專利名稱：水稻干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子oxhs4p的鑒定和利用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種植物逆境特異誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的分離鑒定和應(yīng)用。通過(guò)分離和鑒定一個(gè)水稻根中干旱誘導(dǎo)型基因的啟動(dòng)子，可以將其應(yīng)用于植物的基因工程中，以達(dá)到植物遺傳改良特別是提高植物抗旱性的目的。
背景技術(shù)：
隨著全球環(huán)境惡化、氣候異常，干旱脅迫是造成作物減產(chǎn)的重要原因之一，日益危害著糧食生產(chǎn)安全。對(duì)于中國(guó)這樣一個(gè)淡水資源短缺的國(guó)家，干旱對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、甚至對(duì)社會(huì)生活造成了極其嚴(yán)重的影響。提高植物抗旱性一直以來(lái)都是一個(gè)長(zhǎng)期而艱巨的任務(wù)。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因已經(jīng)成為研究功能基因組學(xué)的有效手段，并且通過(guò)轉(zhuǎn)基因途徑改良植物抗逆性近年來(lái)正逐步得到可行性論證和普遍接受。已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)在植物中超量表達(dá)逆境應(yīng)答相關(guān)基因能夠在一定程度上提高植物的抗逆 t生(Saijo 等，Over-expression of a single Ca2+-dependent protein kinase confers both cold and salt/drought tolerance on rice plants. Plant J 23 :319-327, 2000 ；Zhang 等，Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana， AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt， drought， oxidation and cold tolerance. Plant Mol Biol 68(1-2) :131-143,2008 ；Hou A homolog of human ski-interacting protein in rice positively regulates cell viability and stress tolerance. Proc Natl Acad Sci 106(15) :6410-6415,2009 ；Ma Enhanced tolerance to chilling stress in 0sMYB3R_2 transgenic rice is mediated by alteration in cell cycle and ectopic expression of stress genes. Plant Physiol 150(1) :244_56，2009)。但是報(bào)道中的這些超量表達(dá)通常用的都是組成型啟動(dòng)子，盡管組成型啟動(dòng)子超量表達(dá)效應(yīng)高，但通常會(huì)伴隨著不可避免的負(fù)面效應(yīng)，如對(duì)植物產(chǎn)生毒害或負(fù)擔(dān)或者使轉(zhuǎn)基因植 tt · (Shavindra Transgenic approaches to increase dehydration-stress tolerance in plants. Mol Breed 5 :493_503，1999)。盡管已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道從植物中
Win (Yamaguchi Characterization of the expression of
a desiccation-responsive rd29 gene of Arabidopsis thaliana and analysis of its promoter in transgenic plants. Mol Gen Genet 23 :331-340,1993 ；Kasuga 等，A combination of the Arabidopsis DREBlA gene and stress-indueibIe rd29A promoter improved drought—and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Physiol 45 :346-350,2004 ；Xiao 等，Over-expression ofa LEA gene in rice improves drought resistance underthe field conditions.TheorAppl Genet 115(1) :35_46，2007)，但是這些啟動(dòng)子在植物的各組織器官中均有廣泛的表達(dá)，難以避免轉(zhuǎn)基因植株所造成的食品安全性問(wèn)題。組織特異性啟動(dòng)子由于其表達(dá)的空間特異性而具有許多組成型啟動(dòng)子所不具備的特點(diǎn)，將外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中定位表達(dá)不但可以降低植物負(fù)擔(dān)、減輕對(duì)作物農(nóng)藝性狀的影響，還可以提高外源基因在特定部位的濃度，增加轉(zhuǎn)基因的效果。因此，挖掘一些組織特異性表達(dá)并受干旱誘導(dǎo)的啟動(dòng)子在改良作物抗旱育種上具有十分重要的意義。