白_592F(SEQIDN0 :8)和β -肌動(dòng)蛋白-651R(SEQIDN0 :9)。實(shí)施例3測(cè)定EGFR的未校正基因表達(dá)(UGE)進(jìn)行兩對(duì)平行反應(yīng)?！霸囼?yàn)”反應(yīng)和“校準(zhǔn)”反應(yīng)。圖7。EGFR擴(kuò)增反應(yīng)和β-肌動(dòng)蛋白內(nèi)部對(duì)照擴(kuò)增反應(yīng)是試驗(yàn)反應(yīng)。單獨(dú)的EGFR和β-肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增反應(yīng)是在校準(zhǔn)RNA 模板上進(jìn)行的，被稱作校準(zhǔn)反應(yīng)。TaqMan 儀器產(chǎn)生4個(gè)不同的循環(huán)閾(Ct)值試驗(yàn)反應(yīng)的Cte_m_自，和校準(zhǔn)反應(yīng)的Cte_m_自。兩種反應(yīng)的Ct差值是根據(jù)下列公式確定的Δ Ctii9s= Ct腿-Ct0-肌動(dòng)蛋白(“試驗(yàn)”反應(yīng))ACt·= Ct腿_Cte_m動(dòng)蛋白(“校準(zhǔn)”反應(yīng))下一步是按照下列公式計(jì)算2的負(fù)Δ Ct次方。2_Δα試驗(yàn)(“試驗(yàn)，，反應(yīng))2_Δα ■(“校準(zhǔn)”反應(yīng))為了從TaqMan 儀器獲得EGFR的未校正基因表達(dá)，進(jìn)行了下列計(jì)算EGFR的未?；虮磉_(dá)(UGE) = 2_似試驗(yàn)/2_■校準(zhǔn)用已知的相對(duì)EGFR表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化UGE標(biāo)準(zhǔn)化的計(jì)算需要將UGE乘以對(duì)EGFR和特定校準(zhǔn)RNA特異的校正因子(Kkfk)。還可測(cè)定任何一種內(nèi)部對(duì)照基因和任何一種精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA的校正因子KEeFK。優(yōu)選， 使用內(nèi)部對(duì)照基因β-肌動(dòng)蛋白和精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA，人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào) 735017)。已知這些試劑的校正因子Kegfe等于1. 54。標(biāo)準(zhǔn)化是使用AC t方法的改進(jìn)法進(jìn)行的，所述八以方法由六 ？1化(^10巧8切1^， TaqMan 制造商，在merBulletin#2中和上文描述。為了進(jìn)行該過(guò)程，使用上述 TaqMan 方法，分析了 6個(gè)不同F(xiàn)PE試驗(yàn)組織的UGE的EGFR表達(dá)。使用內(nèi)部對(duì)照基因 β -肌動(dòng)蛋白和校準(zhǔn)RNA，人肝總RNA (Stratagene，目錄號(hào)735017)。用各樣品AG221，AG222，AG252，成人肺，PC3，AdCol的已知相對(duì)EGFR表達(dá)水平除以其相應(yīng)的源于TaqMan 的UGE，得到不平均的校正因子K。K不平均的=已知的值/UGE接下來(lái)，求全部K值的平均值，從而確定對(duì)EGFR，校準(zhǔn)RNA即Mratagene人肝總 RNA(Stratagene,目錄號(hào)735017)和β -肌動(dòng)蛋白特異的單一 Kectb校正因子。因此，為了成規(guī)模地測(cè)定與pre-TaqMan EGFR表達(dá)研究一致的，未知組織樣品中的校正相對(duì)EGFR表達(dá)，人們只需用源于TaqMan 儀器的未校正基因表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)乘以Kkfk特異性校正因子，前提是使用相同的內(nèi)部對(duì)照基因和校準(zhǔn)RNA。校正的相對(duì)EGFR表達(dá)=UGExKegfeKkfk可使用任何一種精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA或內(nèi)部對(duì)照基因測(cè)定。