專利名稱：利用維管特異啟動子控制人工合成的抗菌肽基因的植物表達載體及其培育抗黃萎病棉花 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域。具體涉及維管特異啟動子控制人工合成的抗菌肽基因植物表達載體和含有上述表達載體的轉基因棉花制備方法；此外，本發(fā)明還涉及一種利用基因工程技術提高棉花對黃萎病抗性的方法。
背景技術：
棉花是世界上最重要的天然纖維作物，也是我國關系國計民生的重要物資，棉花產業(yè)對我國紡織工業(yè)乃至整個國民經(jīng)濟發(fā)展都具有舉足輕重的作用。但是，棉花黃萎病自 1935年傳入我國以來，對我國棉花生產的危害逐年加重。黃萎病已成為當前棉花實現(xiàn)高產、穩(wěn)產的主要限制因素。該病屬土傳維管束病害，其特點是分布廣、危害重、寄主范圍廣、 傳播途徑多、病原菌存活時間久，是棉花生產中最具毀滅性的病害之一。更重要的是我國主栽的陸地棉品種缺乏高抗黃萎病的種質資源，生產上一直沒有找到能根治的措施，因此，黃萎病被稱為棉花生產的“癌癥”。生產實踐證明，選育和推廣抗病品種，是防治黃萎病最經(jīng)濟有效，而且是唯一有效的途徑(顧本康等，1996)。歷經(jīng)幾十年的努力，利用常規(guī)育種手段，我國獲得了部分對黃萎病具有一定抗病能力的地方品種，但是由于黃萎病菌變異快、小種多、具有明顯的致病力分化，針對黃萎病菌這種特性的廣譜抗性棉花品種基本沒有，因此在一個地區(qū)表現(xiàn)為抗病的棉種，到不同生理和地理條件下，就出現(xiàn)抗病性喪失的現(xiàn)象。另一方面，陸地棉栽培種內高抗黃萎病的抗源缺乏，直接導致了我國棉花抗黃萎病育種進程緩慢，特別是抗落葉型黃萎病育種基本沒有進展。為此，解決生產中抗黃萎病資源缺乏的問題和尋找新的抗病育種方法已迫在眉睫，急需獲得具有廣譜和持久抗性的抗源以減輕棉花生產中黃萎病造成的巨大損失。隨著分子生物學的發(fā)展，利用基因工程分離、克隆和轉化抗性基因，不僅可以定向性地改良植物的抗病性，而且基因型來源豐富，不受抗源親緣關系限制，育種周期短，理論上不存在性狀負相關連鎖，一次克隆亦可用于多次轉化。因此，采用生物技術等多種育種方法，加快抗黃萎病育種進程成為必然?？咕鞍谆蚩咕?AMP，antimicrobial protein or ρ印tide)是一類由生物產生的具有抗菌活性的蛋白或多肽，廣泛分布于動物、植物和微生物中，具有抗菌譜廣、抗菌活性高和抗性持久等特點。另外，抗菌肽的抗菌機制特別，多以在膜上形成孔道導致細胞內容物泄漏的方式摧毀病原菌，致使病原菌難以產生抗性(Yeaman等，2003)。因此，利用抗菌蛋白或抗菌肽提高植物的抗病性受到廣泛關注。植物抗病分子育種策略中，利用來自植物的抗菌蛋白或抗菌肽提高植物的抗病性是最常用的方法之一，因為植物來源的抗菌肽轉入植物中更易于受體植物的識別和整合。但是植物來源的抗菌肽轉入植物后病原菌易產生抗性或具有病原特異性，因此，要獲得對不同生理小種的黃萎病菌具有廣譜和持久抗性相對比較困難。而人工合成的非植物源的抗菌蛋白或抗菌肽卻能克服植物源抗菌肽的這種不足，但是這類抗菌蛋白或抗菌肽可能會嚴重影響植物的生長發(fā)育。比如，郭余龍等(2003)利用基因槍將抗菌肽基因Cim轉入棉花，轉基因棉花葉片呈黃綠相間的條紋狀，電鏡掃描結果顯示，CEMA抗菌肽嚴重影響葉綠體片層結構。植物基因工程中，控制基因表達啟動子的選擇方面，常常首先選用組成型表達的 CaMV35S啟動子，實現(xiàn)外源基因超量表達以研究基因的功能。但是，具體到抗病基因工程，常常根據(jù)不同病害的特點，組織特異或誘導表達所需要的目標抗菌蛋白或抗菌肽，以抵抗病原菌的入侵或抑制病原菌的生長。如，Rajesh Narhari Patkar (2006)等，利用誘導型啟動子PAL調控Z7l5-ZTP-^iie基因在水稻中表達，有效提高了轉基因水稻對稻瘟病等多種病害的抗性。棉花黃萎病菌主要從植株的根部開始侵染，然后隨著植株根、莖和葉片各部位的維管組織向植株上部逐漸擴展，條件合適的情況下，可以發(fā)展至植株頂部，造成整個植株發(fā)病甚至死亡，造成嚴重減產和降低纖維品質。