XHS基因是一類植物中特有的基因家族，在植株的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境應(yīng)答中發(fā)揮著多種功能(Mourrain等，Arabidopsis SGS2 and SGS3 genes are required for posttranscriptional gene silencing and natural virus resistance. Cell 101(5) :533-42,2000 ;Bateman 等，The SGS3 protein involved in PTGS finds a family,BMC Bioinformatics3(21) :1741-2105, 2002 ;Qin 等，Systematic identification of Xl-homologous genes reveals a family involved in stress responses in rice. Plant Mol Biol 71(4-5) :483-96,2009)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克隆、鑒定一個(gè)在根中特異表達(dá)，并受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的植物內(nèi)源啟動(dòng)子，并利用該啟動(dòng)子構(gòu)建抗旱相關(guān)基因表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化方法達(dá)到提高植物的抗逆性的目的。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)施首先是分離受干旱強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)的候選基因的啟動(dòng)子。所選擇的候選基因是水稻內(nèi)源基因XHS家族的一員，命名為0XHS4。該基因在水稻品種明恢63的苗期干旱脅迫中受到強(qiáng)烈的上升誘導(dǎo)表達(dá)(Qin 等，Systematic identification of Xl-homologous genes reveals a family involved in stress responses in rice.Plant Mol Biol 71(4-5) 483-96,2009) (Κ0ΜΕ注釋號(hào)AKM2745)。所分離的該基因的啟動(dòng)子來(lái)源于水稻品種“中花 11”，申請(qǐng)人將其命名為0XHS4P。0XHS4P啟動(dòng)子是具有圖1中堿基第1-1620位的序列； 在444-449、1424-14 堿基位點(diǎn)含有與干旱相關(guān)的應(yīng)答元件MYB2C0NSENSUSAT (Abe等， Arabidopsis AtMYC2(bHLH)and AtMYB2 (MYB) function as transcriptional activators in abscisic acid signaling. Plant Cell 15 :63_78，2003)。在 649-655，674-679 堿基位點(diǎn)含有與干旱相關(guān)的應(yīng)答元件 MYCATERDl (Simpson 等，Two different novel cis-acting elements of erdl， a clpA homologous Arabidopsis gene function in induction by dehydration stress and dark-induced senescence. Plant J 33 :259-270,2003 ； Tran 等,Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress. Plant Cell 16 :2481-2498,2004)，在 64-69、206-211、549-554、649-654、674-679、892-897、984-989、1290-1295、1386-1391、 1483-1488、1575-1580堿基位點(diǎn)含有與干旱相關(guān)的應(yīng)答元件MYCCONSENSUSAT (Oh等， Arabidopsis CBF3/DREB1A and ABF3 in transgenic rice increased tolerance to abiotic stress without stunting growth. . Plant Physiology 138 :341-351,2005 ； Chinnusamy 等，Molecular genetic perspectives on cross-talk and specificity in abiotic stress signalling in plants.J Exp Bot. 55 :225-236,2004)。 另外，在854-858，1490-1494，1556-1560堿基位點(diǎn)含有與根特異表達(dá)相關(guān)的應(yīng)答元件 R00TM0TIFTAPOX1 (Elmayan T 等，Evaluation in tobacco of the organ specificity and strength of the rol D promoter， domain A of the 35S promoter and the 35S2 promoter. Transgenic Res 4 :388-396,1995)。
本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子0XHS4P區(qū)域含有多個(gè)與干旱相關(guān)的順式作用元件(如圖 1所示)，能特異性地對(duì)干旱起應(yīng)答反應(yīng)。申請(qǐng)人利用0XHS4P啟動(dòng)子構(gòu)建的GUS表達(dá)載體 (如圖2所示)，轉(zhuǎn)化水稻受體品種中花11，可以在轉(zhuǎn)基因植株受到干旱脅迫時(shí)強(qiáng)烈地誘導(dǎo)報(bào)告基因GUS的表達(dá)(如圖3所示)。本發(fā)明的效果詳見(jiàn)具體實(shí)施方式