未來(lái)來(lái)源的精確預(yù)定量RNA可按照上述方法，相對(duì)于樣品用已知的相對(duì)EGFR表達(dá)校準(zhǔn)或可相對(duì)于先前已經(jīng)校準(zhǔn)過(guò)的校準(zhǔn)RNA，如上述人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)校準(zhǔn)。例如，如果隨后測(cè)定不同的內(nèi)部對(duì)照基因和/或不同的校準(zhǔn)RNA的Kkfk,則人們必須相對(duì)于組織樣品校準(zhǔn)內(nèi)部對(duì)照基因和校準(zhǔn)RNA，其中已經(jīng)測(cè)定了相對(duì)于特定內(nèi)部對(duì)照基因的EGFR表達(dá)水平。這種測(cè)定可使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)pre- TaqMan ,定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行。用這些樣品的已知表達(dá)水平除以它們相應(yīng)的UGE水平，可確定樣品的K值。然后根據(jù)已知樣品數(shù)，求K值的平均值，從而測(cè)定對(duì)不同內(nèi)部對(duì)照基因和/或校準(zhǔn)RNA特異的新 Kegfe。實(shí)施例4測(cè)定HER2-neu的未校正基因表達(dá)(UGE)進(jìn)行兩對(duì)平行反應(yīng)?！霸囼?yàn)”反應(yīng)和“校準(zhǔn)”反應(yīng)。圖7。HER2_neU擴(kuò)增反應(yīng)和 β-肌動(dòng)蛋白內(nèi)部對(duì)照擴(kuò)增反應(yīng)是試驗(yàn)反應(yīng)。單獨(dú)的HER2-neU和β-肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增反應(yīng)是在校準(zhǔn)RNA模板上進(jìn)行的，被稱作校準(zhǔn)反應(yīng)。TaqMan 儀器產(chǎn)生4個(gè)不同的循環(huán)閾(Ct) 值試驗(yàn)反應(yīng)的ctHEK2_neu和Ct0-肌動(dòng)舶，及校準(zhǔn)反應(yīng)的Ct願(yuàn)2__和Ct0-肌動(dòng)蛋θ。兩種反應(yīng)之間的Ct差值是根據(jù)下列公式確定的ACtii驗(yàn)=CWneu-Ct^mage ( “試驗(yàn)”反應(yīng))Δ Ct校準(zhǔn)=Ct願(yuàn)2_neu_Cte_m動(dòng)蛋白(“校準(zhǔn)”反應(yīng))下一步是按照下列公式計(jì)算2的負(fù)Δ Ct次方。(“試驗(yàn)”反應(yīng))廣校準(zhǔn)(“校準(zhǔn)”反應(yīng))為了從TaqMan 儀器獲得HER2-neu的未校正基因表達(dá)，進(jìn)行了下列計(jì)算HER2-neu的未?；虮磉_(dá)(UGE)=廣以試驗(yàn)々-■校準(zhǔn)用已知的相對(duì)HER2_neu表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化UGE標(biāo)準(zhǔn)化的計(jì)算需要將UGE乘以對(duì)HER2-neu和特定校準(zhǔn)RNA特異的校正因子 (KHEE2_neu)。還可測(cè)定相對(duì)于任何一種內(nèi)部對(duì)照基因和任何一種精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA的校正因子KHEK2_mu。優(yōu)選，使用內(nèi)部對(duì)照基因β-肌動(dòng)蛋白和精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA，人肝總RNA (Stratagene，目錄號(hào)735017)。使用β -肌動(dòng)蛋白和精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA，人肝總 RNA (Stratagene,目錄號(hào) 735017)，校正因子 K願(yuàn)2_neu 等于 12·6Χ1(Γ3。