專利名稱：一種受高溫誘導的啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬基因工程技術領域，具體涉及一種分離和利用核酸的啟動子片段及其應用。
背景技術：
啟動子是RNA聚合酶能夠識別并與之結(jié)合，從而起始基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列， 通常位于基因上游。一個典型的啟動子包括CAAT2box和TATA2box，它們分別是依賴DNA 的RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點，一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游幾十個堿基處。在核心啟 動子上游通常會有一些特殊的DNA序列，即順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合從而激活 或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。一旦RNA聚合酶定位并結(jié)合在啟動子上即可啟動基因轉(zhuǎn)錄，因此啟 動子是基因表達調(diào)控的重要元件，它與RNA聚合酶及其他蛋白輔助因子等反式作用因子 的相互作用是啟動子調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的實質(zhì)。根據(jù)啟動子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類組 成型啟動子、組織或器官特異性啟動子和誘導型啟動子[路靜等，2004，自然科學進展14 (8) 856-862]。在基因工程領域中，誘導型啟動子的應用具有重要作用。與組成型啟動子與組織 器官特異性啟動子相比，誘導型啟動子有著獨特的優(yōu)點它可根據(jù)需要在植物特定的發(fā) 育階段、組織器官或生長環(huán)境下，快速誘導基因轉(zhuǎn)錄的開與關[路靜等，2004，自然科學 進展14 (8):856-862]。按誘導因素不同分為化學誘導啟動子，對激素響應的啟動子，受發(fā) 育信號和環(huán)境因子調(diào)控的啟動子等。根據(jù)目的基因的特點和研究目的不同，采用與之相適 應的啟動子類型。高溫脅迫在自然條件下廣泛存在，很多生物在長期的進化過程中形成了應對 高溫脅迫的一套防護機制，通常將這種現(xiàn)象稱之為熱激響應。熱激響應的特點是 在體內(nèi)合成一些特殊的“熱激蛋白”，通過穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)和一些生物大分子以及協(xié)
助變性蛋白質(zhì)降解來執(zhí)行保護功能。一些小分子熱激蛋白的啟動子已經(jīng)被廣泛的 應用在一些領域中，如擬南芥私X^Gmhsp 17. 4的啟動子，被用來調(diào) 控植物細胞或器官中次級代謝產(chǎn)物的表達[Shinmyo Aet al. (1998) Metabolic engineering of cultured tobacco cells. Biotechnology and Bioengineering 58:329 -332 ；Yoshida, K. et al. (1995) Heat-inducible expression system for a foreign gene in cultured tobacco cells using the HSP18. 2 promoter of Arabidopsis thaiiana. Applied Microbiology and Biotechnology 44:466—472]禾口/]、#〒 RNAi 白勺 研究(Masclaux, F. et al. (2004) Gene silencing using a heat-inducible RNAi system in Arabidopsis. Biochemical and Biophysical Research Communications 321:364-369)以及 FLP 的熱誘導剪切(Lyznik, L. A. et al. (1995) Heat-inducible expression of FLP gene in maize cells. Plant J. 8:177-186)等。擬南芥hsp70s 由 16個成員組成，其中5個成員在細胞質(zhì)中，2個在葉綠體內(nèi)，3個在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，2個成員在 線粒體中，另外2個在質(zhì)體間質(zhì)中，還有2個至今未知其具體定位。J幼SP7你是細胞質(zhì)內(nèi)HSP70家族的成員之一，已經(jīng)有大量的文獻集中在HSP70的功能上，即在熱激響應中充當 分子伴侶。Simg在2001年用RT-PCR的方式研究HSP70家族每個成員的表達模式[Sung et al. (2001) Comprehensive Expression Profile Analysis of the Arabidopsis Hsp70 Gene Family. Plant Physiology 126: 789 - 800]，其中成員之一的 Ji^SPZ泌的表 達只受熱誘導，而不受低溫誘導，且與發(fā)育階段無關。