。詳細(xì)的技術(shù)方案如下所述一種分離出的水稻DNA分子，其核苷酸序列如圖1和序列表SEQ ID NO :1所示，其中啟動(dòng)子0XHS4P包含圖1和SEQ ID NO 1所示的序列中的1-1620位堿基的核酸序列。所述的一種分離的DNA分子，其特征在于區(qū)域內(nèi)除基本啟動(dòng)子元件外 (TATA-box)，還包含多個(gè)干旱應(yīng)答順式作用元件(MYB2C0NSENSUSAT、MYCATERD1、 MYCCONSENSUSAT)的組合以及根中特異表達(dá)元件R00TM0TIFTAPOX1。所述的0XHS4P啟動(dòng)子全部或部分序列可用于構(gòu)建水稻表達(dá)載體。所述的0XHS4P啟動(dòng)子全部或部分序列構(gòu)建水稻表達(dá)載體，可通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化方法培育改良植物。所述的0XHS4P啟動(dòng)子全部或部分序列可用于構(gòu)建水稻表達(dá)載體，其可以通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化培育抗逆植物的遺傳材料。所述的抗逆植物的材料是指植株、種子或細(xì)胞無(wú)性系。按照以上的技術(shù)方案，申請(qǐng)人或申請(qǐng)人以外的其他人可以利用本發(fā)明所提供的 0XHS4P啟動(dòng)子構(gòu)建抗逆相關(guān)基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物以提高植物的抗旱性。受體植物可以是包括水稻、小麥、玉米等在內(nèi)的禾谷類作物以及一些其他的重要經(jīng)濟(jì)作物，例如玉米、棉花、油菜或番茄等。


序列表SEQ ID NO :1，是本發(fā)明克隆的水稻啟動(dòng)子0XHS4P的序列，序列長(zhǎng)度為 1620bp。圖1 顯示的是0XHS4P啟動(dòng)子序列。下劃線序列為擴(kuò)增0XHS4P啟動(dòng)子所用的引物序列；陰影部分顯示的是基本啟動(dòng)子元件序列；波浪線表示的是干旱應(yīng)答元件核心序列； 根特異表達(dá)元件用斜體并加下劃線表示。圖2 顯示的是本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體pCAMBIA1391Z-0XHS4P表達(dá)載體。該載體含潮霉素抗性篩選基因，啟動(dòng)子0XHS4P被融合到GUS基因5’端非翻譯區(qū)。圖3 顯示的是0XHS4P啟動(dòng)子控制下的⑶S基因在在正常和干旱脅迫處理下的表達(dá)活性。A和B是正常條件下⑶S分別在主根和側(cè)根根尖中的表達(dá)；C-E，20X目鏡下觀察在正常條件⑶S在根尖中的表達(dá)；F-G，20X目鏡下觀察在干旱脅迫條件⑶S在根尖中的表達(dá)。圖4 顯示的是0XHS4P啟動(dòng)子控制下的⑶S基因在干旱脅迫處理下的表達(dá)水平。 TGU TG2和TG3是pl391Z-0XHS4P轉(zhuǎn)化中花11得到的3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性家系，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別是脅迫0、15min、30min。
具體實(shí)施例方式1、0XHS4P啟動(dòng)子分離和鑒定通過(guò)水稻品種“明恢63”(來(lái)自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，見(jiàn)《遺傳資源來(lái)源披露登記表》)的干旱誘導(dǎo)基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)受干旱顯著誘導(dǎo)的基因，其TIGR(http://rice, plantbiology. msu. edu/) ID 為 L0C_0s02gl9130，被命名為 0XHS4 (Qin 等，Systematic identification of Xl—homologous genes reveals a family involved in stress responses in rice. Plant Mol Biol 71(4-5) :483-96, 2009)，對(duì)應(yīng)的 BAC 克隆號(hào)為 AP003988,在 KOME 數(shù)據(jù)庫(kù)(http//cdnaOl. dna. affrc. go. jp/cDNA/)中對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng) cDNA 編號(hào)為AKM2745。下一步就是分離該基因的啟動(dòng)子。具體步驟如下在NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)找到該基因?qū)?yīng)的粳稻“日本晴”的基因組序列(AP003988)并選取該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2Kb的范圍作為候選啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物 0XHS4P_F(5，-taa GAATTC ATGTGTTCCTCTGCTCGC-3，)禾口 0XHS4P_R(5，-taa GGATCC ATGTGTTCCTCTGCTCGC-3，)，并在引物5，端分別添加限制性酶切位點(diǎn)EcoRI和BamHI (用斜體加下劃線表示，酶切位點(diǎn)前的三個(gè)堿基為保護(hù)堿基)。首先利用引物0XHS4P-F和0XHS4P-R 以中花11 (來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所商業(yè)品種，見(jiàn)《遺傳資源來(lái)源披露登記表》)基