標(biāo)準(zhǔn)化是使用ACt方法的改進(jìn)法進(jìn)行的，所述ACt方法是由 AppliedBiosystems，TaqMan 制造商，在UserBulletin#2中和上文描述的。為了進(jìn)行該過(guò)程，使用上述TaqMan 方法，分析了 6個(gè)不同F(xiàn)PE試驗(yàn)組織的UGE的HER2-neu表達(dá)。使用內(nèi)部對(duì)照基因β -肌動(dòng)蛋白和校準(zhǔn)RNA，人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)。用各樣品AG221，AG222, AG252，成人肺，PC3, AdCol的已知相對(duì)HER2_neu表達(dá)水平除以其相應(yīng)的源于TaqMan 的UGE，得到不平均的校正因子K。K不平均的=已知的值/UGE
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接著，求全部K值的平均值，確定對(duì)HER2-neR，校準(zhǔn)RNA，即人肝總 RNA(Stratagene,目錄號(hào)735017)和β -肌動(dòng)蛋白特異的單一 KHEK2_neu校正因子。因此，為了成規(guī)模地測(cè)定與pre- TagMan HER2 -neu表達(dá)研究相一致的未知組織樣品中的校正相對(duì)HER2-neu表達(dá)，人們只需把源于TaqMan 儀器的未校正基因表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)乘以KHEK2_■特異性校正因子，前提是使用相同的內(nèi)部對(duì)照基因和校準(zhǔn)RNA。校正的相對(duì)HER2_neu 表達(dá)=UGExKHER2_neuΚΗΕΚ2_·可使用任何一種精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA或內(nèi)部對(duì)照基因測(cè)定。未來(lái)來(lái)源的精確預(yù)定量RNA可按照上述方法，相對(duì)于樣品，用已知的相對(duì)HER2-neU表達(dá)校準(zhǔn)或相對(duì)于先前校準(zhǔn)過(guò)的校準(zhǔn)RNA，如上述人肝總RNA(Stratagene，目錄號(hào)735017)校準(zhǔn)。例如，如果隨后測(cè)定相對(duì)于不同的內(nèi)部對(duì)照基因和/或不同的校準(zhǔn)RNA的KHEK2_neu， 人們必須相對(duì)于組織樣品校準(zhǔn)內(nèi)部對(duì)照基因和校準(zhǔn)RNA，其中已經(jīng)測(cè)定或公開(kāi)了相對(duì)于特殊內(nèi)部對(duì)照基因的HER2-neu表達(dá)水平。這種測(cè)定可使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)pre- TaqMan ，定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行。用這些樣品的已知表達(dá)水平除以它們相應(yīng)的UGE水平，可確定樣品的K值。然后根據(jù)已知樣品數(shù)，求K值的平均值，從而測(cè)定對(duì)不同內(nèi)部對(duì)照基因和/或校準(zhǔn)RNA特異的新KHEK2_nw。實(shí)施例5患者群體和組織的獲得患者.研究了 83名NSCLC患者，其中男性65名(78. 3% )，女性18名(21.7% ), 平均年齡63. 5 (范圍，34-82)歲。39名(47%)患者患鱗狀細(xì)胞癌，32名(38.6%)患腺癌，12名(14.5%)患大細(xì)胞癌。原發(fā)性腫瘤按照組織病理學(xué)分級(jí)為分化較好的(Gl，l名患者)，中度分化的(G2，18名患者)，和分化較差的(G3，64名患者)。腫瘤分級(jí)是按照國(guó)際抗癌聯(lián)合會(huì)(UICC)TNM分類進(jìn)行的41名4% )患I期腫瘤，16名(19. 3% )患II期腫瘤，和沈名(31.3%)患IIIa期腫瘤。所有腫瘤都被完全切除(R0類)，至少是通過(guò)作為質(zhì)量控制的葉切除術(shù)。