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種既能提高植物的抗病性，又不影響植物生長發(fā)育的利用維管管特異啟動子AAP2控制人工合成的抗菌肽基因spCEMA的植物表達載體。本發(fā)明利用基因工程方法，將AAP2啟動子和抗菌肽基因同時構建入適宜的表達載體內，即獲得了本發(fā)明的ΑΑΡ2啟動子控制抗菌肽基因的植物表達載體。獲得的植物表達載體具有圖3 P5-AAP2-spCEMA所示的結構特征。將這個載體轉入植物內，即可獲得維管特異表達基因的轉基因植物。本發(fā)明的另一個目的是提供同時含有維管特異啟動子ΑΑΡ2和抗菌蛋白基因 spCEMA的轉化體。利用基因工程方法將上述植物表達載體轉化適宜的宿主即可獲得本發(fā)明的轉化體。本發(fā)明的又一目的是提供一種培育抗黃萎病轉基因棉花的方法。本發(fā)明所提供的培育抗黃萎病轉基因棉花的方法，是利用根癌農桿菌介導法將維管特異啟動子AAP2控制 spCEMA基因的重組植物表達載體P5-AAP2-spCEMA導入棉花細胞中，經(jīng)組織培養(yǎng)、轉基因植物分子驗證，以及室內室外的抗病鑒定和篩選獲得對黃萎病抗性提高的轉基因棉花。本發(fā)明提供的培育抗黃萎病棉花的方法的目的這樣實現(xiàn)的一種利用維管特異啟動子控制抗菌蛋白基因的植物表達載體，其特征在于，為含有維管特異啟動子AAP2控制抗菌蛋白基因spCEMA的植物表達載體，從擬南芥中提取總DNA后進行PCR擴增，擴增產物再與pUC-T載體連接，然后轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆得到擬南芥ΑΑΡ2 基因的啟動子，該啟動子長2136bp，以其取代植物表達載體p5-spCEMA上的組成型啟動子 CaMV35S，構建一個新的植物表達體，命名為p5-AAP2_spCEMA。進一步，所述的植物表達載體，利用電擊法轉化根癌農桿菌，獲得的含有 p5-AAP2-spCEMA 的重組菌。進一步，所述的植物表達載體，利用根癌農桿菌介導法進行遺傳轉化，獲得的含有 p5-AAP2-spCEMA所述植物表達載體的轉基因細胞系。進一步，所述的植物表達載體在制備轉基因抗黃萎病棉花中的應用。進一步，含有p5-AAP2-spCEMA所述植物表達載體的轉基因棉花制備方法，包括下列步驟
步驟1 將維管特異啟動子AAP2序列、抗菌肽基因spCEMA序列可操作地分別插入表達載體中，構建植物表達載體；
步驟2 將步驟1所述植物表達載體轉入宿主根癌農桿菌，獲得轉化體； 步驟3 通過轉化體將植物表達載體整合入棉花內，獲得轉基因棉花； 步驟4 轉基因棉花經(jīng)室內抗病鑒定和性狀分離篩選，獲得抗病性狀穩(wěn)定遺傳的純合型轉基因棉花；
步驟5 抗病性遺傳穩(wěn)定的純合型轉基因棉花再經(jīng)田間抗病鑒定和篩選獲得抗黃萎病的轉基因棉花新資源。進一步，一種培育抗黃萎病棉花的方法，其特征在于，將上述p5-AAP2-spCEMA植物表達載體分別轉入棉花基因組，實現(xiàn)抗菌蛋白基因在轉基因棉花維管組織中特異表達， 提高棉花對黃萎病的抗病能力。培育的轉基因棉花材料對落葉型和非落葉型黃萎病的病情指數(shù)小于15，可較非轉基因對照降低85%以上。本發(fā)明的有益效果在于，利用基因工程技術首先構建了維管特異啟動子AAP2控制抗菌肽基因勸的植物表達載體，然后將植物表達載體轉入棉花基因組。再生植株經(jīng)嚴格的分子生物學驗證后，4-6片真葉的U1和T2代幼苗分別于人工氣候室內接種高濃度的落葉型黃萎病菌，經(jīng)抗性鑒定和篩選獲得抗性提高株系ASP-21，并篩選獲得不再分離的純合轉基因株系。純合株系再于田間接種落葉型和非落葉型黃萎病菌，進一步對轉基因棉花的抗性穩(wěn)定性進行鑒定。純合T3代田間抗病鑒定結果顯示，苗期轉基因株系與野生型對照相比，接種落葉型和非落葉型黃萎病菌的病情指數(shù)都可以降低85%以上。植株生長后期莖內部組織的病情指數(shù)顯示，各部位莖內部組織的病情指數(shù)與對照相比，亦都可以降低80%以上。