植物花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子pTaASG033的鑒定和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及分離的DNA，其能夠指導(dǎo)可操作地連接在其下游的核酸在植物花藥中特異轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。另外，本發(fā)明還涉及包含該DNA的表達(dá)盒和植物等，并涉及該DNA的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的，受多種順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調(diào)。啟動(dòng)子是重要的順式作用元件，它是位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)域調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地結(jié)合，確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起關(guān)鍵作用。根據(jù)其驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的不同特點(diǎn)，啟動(dòng)子分為組成型啟動(dòng)子和特異性啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子能在所有細(xì)胞或組織中，不分時(shí)間和空間地啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄；特異性啟動(dòng)子又可分為組織特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其中誘導(dǎo)型啟動(dòng)子平時(shí)不啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄活性很低，但在某些特定的逆境信號(hào)的刺激下，轉(zhuǎn)錄活性能夠顯著地提高。
[0003]外源DNA序列通過(guò)連接到特定的啟動(dòng)子從而啟動(dòng)在植物宿主中的表達(dá)，啟動(dòng)子類型的選擇決定基因的表達(dá)時(shí)間和部位。目前在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的主要是一些組成型的強(qiáng)啟動(dòng)子，比如CaMV 35S啟動(dòng)子和玉米Ubiquitin-1啟動(dòng)子，然而在利用這些啟動(dòng)子誘導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)化水稻等作物以期改良作物的品質(zhì)時(shí)，往往會(huì)由于目的基因表達(dá)的時(shí)間(發(fā)育階段特異性)或空間(組織器官特異性)不能很好地控制而導(dǎo)致改良效果不明顯，或者由于這些組成型啟動(dòng)子誘導(dǎo)基因表達(dá)量太高而對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成影響，這些都是目前利用組成型強(qiáng)啟動(dòng)子結(jié)合功能基因來(lái)改良作物品質(zhì)時(shí)遇到的障礙。
[0004]此外，在研宄某些代謝過(guò)程或調(diào)節(jié)途徑時(shí)，常常需要將同一途徑上的兩個(gè)以上的基因轉(zhuǎn)化到同一個(gè)株系中去，采用轉(zhuǎn)化其中一個(gè)基因得到轉(zhuǎn)基因植株后再轉(zhuǎn)化另外一個(gè)基因，或者兩個(gè)基因分別轉(zhuǎn)化完成后再進(jìn)行雜交，都需要等待較長(zhǎng)的時(shí)間，為了提高效率縮短多個(gè)基因轉(zhuǎn)化的時(shí)間，最近有報(bào)道可以利用新的載體同時(shí)進(jìn)行多個(gè)基因的轉(zhuǎn)化，但是在多基因轉(zhuǎn)化時(shí)如果重復(fù)使用同一個(gè)啟動(dòng)子，也會(huì)由于啟動(dòng)子序列的高同源性可能導(dǎo)致基因沉默。
[0005]近年來(lái)，通過(guò)基因工程調(diào)控植物花粉育性、創(chuàng)造植物雄性不育系及其恢復(fù)系已在一些作物上獲得成功，為作物雜種優(yōu)勢(shì)的利用開(kāi)創(chuàng)了新的前景。目前利用基因工程創(chuàng)造雄性不育的策略主要是利用花粉發(fā)育的特異啟動(dòng)子與外源基因嵌合，構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化植物來(lái)阻斷花粉發(fā)育的過(guò)程從而達(dá)到雄性不育的目的。Mariani等利用煙草花藥絨氈層特異啟動(dòng)子TA29與RNase Tl或Barnase連接構(gòu)建成嵌合基因，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草和油菜，獲得了穩(wěn)定的雄性不育的轉(zhuǎn)化株(Mariani C等，Induct1n of male sterilityin plants by a chimaeric ribonuclease gene，Nature，1990，347:737-741)。隨后，他們又用TA29驅(qū)動(dòng)Barstar基因，創(chuàng)建了上述雄性不育系的恢復(fù)系(Mariani C等，A chimaeric ribonuclease-1nhibitor gene restores fertility to male sterileplants, Nature, 1992，357:384-387)。此外，其他研宄小組利用花藥特異啟動(dòng)子啟動(dòng)反義苯基苯乙烯酮合成酶基因、反義肌動(dòng)蛋白基因、β -1,3-葡聚糖酶基因等在花藥中特異表達(dá)也分別成功地獲得了雄性不育植物(Meer等，Promoter analysis of the chalconesynthase gene of petunia hybrid:a 67bp promoter reg1n directs flower-specificexpress1n, Plant B1l., 1990, 15:95-109 ;李艷紅等，將新的任紅雄性不育基因?qū)胄←溤耘嗥贩N的研宄初報(bào)，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1999，7:255-258 ；Curtis等，Genomicmale sterility in lettuce, a base line for the product1n of F^ybrid, PlantSc1.， 1996， 113:113-119)。