組織病理學(xué)IIIa期患者的腫瘤接受手術(shù)后的放療。平均隨訪期為85. 9個(gè)月(最小63. 3個(gè)月 ’最大105. 2個(gè)月)，沒(méi)有患者未被隨訪。組織的獲得。在肺部切除之后，開(kāi)始縱隔淋巴切除術(shù)之前，立即獲得用于進(jìn)行基因表達(dá)分析的組織，并將它立即冷凍在液氮中。分析來(lái)源于下列2個(gè)部位的組織腫瘤和從距離腫瘤最遠(yuǎn)處采集的無(wú)關(guān)肺部組織。6 μ m的冷凍切片采集自腫瘤組織塊，用HE將每5個(gè)切片中的第一個(gè)常規(guī)染色，并評(píng)估其組織病理學(xué)。分析從75%惡性細(xì)胞區(qū)域采集的切片。根據(jù)實(shí)施例2的方法，分離組織樣品的RNA。實(shí)施例6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析TaqMan 分析產(chǎn)生的值以UGE表示。腫瘤組織UGE和與之相匹配的非惡性肺部組織UGE的比值可用于測(cè)定差別基因表達(dá)。兩個(gè)UGE變量之間的關(guān)聯(lián)是使用Wilcox符號(hào)秩檢驗(yàn)測(cè)量的?？ǚ綑z驗(yàn)用于分析分類臨床病理變量之間的關(guān)聯(lián)。危險(xiǎn)比用于計(jì)算死亡的相對(duì)危險(xiǎn)。這些計(jì)算以Pike估計(jì)為基礎(chǔ)，使用觀察到的和預(yù)期的事件數(shù)，按照對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)計(jì)算。Pike, JRStatSocSeriesA135 :201-203 ； 1972。Miller 和 Sigmund(Miller 等， Biometrics38 :1011-1016,1982) R Halpern (Biometrics38 :1017-1023,1982)的最大卡方方法適于測(cè)定哪種表達(dá)值最有利于將患者分成差-和好的預(yù)后小組(在存活可能性方面)，作為統(tǒng)計(jì)量的對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)用于測(cè)量分組的強(qiáng)度。為了測(cè)定P值，其中所述P值被解釋為以最大卡方分析為基礎(chǔ)的相關(guān)強(qiáng)度的測(cè)量值，用1000引導(dǎo)指令樣刺激用于評(píng)估假設(shè)無(wú)關(guān)情況下的最大卡方統(tǒng)計(jì)量分布。Halpern，Biometrics38 1017-1023，1982。進(jìn)行在單變量分析中顯著因素的Cox’s比例危險(xiǎn)模型用于鑒定哪個(gè)因素的可能對(duì)存活具有顯著的影響。顯著性水平被定為P < 0. 05。HER2-neumRNA的表達(dá)是在83(100% )個(gè)正常肺和83 (100 % )個(gè)腫瘤樣品中， 通過(guò)定量實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)的。以HER2-neu和β -肌動(dòng)蛋白PCR產(chǎn)物之間的比值表示的校正HER2-neumRNA表達(dá)，在正常肺中為4. 17Χ1(Γ3(范圍0. 28-23. 86Χ 1(Γ3)，在腫瘤組織中為 4·35Χ1(Γ3(范圍0· 21-68. IlXlO-3) (P = 0. 019Wilcoxon 檢驗(yàn))。通過(guò) Miller 和 Siegmund(Miller 等，Biometrics38 1011-1016，1982)及 Halpern(Biometrics38 1017-1023，1982)的最大卡方方法確定的閾值1. 8可將患者分成低和高差別HER2-neu表達(dá)。依據(jù)這種標(biāo)準(zhǔn)，29名(34.9%)患者具有高水平的差別HER2-neu表達(dá)，54名(65.1%) 患者具有低水平的差別HER2-neU表達(dá)。圖4表示臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)與差別HER2-neU基因表達(dá)狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)。