轉基因株系植株莖內部組織的變褐現(xiàn)象主要集中在下部莖段的中部維管組織，周圍木質部部分沒有肉眼可見的病癥，而野生型對照植株莖內部各部位都嚴重褐化。說明spCEMA在維管組織內表達可有效抑制棉花黃萎病菌在植株內部滋生，進而提高棉花對黃萎病的抗性。植株生長觀察和纖維品質檢測的結果表明，基因在轉基因棉花維管組織內特異表達既不影響植株的生長發(fā)育和育性，同時也不影響棉花纖維品質。因此，利用本發(fā)明培育抗黃萎病棉花的方法獲得的轉基因棉花不僅可以提高對黃萎病的抗病能力，而且獲得的材料可以應用于棉花生產。本發(fā)明利用來自擬南芥的維管特異啟動子AAP2控制抗菌肽基因5/^·，達到抗菌肽基因在轉基因棉花植株維管組織內特異表達的目的，有效控制棉花黃萎病菌在植株內的進一步侵染和擴展，達到了抗黃萎病的目的。本發(fā)明方法簡便易行，效果顯著，獲得的抗黃萎病棉花材料可以為棉花抗黃萎病育種提供新的資源，服務于棉花生產，并產生巨大的經(jīng)濟效益。本發(fā)明方法不僅適用于培育抗黃萎病的棉花，同樣也適用于其它具有維管組織危害特征的抗病材料的培育。


圖1是p5-AAP2-spCEMA表達載體構建流程圖。
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圖2是p5雙元植物表達載體改造圖譜。圖3是轉基因棉花葉柄和葉片組織GUS化學染色結果；
A和C 轉基因棉花植株葉片和葉柄；B和D 野生型棉花植株葉片和葉柄。圖4是spCEMA轉基因棉花PCR檢測結果；
M: Marker2000 ；1:野生型植株對照；2水對照；3質粒陽性對照；4_13 AAP2: -spCEMA轉基因植株。黑色箭頭示150bp的特異擴增帶。圖5是轉基因棉花中spCEMA基因轉錄表達的RT-PCR檢測結果；
1轉基因非純合株系中分離的⑶S陰性非轉基因植株(null);2-7: AAP2·. ..spCEMA轉基因棉花株系；spCEMA:以轉基因和⑶S陰性植株cDNA為模板擴增spCEMA基因的結果； HIS:以轉基因和⑶S陰性植株cDNA為模板擴增基因的結果；RNAas template:以 RNA為模板擴增基因的結果。spCEMA基因擴增30個循環(huán)，基因擴增20個循環(huán)。圖6是人工氣候室接種落葉型黃萎病菌15d，AAP2: -.spCEMA轉基因棉花 ；、T1和 T2代株系的病情指數(shù)；
Null 未純合轉基因棉花株系中分離的非轉基因棉花植株；ASP-21 :AAP2: -.spCEMA轉基因棉花株系。圖7是人工氣候室接種落葉型黃萎病菌15d，AAP2: -.spCEMA轉基因棉花植株表型；
Null 未純合轉基因棉花株系中分離的非轉基因棉花植株；spCEMA :AAP2: -.spCEMA轉基因棉花植株。圖8是田間接種落葉型黃萎病菌30d，AAP2::577C￡·轉基因棉花株系的發(fā)病率和病情指數(shù)；
Null 未純合轉基因棉花株系中分離的非轉基因棉花植株；ASP-21 :AAP2: -.spCEMA轉基因棉花株系。圖9是田間接種落葉型黃萎病菌30d，AAP2: -.spCEMA轉基因棉花植株表型。圖10是田間接種落葉型黃萎病菌的植株生長后期莖內部組織的病情指數(shù)； Null 未純合轉基因棉花株系中分離的非轉基因棉花植株；ASP-21 :AAP2: -.spCEMA轉
基因棉花株系。圖11是田間接種落葉型黃萎病菌的植株生長后期莖內部組織的表型。圖12是田間接種非落葉型黃萎病菌30d，AAP2: -.spCEMA轉基因棉花的發(fā)病率和病情指數(shù)；
Null 未純合轉基因棉花株系中分離的非轉基因棉花植株；ASP-21 :AAP2: -.spCEMA轉基因棉花株系。圖13是田間接種非落葉型黃萎病菌30d，AAP2: -.spCEMA轉基因棉花的表型。圖14是田間接種非落葉型黃萎病菌的植株生長后期莖內部組織的病情指數(shù)； Null 未純合轉基因棉花株系中分離的非轉基因棉花植株；ASP-21 :AAP2: -.spCEMA轉
基因棉花株系。圖15是田間接種非落葉型黃萎病菌的植株生長后期莖內部組織的表型。