DNA (CTAB^^i^, Zhang^, genetic diversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis. Theor Appl Genet，83，495-499，1992)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20uL GC buffer I體系(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)，反應(yīng)條件是94°C預(yù)變性 5min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 2mim, 32 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min。 PCR產(chǎn)物連入pGEM-TCasy載體上(來(lái)源見(jiàn)《遺傳資源來(lái)源披露登記表》)，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序(ABI3730測(cè)序儀，Applied Biosystem，測(cè)序在國(guó)家植物基因中心[武漢]完成)，結(jié)果證實(shí)所擴(kuò)增序列為預(yù)期的0XHS4P啟動(dòng)子序列，其包含多個(gè)干旱應(yīng)答順式作用元件(如圖1)。2、0XHS4P啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的水稻遺傳轉(zhuǎn)化本發(fā)明的實(shí)施方案就是構(gòu)建0XHS4P啟動(dòng)子的GUS基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到水稻品種“中花11”中，定性、定量地檢測(cè)0XHS4P啟動(dòng)子在干旱脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)水平。具體操作如下首先將分離的0XHS4P啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物連入pGEM-TCasy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a (購(gòu)自Promega公司，見(jiàn)《遺傳資源來(lái)源披露登記表》))并獲得陽(yáng)性克隆。通過(guò)EcoR I和BamH I雙酶切從pGEM_T Easy陽(yáng)性克隆上回收0XHS4P再將其連接到⑶S表達(dá)載體 PCAMBIA1391Z (來(lái)自CAMBIA公開(kāi)使用的載體，載體含有GUS報(bào)告基因，見(jiàn)《遺傳資源來(lái)源披露登記表》)。酶切驗(yàn)證陽(yáng)性克隆并檢測(cè)插入方向正確后，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入到水稻品種“中花11”中，經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、 分化、生根、練苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(粳稻亞種)遺傳轉(zhuǎn)化體系主要應(yīng)用Hiei等人 艮道的方法(參見(jiàn)Efficient transformation of rice,Oryza sativa L., mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA. Plant Journal 6 :271-282,1994)并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行改良優(yōu)化。主要步驟和試劑如下(1)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下 6-BA(6-BenzyIaminoPurine,6-芐基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧節(jié)青霉素)； KT(Kinetin, 1 ] ) ；NAA(Napthalene acetic acid, ΜΖλΜ) ；IAA(Indole-3-acetic acid,吲哚乙酸)；2，4-DQ，4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4- 二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone， Zigt了) ；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate,)；
HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO (Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞砜)；N6max (N6 大量成分溶液)；N6mix (N6微量成分溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSmix (MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培養(yǎng)基大量元素母液[10倍濃縮液(IOX)]的配制硝酸鉀(KNO3)28. 3g磷酸二氫鉀(KH2PO4)4. Og硫酸銨(NH4)2SO4)4. 63g硫酸鎂(MgSO4· 7H20)1. 85g氯化鈣(CaCl2· 2H20)1. 66g逐一溶解，然后室溫下用蒸餾水定容至1000ml。2)N6培養(yǎng)基微量元素母液[100倍濃縮液(100X)]的配制碘化鉀(KI)0. 08g硼酸(H3BO3)0. 16g硫酸錳(MnSO4· 4H20)0. 44g硫酸鋅(ZnSO4· 7H20)0. 15g室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000ml。3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)的配制準(zhǔn)備800ml雙蒸水并加熱至70°C，加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA · 2H20) 3. 73 克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小時(shí)，用蒸餾水定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(100X)配制