沒(méi)有檢測(cè)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。圖1表示存活的估計(jì)概率對(duì)差別 HER2-neumRNA表達(dá)狀態(tài)的KaplanMeier圖。與高水平差別HER2_neu表達(dá)組的31. 1個(gè)月 (95% C. I. 21. 96-40. 24)相比，低差別HER2-neu表達(dá)組沒(méi)有達(dá)到中值存活。為了測(cè)定P 值，引導(dǎo)指令樣刺激用于評(píng)估最大卡方統(tǒng)計(jì)分布，在檢驗(yàn)數(shù)據(jù)之后，選擇了 1.8的閾值。所得校正后的P值為.004 (對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn))。HER2-neu作為預(yù)后因素的準(zhǔn)確率是通過(guò)下面的Cox’s比例危險(xiǎn)模型分析測(cè)定的。 在潛在預(yù)后因素的單變量分析中，高差別HER2-neU表達(dá)和晚期pT(腫瘤期)分類，ρΝ(淋巴結(jié)期)分類，和腫瘤期是明顯不利的預(yù)后因素(圖5)。在預(yù)后因素的多變量分析中(圖 6)，高差別HER2-neU表達(dá)是明顯且獨(dú)立的不利預(yù)后因素，晚期ρΝ分類和腫瘤期也是如此。EGFRmRNA的表這是在83(100 % )個(gè)正常肺和83(100 % )個(gè)腫瘤樣品中，通過(guò)定量實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)的。中值校正EGFRmRNA表達(dá)在正常肺中為8. 17X IO"3(范圍 0. 31-46. 26X 1(Γ3)，在腫瘤組織中為 7. 22XlCT3(范圍0. 27-97. 49X10’ (P = n. s.)。最大卡方方法(Miller (1982) ；Halpern (1982))確定的閾值1. 8將患者分成低和高差別EGFR 表達(dá)。依據(jù)這種標(biāo)準(zhǔn)，28名(33. 7% )患者具有高水平的差別EGFR表達(dá)，55名(66. 3% ) 患者具有低水平的差別EGFR表達(dá)狀態(tài)。臨床病理學(xué)變量和可檢測(cè)的差別EGFRmRNA表達(dá)狀態(tài)之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(圖4)。在高水平差別EGFR表達(dá)組中，存在著總體存活較低的趨勢(shì)，但沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(圖2)。與高水平差別EGFR表達(dá)組的32. 37個(gè)月(95% C. I. 8. 43-56. 31)相比，低差別EGFR表達(dá)組沒(méi)有達(dá)到中值存活(P = 0. 176)。83名患者中有14名(16.9%)的差別HER2_neu和EGFR表達(dá)水平較高(高于1. 8)。 83名患者中有40名(48. 2% )的HER2-neu和EGFR差別表達(dá)狀態(tài)較低(低于1. 8)，而83 名患者中有14名(16.9%)只是EGFR的差別表達(dá)水平較高，83名患者中有15名(18.1%) 的HER2-neu差別表達(dá)水平較高。與高水平差別EGFR表達(dá)組的45. 47個(gè)月，高水平差別 HER2-neu 表達(dá)組的 31. 10 個(gè)月(95% C. I 14. 77-47. 43)，和高水平差別 HER2_neu 和 EGFR 表達(dá)組的22. 03個(gè)月(95% C. I 2. 30-41. 76，P = O. 003 ；對(duì)數(shù)級(jí)試驗(yàn)，圖3和5)相比，低水平差別HER2-neu和EGFR表達(dá)組沒(méi)有達(dá)到中值存活。單變量分析顯示，高差別HER2-neu 和EGFR共表達(dá)是明顯不利的預(yù)后因素(圖5)。在預(yù)后因素的多變量分析中(圖6)，高差別HER2-neU和高差別EGFR共表達(dá)是明顯且獨(dú)立的不利預(yù)后因素，還有晚期pN分類和腫瘤期也是如此。