具體實施例方式下面結合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，但以下說明并不對本發(fā)明進行限定，任何對本發(fā)明的變形和改變，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應屬于本發(fā)明所附權利要求所定義的范圍。本發(fā)明實施實例中的藥品試劑未進行具體說明的均為國產常規(guī)化學試劑，材料方法未進行具體說明的均參考《分子克隆實驗指南》(Sambrook和Russell，2001)。1、DNA 的提取
1.1 DNA提取緩沖液
(1)植物DNA提取緩沖液 CTAB 提取液100 mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)，20 mmol/L EDTA (pH8. 0)，1. 5 mol/ L NaCl，2% CTAB (w/v)，4% PVP40 (w/v)和2%巰基乙醇(ν/ν)，PVP和巰基乙醇使用前加入。TE 溶液10mmol/L Tris-HCl ρΗ8· 0，1 mmol/L EDTA。(2)堿裂解法質粒提取緩沖液
STE溶液0. 1 mol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),1 mmol/L EDTA (pH 8.0)。溶液I :50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),10 mmol/L EDTA (ρΗ8· 0)。溶液II :0. 2 mol/L NaOH, 1% (w/v) SDS。溶液III 50 mL 5 mol/L 乙酸鉀，11. 5 mL 冰醋酸，28. 5 mL 水。1. 2 質粒DNA的提取
根癌農桿菌質粒DNA的提取按盧圣棟方法(1993)略作修改。取根癌農桿菌菌液1 mL，10, 000 r/min離心1 min收集菌體；用200 mL STE重懸菌體后，離心(10000 r/min, 1 min)收集菌體；加入180 mL溶液I和20 mL溶菌酶重懸菌體，37° C溫浴30 min，加入400 mL溶液II，上下顛倒多次，冰浴不超過3 min ；再加入 300 mL冰預冷的溶液III，上下顛倒多次，冰浴3 min。12，000 r/min,4° C離心10 min, 將上清液轉入另一離心管中；等體積的酚氯仿異戊醇(2524:1)和等體積的氯仿異戊醇(24:1)先后各抽提一次；再將上清液轉入另一離心管，加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫靜置2 min ；12 000 r/min、4° C離心10 min收集沉淀DNA，然后用75%的乙醇洗滌沉淀一次；室溫干燥，50 mL TE溶解沉淀即得到質粒DNA。1. 3植物基因組DNA的提取方法
采用改良的CTAB法(Doyle，1987;肖月華等，2002a)提取植物組織DNA，方法為 植株幼嫩葉或莖等組織0. 5-lg，在液氮中迅速研成粉末，加入3 mL 65°C預熱的CTAB 提取液，快速振蕩混勻，65°C水浴30 min，加入1 mL 5 mol/L KAc冰浴20 min。用等體積的氯仿異戊醇(24:1)抽提1次，10, OOOrpm, 4°C離心5min,上清液加入2/3倍體積-20°C 預冷的異丙醇，混勻，-20°C靜置30 min，用玻棒挑出絮狀沉淀，并用75%的乙醇反復漂洗數(shù)次，再用無水乙醇漂洗一次，風干后重懸于500 μ L TE溶液。加入10mg/mL的RNaseA 2 μ L, 37°C處理lh，然后用酚(pH8. 0)氯仿異戊醇(25:24:1)和氯仿異戊醇(24:1)各抽提一次，10，OOOrpm, 4°C離心5min，上清液加入2倍體積的無水乙醇進行沉淀，離心棄上清液。 沉淀用75%的乙醇漂洗，風干，溶于200 μ 1 TE, -20 °C保存?zhèn)溆谩?、棉花RNA的提取2.1 RNA提取緩沖液