此外，來源于果蠅的hsp70啟動子可 以驅(qū)動GUS在煙草中表達[Spena, A. et al. (1985) Construction of A Heat-Inducible Gene for Plants Demonstration of Heat-Inducible Activity of the Drosophila Hsp70 Promoter in Plants. Embo Journal 4:2739-2743; Spena, A. and Schel1， J. (1987) The Expression of A Heat-Inducible Chimeric Gene in Transgenic Tobacco Plants. Molecular & General Genetics 206:436-440]。由于熱激現(xiàn)象的普遍存在、熱激響應元件的序列保守性和你啟動子表達 的專一性，本發(fā)明分離了一組你DNA啟動子片段。這些啟動子片段被用于建立一套 高溫誘導基因表達的系統(tǒng)，并在轉(zhuǎn)基因植物中調(diào)控外源基因的表達。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于應用適當?shù)母邷卣T導控制轉(zhuǎn)基因植物和植物組織中基因的選 擇性表達，并由此提供一種受高溫誘導的啟動子及其應用。本發(fā)明提供的受高溫誘導的啟動子，來源于擬南芥中對高溫敏感的基 因,AtHSP70b。將編碼所希望的目的產(chǎn)物基因的核酸序列和一個上述啟動子片段融合得到 重組DNA，用這種重組DNA轉(zhuǎn)化植物，將得到新的轉(zhuǎn)基因植物。在新的植物中該重組DNA中 的目的基因的表達受合適的高溫誘導調(diào)控。本發(fā)明提供的源于擬南芥且對高溫敏感的核酸啟動子片段，在用適當?shù)母邷卣T導 后，具有啟動子片段的轉(zhuǎn)基因植物中與該啟動子片段連接的編碼特定蛋白的基因的表達水 平將會上升。本發(fā)明提供核酸啟動子片段，它調(diào)控SEQID No:l cDNA表達的基因，其核苷酸序列 如 SEQID No:2,SEQID No:3,SEQID No:4,SEQID No:5,SEQID No:6 或 SEQID No:7 所示。這 些序列包含受高溫誘導的調(diào)控元件和不同的組織特異性表達元件等。本發(fā)明還提供一重組DNA載體。該載體含有上述核苷酸序列作為啟動子。該載 體可轉(zhuǎn)化植物，包含本發(fā)明中的一個核酸啟動子片段、與該啟動子相連編碼特定基因的DNA 順序及合適的3’下游序列，使轉(zhuǎn)化該重組載體后的植物在適當?shù)母邷卣T導下，特定基因產(chǎn) 物水平上升。本發(fā)明的還包括用本發(fā)明的重組DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化植物，這種轉(zhuǎn)基因植物用適當?shù)母?溫誘導后可引起編碼選擇的基因產(chǎn)物的DNA順序表達增高，該DNA順序經(jīng)操作連接在所述 啟動子片段的3’端。這樣的轉(zhuǎn)基因植物的種子同樣認定為該發(fā)明的體現(xiàn)。這個發(fā)明的最后一方面包括在植物中引起所選擇的基因產(chǎn)物表達增高的方法，它 有幾個步驟組成a)用上述描述的重組DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化植物；b)用適當?shù)母邷靥幚磙D(zhuǎn)基因植 物；c)使轉(zhuǎn)基因植物在期望的時候增加所選擇的基因產(chǎn)物的表達。


圖1 pCAMBIA1301你系列載體構(gòu)建示意圖。圖2 經(jīng)PCR分析農(nóng)桿菌LBA4404中A tHSP70b啟動子各構(gòu)建物的轉(zhuǎn)化。圖3 洋蔥表皮上pCAMBIA1301 — 1431GUS的瞬時分析。圖4 PCR鑒定轉(zhuǎn)基因BY2細胞中的⑶S基因。圖5各啟動子片段轉(zhuǎn)基因BY2細胞熱激誘導后GUS基因的轉(zhuǎn)錄本分析。
具體實施例方式實施例\AtHSP70b分段啟動子的載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 1. 1 PCR對應的引物序列 PCAMBIA1301-1431 Fl AGTGAGACCACAACCAGCA Rl CGTCGCCATTGTTGCTAA PCAMBIA1301-992 F2 ATCGAGCTCAAAGTACTGGA R2 TACCCATGGATTGTTGCTAA PCAMBIA1301-504 F3 ATCGAGCTCCACATAAACAGC R2
PCAMBIA1301-375 F4 ATCGAGCTCGAAGACGTAAA R2
PCAMBIA1301-218 F5 ATCGAGCTCAACTCTCTTGTA R2
PCAMBIA1301-125 F6 ATCGAGCTCTCGGATTCG R2
PCAMBIA1301