[0006]植物花粉或花藥啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)活性和特異性決定了通過(guò)基因工程手段調(diào)控花粉育性、創(chuàng)造植物不育系及恢復(fù)系的成敗。目前已知的驅(qū)動(dòng)活性高且特異性良好的植物花粉或花藥特異啟動(dòng)子還相對(duì)較少，而小麥因其基因組較大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜等原因，在花粉或花藥發(fā)育分子機(jī)制方面的研宄更加匱乏，因此，對(duì)小麥花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子的克隆和功能分析對(duì)于在小麥中利用基因工程調(diào)控花粉育性、創(chuàng)造植物雄性不育系，從而為小麥雜種優(yōu)勢(shì)資源在小麥育種中的充分利用打下基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種植物花粉發(fā)育晚期花藥特異表達(dá)的啟動(dòng)子序列及克隆并應(yīng)用該啟動(dòng)子的方法。
[0008]取花粉處于減數(shù)分裂期、單核期、雙核期和三核期的小麥花藥，用Trizol (Invitrogen)提取總 RNA，并進(jìn)行 DNaseI (Promega)處理，進(jìn)而純化 mRNA (Amb1n)。將純化的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(Invitrogen)、超聲打斷(Fisher)、制備文庫(kù)(illumina)并擴(kuò)增(illumina)，最后在illumina機(jī)器上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。
[0009]小麥轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序的結(jié)果首先通過(guò)Trinity軟件進(jìn)行序列拼接，得到的拼接序列進(jìn)一步去除冗余以及相似性聚類。對(duì)于拼接得到的轉(zhuǎn)錄本contig的表達(dá)變化分析，各樣品中高通量測(cè)序的序列首先通過(guò)TopHat (http://tophat.cbcb.umd.edu/)軟件與轉(zhuǎn)錄本拼接的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。而后Cufflink軟件能夠計(jì)算比對(duì)上的轉(zhuǎn)錄本contigs的均一化表達(dá)量，用“外顯子每百萬(wàn)比對(duì)片段的千堿基數(shù)(fragments per kilobase of exon modelper mill1n mapped fragments，F(xiàn)PKM)，，表不。
[0010]通過(guò)對(duì)不同發(fā)育時(shí)期小麥花藥的全基因組表達(dá)譜分析，找到花粉處于減數(shù)分離期的花藥中不表達(dá)而在花粉處于單核、雙核和三核期的花藥中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本contig 7187個(gè)。如圖1所示，compl63920_c0_seql(序列如SEQ ID NO:1所示)花粉處于減數(shù)分離期的花藥中不表達(dá)而在花粉處于單核、雙核和三核期的花藥中表達(dá)。將cOmpl63920_c0_Seql所對(duì)應(yīng)的基因命名為 TaASG033 (Anther Specific Gene 036) ο
[0011]小麥?zhǔn)怯葾、B、D三套基因組組成的異源六倍體，基因的平均拷貝數(shù)為2.8個(gè)，其中接近一半的基因(46% )有3-4個(gè)拷貝，12%的基因有1-2個(gè)拷貝，42%的基因拷貝數(shù)彡5個(gè)。從compl63920_c0_seql的序列(如SEQ ID NO:1所示)出發(fā)，利用CerealsDB和IffGSC(Internat1nal Wheat Genome Sequencing Consortium)公布的普通小麥的測(cè)序信息，以及2013年Nature上發(fā)表的小麥祖先烏拉爾圖小麥(Triticum urartu，A基因組供體)和粗山羊草(Aegilops tauschii，D基因組供體)的測(cè)序信息進(jìn)行電子克隆，獲得了 3個(gè) TaASG033 基因，分別命名為 TaASG033_l，TaASG033_2 和 TaASG033_3，其中 compl63920_cO_seql 對(duì)應(yīng)于 TaASG033_2。3 個(gè) TaASG033 基因的 cDNA 序列分別如 SEQ ID NO:2，SEQID N0:3和SEQ ID N0:4所示，三者之間的同源性約為93%。分別設(shè)計(jì)針對(duì)TaASG033_l，TaASG033-2和TaASG033_3cDNA的特異性引物，利用RT-PCR方法，對(duì)這三個(gè)基因在在小麥根、莖、葉、不同發(fā)育時(shí)期的花藥及除花藥以外的其他花器官等多種組織材料中進(jìn)行表達(dá)特異性分析，結(jié)果如圖2所示，TaASG033-l、TaASG033_2和TaASG033_3基因均只在花粉處于單核期、雙核期和三核期的花藥中特異性表達(dá)，在同時(shí)期的其他花器官和根、莖、葉及減數(shù)分裂期的穗子等組織器官中都不表達(dá)，說(shuō)明TaASG033-l、TaASG033-2和TaASG033_3基因是花藥特異表達(dá)、且只在花粉發(fā)育晚期的花藥中特異表達(dá)的基因。
[0012]本發(fā)明還提供了三個(gè)花藥特異表達(dá)的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子通過(guò)以下方法獲得:從 TaASG033-l、TaASG033_2 和 TaASG033_3 基因的 cDNA 序列出發(fā)，利用 CerealsDB 和IffGSC(Internat1nal Wheat Genome Sequencing Consortium)公布的普通小麥的測(cè)序信息，以及2013年Nature上發(fā)表的小麥祖先烏拉爾圖小麥(Triticum urartu, A基因組供體)和粗山羊草(Aegilops tauschii, D基因組供體)的測(cè)序信息進(jìn)行電子克隆，獲得了TaASG033-l、TaASG033_2和TaASG033_3基因的啟動(dòng)子，分別命名為TaASG033_l啟動(dòng)子、TaASG033-2啟動(dòng)子和TaASG033_3啟動(dòng)子，在本發(fā)明中也用pTaASG033_l、pTaASG033_2和pTaASG033-3分別表示這三個(gè)啟動(dòng)子，其長(zhǎng)度分別為2092bp、1997bp和2000bp，序列分別如SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO: 7 所示。
[0013]利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)和PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)TaASG033_l啟動(dòng)子、TaASG033_2啟動(dòng)子和TaASG033-3啟動(dòng)子進(jìn)行順式元件分析。如圖3所示，翻譯起始位點(diǎn)ATG用粗體下劃線表示，以翻譯起始位點(diǎn)ATG的A定義為“+I ”，AGAAA基序用陰影表示，GTGA基序用方框表示。TaASG