CTAB 提取緩沖液2%CTAB (w/v)，2% 聚乙烯吡咯烷酮 PVP40 (w/v)，1 OOmmo 1/ L Tris-HCl (pH8. 0，DEPC 處理的水配制)，25mmol/L EDTA，0. 5g/L 亞精胺 Spermidine, 2. Omol/L恥(1，^)巰基乙醇(￥八，使用前加入)。SSTE溶解液lmol/L NaCl，0. 5%SDS(w/v), lOmmol/L Tris-HCl(pH8. 0)，1. Ommo 1/ L EDTA02. 2 RNA 提取方法
用CTAB法提取棉花組織的總RNA。取約3g棉花組織新鮮材料，在液氮中迅速研成粉末， 裝入DEPC水處理的50ml離心管，然后加入15ml 65°C預熱的RNA提取液，顛倒混勻后65°C 水浴:3min，8，000 rpm、4° C離心10 min，將上清液轉入一新的DEPC水處理的50ml離心管， 用等體積的氯仿異戊醇(24:1)抽提兩次。10，OOOrpmm，室溫離心5min后取上清液，加入 1/4體積10 mol/L LiCl溶液，4°C放置6h以上，10，OOOrpm, 4° C離心10 min，棄上清液， 沉淀用500yL SSTE溶解。再用等體積的酚(pH4. 5):氯仿異戊醇(25: : 1)和氯仿異戊醇(24:1)各抽提一次，10, OOOrpm,室溫離心5min，上清液加入2倍體積-70° C預冷的無水乙醇，-70° C沉淀30min以上。12，000rpm，4° C離心10 min，棄上清液，沉淀用200 μ L 的DEPC處理水溶解，非變性凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA質量后，-80° C保存3、維管特異啟動子ΑΑΡ2的克隆
3.1維管束特異表達啟動子ΑΑΡ2的PCR克隆
根據(jù)擬南芥Amino acid permease gene2 (AAP2)基因的特點，以擬南芥基因組DNA為模板，序列1和序列2為引物擴增基因的啟動子序列，構建25 μ L的反應體系為IOXEx PCR buffer (無Mg2+) 2. 5 μ L ；2. 5mmol/L dNTPs 2 μ L ；25mmol/L MgCl2(氯化鎂)2 μ L ；引物 1(5 μ mol/L) 2μ L ；弓丨物 2(5ymol/L) 2 μ L ;Ex Taq DNA 聚合酶 IU ；基因組 DNA 約 60ng。PCR 反應條件94°C 5min; 94°C Imin ； 50°C Imin ； 72°C 2min 30sec (每循環(huán)一次溫度降低 1°C); 94°C Imin； 40°C Imin; 72°C 2min 30sec (25 個循環(huán))；72°C IOmin03. 2擴增產物的回收
PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳定量，用DNA片段回收試劑盒(Roche)回收擴增片段，所有操作均按試劑盒說明書進行。3. 3連接和轉化
將PCR擴增獲得的AAP2回收片段按連接酶試劑盒說明書克隆到PUC-T(TaKaRa)載體。 然后將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，按常規(guī)方法篩選陽性克隆，鑒定質粒和插入的片段。3. 4序列分析
將獲得的ΑΑΡ2啟動子片段進行序列測定，結果表明，PCR所得片段全長2148bp，AAP2 啟動子片段長2136bp，測序結果見序列7。4、spCEMA植物表達載體的構建
4.1 AAP2: -.spCEMA植物表達載體的構建
為了構建AAP2 -.spCEMA植物表達載體，利用EcoR I和Hind III分別雙酶切pMUlspCEMA和p5表達載體質粒，將35S控制577C·基因的表達元件分別克隆到p5植物表達載體，獲得p5-35S-spCEMA，簡寫為p5_spCEMA。然后再將目標基因表達元件的35S啟動子置換為AAP2啟動子，即獲得AAP2: -.spCEMA植物表達載體，并命名為ρ5-AAP2。 構建流程圖見圖1。所有限制性內切酶均購自Roche公司，按照使用說明書操作完成。P5植物表達載體為改選常用的PBI121載體而得，改造的流程圖見圖2。4. 2植物表達載體質粒轉入根癌農桿菌LBA4404