Ygus CAGGAAGTATGGAGCATCAG ^gus TCGTGCACCATCAGCACGTTA (SEQ ID NO: 14)； 1. 2 PCR程序
擬南芥中 JiW/你啟動子 1431bp 的克隆94°C，5min ;94°C，30 sec, 53 "C, 30 sec，72°C，l min 30 sec ；30 個循環(huán)；72°C，5 min。PCR 擴增產(chǎn)物通過 1.5% 瓊 脂糖電泳進行檢測。擬南芥中Jifi5P々％ 18.2 啟動子 685bp 的克隆94°C，5min ;94°C，30 sec,52°C,45 sec,72°C,l min ；30個循環(huán)；72°C，5 min。PCR擴增產(chǎn)物通過1. 5%瓊脂糖電泳進行檢測。以構(gòu)建好的T載體-1431為模板進行系列啟動子缺失時的PCR反應程序 94°C，5min ;94°C，30 sec，55°C，30 sec，72°C，l min ；30 個循環(huán)；72°C，5 min。PCR 擴增產(chǎn)
(SEQID NO:8)
(SEQID NO:9)
(SEQID NO:10)
(SEQID NO:11)
(SEQID NO:12)
(SEQID NO:13)物通過1. 5%瓊脂糖電泳進行檢測。構(gòu)建好的啟動子轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后的鑒定農(nóng)桿菌菌液為模板時，先100°C裂解5分 鐘。PCR程序同上。轉(zhuǎn)化后抗性煙草BY2克隆鑒定GUS的PCR反應程序94°C，5min -MV, 30 sec，52°C，30 sec，72°C，l min ；30 個循環(huán)；72°C，5 min。PCR 擴增產(chǎn)
物通過1.5%瓊脂糖電泳進行檢測。轉(zhuǎn)化后煙草植株鑒定^依的的PCR反應程序同 BY2細胞。圖2是各個轉(zhuǎn)化子的鑒定結(jié)果，說明各片斷已經(jīng)插入到PCAMBIA1301載體的相應
位置上。實施例2利用洋蔥表皮分析pCAMBIA1301 — 1431中GUS的瞬時表達 構(gòu)建好的PCAMBIA1301-1431的載體首先用基因槍的方法在洋蔥表皮上做啟 動子活性分析，同時陽性質(zhì)粒PCAMBIA1301作為正對照。粒子轟擊過的洋蔥表
皮在室溫下暗培養(yǎng)一天之后，在37°C下處理2小時，同時設置室溫條件下培養(yǎng)的洋蔥 表皮作為負對照。如圖3所示，熱激條件下，所構(gòu)建的pCAMBIA1301-1431中插入的1431bp 能夠驅(qū)動⑶S表達，而在室溫條件下培養(yǎng)的洋蔥表皮上沒有⑶S表
達。因此，HSP70b的啟動子1431bp在熱激下有基本的啟動子活性。實施例3煙草BY2細胞的轉(zhuǎn)化及抗性克隆的篩選。3. 1農(nóng)桿菌準備
菌種在添加抗生素的YEB平板上劃線，挑單克隆在相應的液體YEB培養(yǎng) 基上少量制備(根據(jù)需要)，281，225印111，2天。收集農(nóng)桿菌菌液，lml，5000rpm，lOmin， 棄去培養(yǎng)基。等體積的IOmM MgS04(過濾滅菌)重懸菌體沉淀，同上述條件離心，收集菌體， 重復一次。將IM的acetosyringone加入到上述重懸的菌體溶液中至終濃度200 μ Μ,培養(yǎng) 2h。3. 2 BY2細胞和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)
收集繼代后3天的BY2細胞懸浮物，約4毫升體積，同上述制備好的農(nóng)桿 菌IOOlOOyL混勻，27°C，暗，靜置培養(yǎng)2天。3.3共培養(yǎng)后的洗脫和篩選
共培養(yǎng)后的BY2細胞轉(zhuǎn)入到50毫升的無菌離心管中，加細胞繼代的液體 培養(yǎng)基至總體積25毫升，室溫，lOOOrpm，離心5分鐘。收集菌體沉淀，加入25毫升 液體培養(yǎng)基重懸，離心；菌體沉淀用含抗生素的液體培養(yǎng)基(25mg/L hygromycin+250mg/L cefotaxime)重懸，離心。菌體沉淀用10毫升含上述抗生素的液體培養(yǎng)基重懸，加入等體 積無菌的2%的低熔點瓊脂糖(約40°C左右)，混勻。將上述瓊脂糖包被的BY2細胞混合物 倒入固體篩選培養(yǎng)基上(含相同抗生素的液體培養(yǎng)基+0. 9%瓊脂)，至上層培養(yǎng)基凝固，封培 養(yǎng)皿，在27°C，暗培養(yǎng)。三周后可見抗性克隆。3.4 BY2細胞抗性克隆的PCR鑒定
在25mg/L hygromycin的抗性篩選培養(yǎng)基上生長30天左右，含有你基 因6個啟動子片斷和pCAMBIA1301轉(zhuǎn)化的BY2細胞逐漸形成，每個不同的轉(zhuǎn)化事件 中挑選10個獨立的系，用w·說(⑶S)的一對引物Fgus/Rgus進行PCR鑒定。PCR結(jié)果表 明所有的克隆均是陽性的(圖4a)。在此實驗中，設置pCAMBIA1301為正對照，目的在于檢測整個轉(zhuǎn)化體系的有效性。實施例4 RT-PCR檢測熱激處理的不同片段轉(zhuǎn)基因煙草BY2細胞中⑶S基因的 轉(zhuǎn)錄本。4. 1 BY2細胞的熱激處理