實(shí)施例7腫瘤對(duì)受體酪氨酸激酶定向化療的反應(yīng)5名結(jié)腸癌患者的腫瘤通過(guò)免疫組織化學(xué)最初被鑒定為表達(dá)EGFR。用400mg/ m2荷載劑量的LnCl0neIMC-C225對(duì)患者進(jìn)行治療，然后是每周250mg/m2，加入相同劑量的 CPT-11，對(duì)先前進(jìn)一步進(jìn)展的患者進(jìn)行治療。維持先前CPT-Il劑量的削減。使用實(shí)施例1-4所述的方法進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)測(cè)定，患者1具有2. 08 ΧΙΟ"3的校正EGFR 表達(dá)水平，并對(duì)受體酪氨酸激酶定向化療完全有效(CR)，所述受體酪氨酸激酶定向化療包括CPT-Il (7-乙基-1044-(1-哌啶子基)-1-哌啶子基]羧基喜樹(shù)堿)/C225( —種有效用于抗癌療法中的抗-EGFR 單克隆抗體；Mendelsohn，EndocrRelatCancer2001Mar ；8(1) 3-9)?；颊?具有8. 04 X ΙΟ"3的校正EGFR表達(dá)水平，并對(duì)受體酪氨酸激酶定向化療部分有效(PR)?；颊?具有1. 47 ΧΙΟ"3的校正EGFR表達(dá)水平，也表現(xiàn)出對(duì)受體酪氨酸激酶定向化療部分有效(PR)?；颊?具有0. 16 X ΙΟ"3的校正EGFR表達(dá)水平，并具有對(duì)受體酪氨酸激酶定向化療無(wú)效的穩(wěn)定疾病(SD)?；颊?沒(méi)有EGFR表達(dá)(0.0X10_3)，并具有對(duì)受體酪氨酸激酶定向化療無(wú)效的進(jìn)展性疾病(PR)。見(jiàn)圖9。
權(quán)利要求
1.一種由SEQ ID NO :1的序列或基本上與其相同的寡核苷酸組成的寡核苷酸引物。
2.—種由SEQ ID NO :2的序列或基本上與其相同的寡核苷酸組成的寡核苷酸引物。
3.—種由SEQ ID NO :4的序列或基本上與其相同的寡核苷酸組成的寡核苷酸引物。
4.一種由SEQ ID NO :5的序列或基本上與其相同的寡核苷酸組成的寡核苷酸引物。
5.由SEQID NO 1的序列或基本上與其相同的寡核苷酸和SEQID NO 2的序列或基本上與其相同的寡核苷酸組成的寡核苷酸引物對(duì)。
6.由SEQID NO :4的序列或基本上與其相同的寡核苷酸和SEQID NO :5的序列或基本上與其相同的寡核苷酸組成的寡核苷酸引物對(duì)。
7.—種檢測(cè)ETOR基因表達(dá)的試劑盒，其含有權(quán)利要求5的寡核苷酸引物對(duì)。
8.—種檢測(cè)HER2-neU基因表達(dá)的試劑盒，其含有權(quán)利要求6的寡核苷酸引物對(duì)。
9.一種檢測(cè)HER2-neu和ETOR基因表達(dá)的試劑盒，其含有權(quán)利要求5的寡核苷酸引物對(duì)和權(quán)利要求6的寡核苷酸引物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于醫(yī)學(xué)，特別是癌癥化療中的預(yù)測(cè)方法。本發(fā)明目的是提供一種通過(guò)檢測(cè)患者腫瘤細(xì)胞中HER2-neu和/或EGFR mRNA的量，并把它與那些基因的預(yù)定閾表達(dá)水平進(jìn)行比較，從而評(píng)價(jià)固定或固定且石蠟包埋的組織中HER2-neu和/或EGFR的表達(dá)水平，并預(yù)測(cè)患者腫瘤對(duì)使用受體酪氨酸激酶定向化療方案進(jìn)行治療的可能敏感性的方法。更特別是，本發(fā)明提供寡核苷酸引物對(duì)EGFR和HER2-neu，及使用它們分別檢測(cè)EGFR和HER2-neu mRNA水平的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102220414SQ20111006505
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2001年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月1日
發(fā)明者K·D·達(dá)南伯格 申請(qǐng)人:應(yīng)答遺傳公司