參考Bio-RAD MicroPulser用戶說明書，將構建的維管組織特異表達577C·基因的植物表達載體P5-AAP2-577C·通過電擊轉化法導入根癌農桿菌LBA4404。提取農桿菌質粒， 并利用BamH I和I^st I進行雙酶切驗證，獲得農桿菌LBA4404轉化子。5、棉花的遺傳轉化
5. 1根癌農桿菌介導的棉花遺傳轉化常用培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基MSB (MS 無機鹽+B5 有機)(Τ· Murashige, 1962 ；0. L. Gamborg, 1968)； 種子萌發(fā)培養(yǎng)基1/2 MSB+20g/L蔗糖+6g/L瓊脂，自來水配制，自然pH; 共培養(yǎng)培養(yǎng)基MSB+0. 5mg/L IAA (吲哚乙酸)+0. lmg/L KT (6-糠氨基嘌呤)+30g/L 葡萄糖+100ymol/L 乙酰丁香酮+2.0g/L Gelrite (Sigma)，ρΗ5· 4 ；
篩選脫菌培養(yǎng)基MSB+0. 5mg/L IAA+0. lmg/L KT+75mg/L Km (卡那霉素)+500mg/L cef (頭孢霉素)+30g/L 葡萄糖 +2. Og/L Gelrite，pH5. 8 ；
愈傷誘導培養(yǎng)基MSB+0. 5mg/L IAA+0. lmg/L KT+75mg/L Km+200mg/L cef +30g/L 葡萄糖 +2. Og/L Gelrite, pH5. 8 ；
胚性愈傷誘導培養(yǎng)基MSB+0. lmg/L KT+30g/L 葡萄糖 +2. Og/L Gelrite, pH5. 8 ； 液體懸浮培養(yǎng)基:MSB+1. 91g/L硝酸鉀+0. lmg/L KT+30g/L葡萄糖，ρΗ5· 8 ； 體胚成熟培養(yǎng)基MSB +15g/L 蔗糖+15g/L 葡萄糖 +0. lmg/L KT+2. 5g/L Gelrite, pH6. O ；
成苗培養(yǎng)基:SH +0. 4g/L活性碳+20g/L 蔗糖，pH6. O。(Schenk & Hildebrandt, 1972)
5. 2棉花遺傳轉化具體操作方法
(1)轉化外植體的獲得和農桿菌浸染液的制備
陸地棉種子去殼，籽仁0. 1%升汞滅菌lOmin，無菌自來水漂洗5_6次后，接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基，28°C暗培養(yǎng)5-7d。無菌下胚軸切成3-5mm長的切段，作為轉化外植體。(2)轉化用農桿菌浸染液的制備
利用劃線法獲得整合植物表達載體p5-AAP2-spCEMA的農桿菌單菌落，然后挑取單菌落接種入附加50mg/L Km和125mg/L Sm (鏈霉素)IOmL液體YEB培養(yǎng)基(5g/L蔗糖，lg/L 細菌用酵母抽提物，10g/L細菌用胰化蛋白胨，0. 5g/L MgS04*7H20，pH7.0)J8°C、200rpm培養(yǎng)過夜，然后按5%的比例將菌液接種入20mL不含抗生素的液體YEBJ8°C、200rpm培養(yǎng)至 0D600約為0. 5。取5mL菌液6000rpm離心5min收集菌體，再用5mL不添加Gelrite共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基重懸菌體，重懸菌液即為浸染外植體的農桿菌浸染液。(3)下胚軸的遺傳轉化和胚性愈傷的誘導
外植體用農桿菌浸染液浸染20min，傾去菌液，再用無菌濾紙吸去外植體表面多余的菌液，浸染后的下胚軸切段接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基，26°C暗培養(yǎng)2d，將下胚軸接種至篩選脫菌培養(yǎng)基，20d后繼代入附加卡那霉素(Km)和頭孢霉素(cef)的愈傷誘導培養(yǎng)基進行愈傷的誘導，間隔20d繼代一次，60d后繼代入胚性愈傷誘導培養(yǎng)基，獲得胚性愈傷后進行液體懸浮培養(yǎng)，以獲得大量生長一致的胚性愈傷。(4)體胚的誘導和成苗培養(yǎng)