煙酸(Nicotinic acid)0. Ig
維生素 Bl (Thiamine HCl)0. Ig
維生素 B6(Pyridoxine HCl)0. Ig
甘氨酸(Glycine)O. 2g
肌醇(Inositol)IOg
用蒸餾水定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆忙?br> 5) MS培養(yǎng)基大量元素母液(10X)的配制
硝酸銨(NH4NO3)16. 5g
硝酸鉀19. Og
磷酸二氫鉀1.7g
硫酸鎂3. 7g
氯化鈣4. 4g
室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000mlO
6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(100X)的配制
碘化鉀0. 083g
硼酸0. 62g
硫酸錳0. 86g
鉬酸鈉(Na2MoO4 · 2H20)0. 025g
硫酸銅(CuSO4· 5H20)O. 0025g室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000ml。7)2,4-D|C存液(lmg/ml)的配制秤取2，4-D IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全 后定容至100ml,于室溫下保存。8)6-BA|C存液(lmg/ml)的配制秤取6-BA IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后 定容至100ml，室溫保存。9)萘乙酸(NAA)貯存液(lmg/ml)的配制秤取NAA IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后 定容至100ml，4°C保存?zhèn)溆谩?0)吲哚乙酸(IAA)貯存液(lmg/ml)的配制秤取IAA IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶 解完全后定容至100ml，4°C保存?zhèn)湓谝粋€(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵 (FeSO4· 7H20) 2. 78g。在另一個(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水。11)葡萄糖貯存液(O. 5g/ml)的配制秤取葡萄糖125g，然后用蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩?2) AS貯存液的配制秤取AS O. 392g, DMSO 10ml，分裝至I. 5ml離心管內(nèi)，4°C保存?zhèn)溆谩?3) IN氫氧化鉀貯存液秤取氫氧化鉀5. 6g，并用蒸餾水溶解定容至100ml，室溫保存?zhèn)溆谩?3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方I)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 貯存液(100X)IOml維生素貯存液(100X)IOml2，4_D 貯存液2.5ml脯氨酸(Proline)O. 3gCHO. 6g鹿糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 貯存液(100X)IOml維生素貯存液(100X)IOml
2，4_D 貯存液2.0ml脯氨酸0. 5gCH0. 6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基N6max 母液(10X)12.5mlN6mix 母液(100X)1.25mlFe2+EDTA 貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4_D 貯存液0.75mlCH0. 15g鹿糖5g瓊脂粉(Agarose)1. 75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng) 基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 u 1 AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。4)共培養(yǎng)基N6max 母液(10X)12.5mlN6mix 母液(100X)1.25mlFe2+EDTA 貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D 貯存液0.75mlCH0. 2g鹿糖5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng) 基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 u 1 AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/每皿)。5)懸浮培養(yǎng)基N6max 母液(10X)5mlN6mix 母液(100X)0.5mlFe2+EDTA 貯存液(100X)0.5ml維生素貯存液(100X)lml2，4_D 貯存液0.2mlCH0. 08g蔗糖2g加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5. 4，分裝到兩個(gè)100ml的三角瓶中，封口滅菌。使 用前加入lml葡萄糖貯存液和100 u 1 AS貯存液。