挑選經(jīng)PCR鑒定為陽性的BY2細胞，在含有抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取 繼代5天的懸浮培養(yǎng)物，迅速轉(zhuǎn)移至37° C的水浴搖床中熱激處理2小時，對照保 持在25° C的培養(yǎng)條件，轉(zhuǎn)速130轉(zhuǎn)/分鐘。4. 2 RNA 提取
取材料約0. lg。液氮充分研磨后，轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管，加Iml TRI .ol# ( irwitrogen公司)，混勻后，室溫放置15分鐘，加0. 2ml氯仿異戊醇 (24:1)，劇烈搖動15秒后室溫放置5分鐘，13000rpm, 4°C離心15分鐘。取上清液并加入 等體積異丙醇，小心混勻，室溫放置15分鐘，13000rpm，4°C離心15分鐘。70%乙醇洗滌沉 淀，室溫干燥15分鐘。溶解于適量的經(jīng)0. 1% DEPC處理過的ddH20水中，貯存于_80°C備 用。4.3 cDNA第一條鏈的合成
采用上海申能博彩生物技術公司(SHBC)的cDNA第一鏈合成試劑盒，按照操作 指南將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應體系和反應條件分別為2ug制備的總RNA，0.5ul Rnase inhibitor，力口 DEPC 處理過的去離子水至 8. 5ul，2ul 的 Oligo (dT) 18 primer. 65°C，5min,室溫放置 lOmin，13000rpm 簡短離心5s。再依次加入4μ1 5XFirst-Strand buffer,0.5 μ 1 RNase Inhibitor,2 μ 1 IOOmM DTT, 2μ 1 dNTP, 1 μ 1 MMLV Reverse Transcriptase ο小心混勻；37°C反轉(zhuǎn)錄1小時，90°C 5分鐘；冰上冷卻；13000rpm短暫離 心5秒鐘，存放于-20°C待用。4. 4 RT-PCR
根據(jù)BY2細胞actin的亮度，調(diào)整PCR的模板濃度。⑶S基因PCR反應程序94° C， 5min; 94° C (30 s), 55° C (45 s)，72° C (60 s)，各 26 和 30 循環(huán)；72° C，5min。如圖4b所示，AtHSP70b啟動子最小的125bp片斷在30循環(huán)數(shù)下也有轉(zhuǎn)錄， 375bp以上的啟動子有較高的活性。
權(quán)利要求
一基因組DNA分子序列，其特征在于，它調(diào)控SEQID No:1 cDNA表達的基因，其核苷酸序列如SEQID No:2、SEQID No:3、SEQID No:4、SEQID No:5、SEQID No:6或SEQID No:7所示；這些序列包含受高溫誘導的調(diào)控元件和不同的組織特異性表達元件。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子序列在轉(zhuǎn)基因植物中的應用。
3.一組載體，其特征在于它們含有權(quán)利要求1所述的DNA分子序列作為啟動子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于該載體可轉(zhuǎn)化植物，它包含一個核酸啟動 子片段、與該啟動子相連編碼特定基因的DNA順序及合適的3’下游序列，使轉(zhuǎn)化該重組載 體后的植物在適當?shù)母邷卣T導下，特定基因產(chǎn)物水平上升；選擇的基因為編碼GUS的基因。
5.一種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于用權(quán)利要求所述4的載體轉(zhuǎn)化的植物，該轉(zhuǎn)基因植物 用高溫處理引起編碼選擇的基因產(chǎn)物的DNA順序表達增高，該DNA順序經(jīng)操作連接在所述 啟動子片段的3’端。
6.一種由權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因植物獲得的種子。
7.—種在植物中引起所選擇的基因產(chǎn)物表達增高的方法，其特征在于具體如步驟如下a)用權(quán)利要求所述4的載體轉(zhuǎn)化的植物；b)適當?shù)母邷靥幚磙D(zhuǎn)基因植物；c)使轉(zhuǎn)基因植物在期望的時候增加所選擇的基因產(chǎn)物的表達。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程技術領域，具體為一種受高溫脅迫誘導的啟動子及其應用。本發(fā)明包括一種分離和利用核酸的啟動子片段,該啟動子來源于擬南芥對高溫敏感的一個基因,AtHSP70b。將編碼所希望的目的產(chǎn)物基因的核酸序列和一個上述啟動子片段融合得到重組DNA，用這種重組DNA轉(zhuǎn)化植物，將得到新的轉(zhuǎn)基因植物。在新的植物中該重組DNA中的目的基因的表達受高溫誘導調(diào)控。
文檔編號C12N15/63GK101979559SQ201010524219
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者宋賀玲, 梁寧菁, 蒯本科, 魏強 申請人:復旦大學