液體懸浮培養(yǎng)的胚性愈傷，30目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，篩下的胚性愈傷均勻分散地接種入體胚成熟培養(yǎng)基，約15d產生大量的體胚，將其繼代入SH培養(yǎng)基，促進體胚進一步成苗。3-4 葉的再生苗移栽入溫室進行繁殖。6、AAP2 -.spCEMA轉基因棉花的獲得和分子驗證
按照上述5的棉花遺傳轉化和再生方法，將AAP2 -spCEMA轉入棉花基因組。歷經(jīng)Km 抗性愈傷、胚性愈傷和體胚的誘導，體胚成苗，然后獲得AAP2: -spCEMA轉基因棉花植株。6. 1轉基因植株的⑶S組織化學染色
GUS 染色液500mg/L X-Gluc，0. lmol/L K3Fe (CN) 6,0. lmol/L K4Fe (CN)6,1% Triton X-100 (v/v),0. Olmol/L Na2EDTA, 0. lmol/L 磷酸緩沖液(pH7. 0)。AAP2:植物表達載體均含有35S啟動子控制的Gtt 基因，因此，轉基因植株首先可以利用⑶S組織化學染色法進行快速鑒定。參照Jefferson (1987)的方法剪取Km 抗性幼苗的葉柄和葉片組織少許，分別加入GUS組織化學染色液中，37°C染色池，然后95% 乙醇脫色，至綠色去凈。最后出現(xiàn)圖3所示的藍色為轉基因陽性植株，否則為非轉基因植株。6. 2 AAP2 \spCEMA 轉基因棉花 PCR 分析
以棉花幼嫩葉片為材料，提取轉基因植株和野生型植株的總DNA，然后以總DNA為模板，序列3和4為引物擴增基因片段。PCR 反應 25 μ 1 總體系，包括 IXPCR buffer, 1. 5mmol/L 的 MgCl2,0. 2mmol/L 的 dNTPs，上下游引物均為 0. 2ymol/L，25ng DNA, IU Taq DNA 聚合酶。PCR反應參數(shù):94°C預擴增 5min，然后 94°C，30s ；55°C，30s ；72°C,60s ；30 個循環(huán)， 最后再72°C延伸lOmin。擴增產物1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。部分擴增結果見圖4。結果表明，所有經(jīng)GUS檢測為陽性的轉基因植株都能擴增獲得目標特異帶。6. 3 spCEMA 的 RT-PCR 分析
AAP2- -spCEMA轉基因棉花植株分別以幼嫩莖段為材料，提取轉基因和非轉基因植株 (nul 1)的RNA，按cDNA —鏈合成試劑盒說明書合成各樣品RNA的一鏈cDNA，然后以cDNA為模板擴增spCEMA基因的特異片段。spCEMA基因的上下游引物分別為序列3和序列4。以棉花組蛋白基因為內標。的引物為序列5和序列6 (Zhu YQ等，2003)。25 μ 1 PCR 反應體系包括1XPCR buffer, 1. 5mmol/L 的 MgCl2,0. 2mmol/L 的 dNTPs，上下游引物均為 0. 2ymol/L，25ng DNA, IU Taq DNA 聚合酶。RT-PCR結果表明(圖5)，轉基因棉花植株內spCEMA基因都能有效進行轉錄表達， 而野生型植株內都沒有檢測到基因的表達。7、轉基因棉花對黃萎病的抗病鑒定方法 7. 1抗病鑒定接種用病原菌的制備
挑取少許固體PD培養(yǎng)基(馬鈴薯培養(yǎng)基)保存的落葉型和非落葉型黃萎病菌接種入液體PD培養(yǎng)基，180rpm，振蕩培養(yǎng)7d，再按10% (菌液/PD培養(yǎng)基)的比例接種入液體PD 培養(yǎng)基，180rpm，^TC振蕩培養(yǎng)10d，用四層無菌紗布過濾去除菌液中的菌絲及雜質，去離子水調整落葉型黃萎病菌孢子濃度達到IO8個/ml，非落葉型黃萎病菌孢子濃度達到IO9個/ ml作為接種菌液。7. 2人工氣候室內抗病鑒定方法