6)選擇培養(yǎng)基N6max 母液(10X)25mlN6mix 母液(100X)2.5mlFe2+EDTA 貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4_D 貯存液0.625mlCH0. 15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 yl HN和400ppmCN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max 母液(10X)25mlN6mix 母液(100X)2.5mlFe2+EDTA 貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml6-BA 忙存液0.5mlKT 貯存液0.5mlNAA|C存液50 ulIAA|C存液50 ulCH0. 15g鹿糖7. 5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基， 加入250 u 1 HN和200ppm CN,分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。8)分化培養(yǎng)基N6max 母液(10X)100mlN6mix 母液(100X)10mlFe2+EDTA 貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml6-BA 貯存液2mlKT 貯存液2mlNAA 貯存液0.2mlIAA 貯存液0.2mlCHlg蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分裝到 50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。0166]9)生根培養(yǎng)基
0167]MSmax 母液(IOX)50ml
0168]MSmix 母液(100X)5ml
0169]Fe2+EDTA 貯存液(100X)5ml
0170]維生素貯存液(100X)5ml
0171]蔗糖30g
0172]Phytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8。煮沸并定容至1000ml，分裝到生根管中05ml/管)，封口滅菌。(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟1)愈傷誘導(dǎo)(1)將成熟的水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0. 15%氯化汞 (HgCl2)種子表面消毒15分鐘；(2)用滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(4)將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25士 1°C。2)愈傷繼代挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25 士 1°C。預(yù)培養(yǎng)挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度 25 士 1°C。3)農(nóng)桿菌培養(yǎng)(1)在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105 (來(lái)源于CAMBIA，商用菌株)兩天，溫度；(2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28°C搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。5)農(nóng)桿菌侵染(1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；(2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD6J). 8-1. 0 ；(3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，溫度 19-20 "C。6)愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)(1)滅菌水洗滌愈傷至看不見(jiàn)農(nóng)桿菌；(2)浸泡在含400ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；(3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。(第一次潮霉素篩選濃度為 400ppm，第二次以后為250ppm)7)分化(1)將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7周；
(2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度^TC。8)生根剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，光照下培養(yǎng)2-3周，溫度 26°C。9)移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入大田生長(zhǎng)至收種。3、啟動(dòng)子0XHS4P的組織特異性和干旱誘導(dǎo)表達(dá)活性的鑒定申請(qǐng)人:構(gòu)建的P1391Z-0XHS4P載體(如圖2)按上述方法轉(zhuǎn)化水稻“中花11”，得到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株22株。選取3個(gè)轉(zhuǎn)啟動(dòng)子陽(yáng)性家系Tl代種子進(jìn)行潮霉素(HN)抗性篩選發(fā)芽(種子在含100 μ M/L潮霉素的水中浸種2天后置于33度培養(yǎng)箱催芽)，將發(fā)芽的苗子種于面包盒中水培培養(yǎng)至3葉期。取植株的各組織器官(葉，葉鞘和根)浸于⑶S溶液中， 在37°C中反應(yīng)1 后在體式顯微鏡下觀察⑶S的表達(dá)部位和表達(dá)強(qiáng)度。⑶S顯色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GUS在葉和葉鞘中不表達(dá)，只在主根和側(cè)根的根尖部位的伸長(zhǎng)區(qū)和根毛區(qū)表達(dá)。在根尖內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)的表達(dá)部位集中在中柱，在皮層中有少量表達(dá)(見(jiàn)圖幻。取植株進(jìn)行干旱處理，干旱脅迫方法是將植株置于空氣中自然失水，取0min、15min、30min根的樣品，每份樣品取的是該家系的混合樣(不少于6株)。同時(shí)取干旱處理0和30min的根尖置于GUS 溶液中，反應(yīng)1 后在體式顯微鏡下觀察⑶S的表達(dá)部位和表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果顯示⑶S在干旱處理30min根尖中的表達(dá)強(qiáng)度顯著強(qiáng)于在Omin根尖中的表達(dá)，在中柱和皮層中的表達(dá)顯著加強(qiáng)，并且在根毛的表達(dá)也從無(wú)到有(圖幻。表明0XHS4P是受干旱脅迫顯著誘導(dǎo)的。干旱脅迫處理過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)的樣品的總RNA采用TRIZOL試劑(購(gòu)自 ^witrogen公司)提取(提取方法根據(jù)上述TRIZOL試劑說(shuō)明書(shū))，利用反轉(zhuǎn)錄酶SSIII (購(gòu)自^witrogen公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(方法根據(jù)^witrogen公司反轉(zhuǎn)錄酶試劑說(shuō)明書(shū))。以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用引物(5’ -AAACTGCCTGGCACAGCAAT-3’和 5’ -CGAAAACTGTGGAATTGAT-3’ )對(duì)GUS基因進(jìn)行特異的PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)78bp)。同時(shí)用引物(5，-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’ 和 5’ -TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’ )對(duì)水稻 Actinl基因做特異擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)76bp)，以作為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行定量分析。反應(yīng)條件為 950C IOsec, 95°C 5sec,60°C 34seC，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)過(guò)程中進(jìn)行熒光檢測(cè)實(shí)時(shí)定量分析。結(jié)果表明0XHS4P啟動(dòng)子控制下的GUS基因表達(dá)水平受到干旱脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，在三個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因家系中⑶S基因在干旱處理30min根樣品的表達(dá)水平是脅迫前的約4至12倍(如圖
4)。
附錄水培試劑(營(yíng)養(yǎng)液)配方
1、無(wú)機(jī)鹽的大量元素部分(溶液)
DNH4NO391. 4g ；
2) NaH2PO4 · 2H2040. 3g ；
3) K2SO471. 4g ；
4) CaCl288. 6g ；
5) MgSO4 · 7H20324g ；
分別溶解加水稀釋至1L，調(diào)PH = 6. 0，為營(yíng)養(yǎng)液-1。
2、無(wú)機(jī)鹽的微量元素部分(溶液)
MnCl2 · 4H20(NH4) 6Mo7024 ‘ 4H20H3BO3
15g ； 0. 074g ； 0. 734g 0. 035g 0. 031g 7. 7g ； 11. 9g；ZnSO4 · 7H20CuSO4 · 5H20FeCl3 · 6H20C6H8O7分別溶解后加50ml濃硫酸(98%濃度)混合定容至1L，為營(yíng)養(yǎng)液_2。水培培養(yǎng)水稻時(shí)，每4L培養(yǎng)液中加上述營(yíng)養(yǎng)液-1和營(yíng)養(yǎng)液-2各5ml，混勻。本發(fā)明是鑒定一個(gè)在根中特異表達(dá)，并受干旱強(qiáng)烈誘導(dǎo)的水稻XHS基因的啟動(dòng)子，通過(guò)啟動(dòng)子活性定量分析表明，可以將該啟動(dòng)子用于抗逆性相關(guān)基因在水稻等作物中的表達(dá)，從而有效地提高植株的抗逆境性能。
權(quán)利要求
1.一種被干旱誘導(dǎo)并在根中特異表達(dá)的啟動(dòng)子0XHS4P，其核苷酸序列如SEQ ID NO=I 所示。
2.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子0XHS4P在調(diào)控基因在植物的根中特異表達(dá)中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子0XHS4P在調(diào)控基因在植物根干旱誘導(dǎo)表達(dá)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種植物干旱特異誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的分離鑒定和應(yīng)用。通過(guò)分離和鑒定獲得一種在水稻中受干旱誘導(dǎo)并在根中特異表達(dá)的基因的啟動(dòng)子OXHS4P，它具有如序列表SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，序列長(zhǎng)度為1620bp。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以應(yīng)用于植物的基因工程中，以達(dá)到植物遺傳改良特別是提高植物抗旱性的目的。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102586246SQ20111000480
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日
發(fā)明者熊立仲, 覃永華 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)