T0代轉基因棉花4-6片真葉，其余世代3-4片真葉，生長相對一致的幼苗植株采用傷根灌菌液法接種病原菌。移栽入盆缽慢慢澆灌菌液IOOmL,盡量讓菌液濕潤有棉花植株的土壤團，接種兩天后澆透水，以保持盆缽內土壤的濕度。接種后于20°C (夜)_25°C (晝)，濕度 80%以上，14h光照/IOh暗培養(yǎng)的光周期條件下生長，接種15d按5級病級標準(0級棉花植株外表無病癥 ’1級:棉株葉片1/3以下顯病癥；2級棉株葉片1/3-2/3顯病癥；3 級棉株葉片2/3以上顯病癥；4級棉株葉片全部出現(xiàn)病癥，葉片和花蕾脫落嚴重或植株光桿甚至死亡)統(tǒng)計植株病級，并計算植株的發(fā)病率和病情指數(shù)。T0代每次接種均以野生型和空載載體轉基因棉花幼苗為對照。其余各世代以野生型和未純合株系分離的GUS陰性非轉基因植株為對照。落葉型黃萎病菌接種濃度為IO8個孢子/ml，非落葉型黃萎病菌接種濃度為IO9個孢子/ml。
苷穌出現(xiàn)病癥植襪數(shù)^innci.. 發(fā)病率=接種植襪總數(shù)Xl0° °
權利要求
1.利用維管特異啟動子控制人工合成的抗菌肽基因的植物表達載體，其特征在于，為含有維管特異啟動子AAP2控制人工合成抗菌肽基因SpCEMA的植物表達載體；提取擬南芥總DNA后進行PCR擴增，再與pUC-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆得到擬南芥ΑΑΡ2基因的啟動子，然后以其取代植物表達載體p5-spCEMA上的組成型啟動子CaMV35S，構建一個新的植物表達體，命名為p5-AAP2_spCEMA。
2.利用維管特異啟動子控制人工合成的抗菌肽基因的植物表達載體，其特征在于，為含有維管特異啟動子AAP2控制人工合成抗菌肽基因的植物表達載體，以來自擬南芥AAP2基因的啟動子取代植物表達載體p5-spCEMA上的組成型啟動子CaMV35S，構建一個新的植物表達體，命名為p5-AAP2-spCEMA。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的植物表達載體，利用電擊法轉化根癌農桿菌，獲得的含有所述p5-AAP2-spCEMA的重組菌。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的植物表達載體，利用根癌農桿菌介導法進行遺傳轉化，獲得的含有所述p5-AAP2-spCEMA植物表達載體的轉基因細胞系。
5.權利要求1或2所述的植物表達載體在制備轉基因抗黃萎病棉花中的應用。
6.權利要求1或2所述的植物表達載體在制備抗維管束病害轉基因植物中的應用。
7.含有權利要求1或2所述植物表達載體的轉基因棉花制備方法，包括下列步驟步驟1 將維管特異啟動子AAP2序列、抗菌肽基因序列可操作地分別插入表達載體中，構建植物表達載體；步驟2 將步驟1所述植物表達載體轉入宿主根癌農桿菌，獲得轉化體；步驟3 通過轉化體將植物表達載體整合入棉花內，獲得轉基因棉花；步驟4:轉基因棉花經(jīng)室內抗病鑒定和性狀分離篩選，獲得抗病性狀穩(wěn)定遺傳的純合型轉基因棉花；步驟5 抗病性遺傳穩(wěn)定的純合型轉基因棉花再經(jīng)田間抗病鑒定和篩選，獲得抗黃萎病的轉基因棉花新資源。
8.一種培育抗黃萎病棉花的方法，其特征在于，將權利要求1或2所述植物表達載體分別轉入棉花基因組，實現(xiàn)抗菌肽基因在轉基因棉花維管組織中特異表達，提高棉花對黃萎病的抗病能力。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用維管特異啟動子控制人工合成的抗菌肽基因的植物表達載體及其培育抗黃萎病棉花的方法。該方法是將AAP2維管特異啟動子控制下的人工合成的抗菌肽基因spCEMA整合到棉花基因組，實現(xiàn)spCEMA基因在棉花維管組織內特異表達，顯著提高棉花對黃萎病的抗病性。應用這一方法獲得的轉基因棉花純合株系病圃內接種黃萎病不同的致病菌，病情指數(shù)小于15，可較非轉基因對照降低85%以上。
文檔編號C12R1/01GK102174570SQ20111006486
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月17日 優(yōu)先權日2011年3月17日
發(fā)明者侯磊, 宋水清, 李先碧, 李德謀, 羅小英, 羅明, 肖月華, 裴炎, 龍琴 申請人:西南大學