專利名稱：組合使用Cry1Ca 和Cry1Ab 蛋白用于昆蟲抗性管理的制作方法
組合使用CryICa和CryIAb蛋白用于昆蟲抗性管理
背景技術(shù)：
人類種植谷物用于糧食和能源應(yīng)用。人類還種植許多其它的作物，包括大豆和棉花。昆蟲吃掉并毀壞植物從而破壞了人類的努力。人們每年要花費(fèi)數(shù)十億美元用于控制害蟲，并且它們還會(huì)造成另外數(shù)十億美元的損失。合成的有機(jī)化學(xué)殺蟲劑為用于控制害蟲的主要工具，但是在一些區(qū)域，生物殺蟲劑，例如來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis) (BT)的殺蟲蛋白，發(fā)揮著重要的作用。通過轉(zhuǎn)化Bt殺蟲蛋白基因產(chǎn)生昆蟲抗性植物的能力給現(xiàn)代農(nóng)業(yè)帶來了革命，并提高了殺蟲蛋白及其基因的重要性和價(jià)值。已經(jīng)有數(shù)種Bt蛋白用于產(chǎn)生抗昆蟲的轉(zhuǎn)基因植物，它們現(xiàn)在已經(jīng)被成功地注冊(cè) 并商業(yè)化。這些包括谷物/玉米(corn)中的CrylAb, CrylAc, CrylFa和Cry3Bb,棉花中的CrylAc和Cry2Ab,和馬鈴薯中的Cry3A。表達(dá)這些蛋白的商業(yè)產(chǎn)品表達(dá)單一的蛋白，但是在如下情況下例外，即期望2種蛋白的組合殺蟲譜(例如在玉米中組合CrylAb和Cry3Bb以分別提供對(duì)鱗翅目害蟲和食根昆蟲的抗性)，或者蛋白的獨(dú)立作用使它們可用作在易感昆蟲群體中延遲抗性產(chǎn)生的工具(例如在棉花中組合CrylAc和Cry2Ab以提供對(duì)煙草青蟲(tobacco budworm)的抗性管理)。也就是說，昆蟲抗性轉(zhuǎn)基因植物的一些品質(zhì)雖然使這種技術(shù)被快速而廣泛地采用，但是也帶來了擔(dān)憂，即害蟲群體可能對(duì)這些植物所產(chǎn)生的殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性。已經(jīng)提出了多種策略用于防止(preserve)基于Bt的昆蟲抗性性狀的效用，包括以高劑量使用蛋白質(zhì)并與避難所組合，不同毒素交替使用或者共使用(McGaughey等.(1998)，“B.t. Resistance Management,，，Nature Biotechnol. 16:144-146)。被選擇用于昆蟲抗性管理(IRM)混雜的蛋白質(zhì)需要獨(dú)立地發(fā)揮其殺蟲效果，從而對(duì)一種蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗性不會(huì)賦予對(duì)第二種蛋白質(zhì)的抗性(即對(duì)于蛋白質(zhì)無交叉抗性)。如果例如選擇對(duì)“蛋白A”有抗性的害蟲群體對(duì)“蛋白B”敏感，則人們可以得出結(jié)論，蛋白A和蛋白B無交叉抗性并且它們的組合可有效延遲對(duì)單一蛋白A的抗性。當(dāng)沒有抗性昆蟲群體時(shí)，可以基于假定與作用機(jī)制和交叉抗性潛力相關(guān)的其它特征進(jìn)行評(píng)估。已經(jīng)有提議使用受體介導(dǎo)的結(jié)合來鑒定可能不會(huì)顯示交叉抗性的殺蟲蛋白(van Mellaert等1999)。在這種方法中固有的缺少交叉抗性的關(guān)鍵預(yù)測(cè)子(predictor)是殺蟲蛋白在敏感昆蟲物種中不會(huì)競(jìng)爭(zhēng)受體。在兩種B. t. Cry毒素競(jìng)爭(zhēng)相同受體的情況下，如果昆蟲中的受體發(fā)生突變使得毒素之一不再與該受體結(jié)合從而對(duì)該昆蟲不再具有殺蟲性，則也可能的情況是昆蟲對(duì)第二種毒素(其競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合相同的受體)也有抗性。然而，如果兩種毒素結(jié)合兩種不同的受體，這可以指示昆蟲不會(huì)同時(shí)對(duì)這兩種毒素具有抗性。CrylAb是目前用于轉(zhuǎn)基因玉米中保護(hù)植物免于各種昆蟲害蟲的殺蟲蛋白。CrylAb提供保護(hù)的關(guān)鍵谷物害蟲是歐洲玉米螟。在官方B. t.命名委員會(huì)的網(wǎng)站上列出了其它的Cry毒素(Crickmore等；lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。參見所附的附錄 A。當(dāng)前有接近60個(gè)主要的“Cry”毒素組(Cryl_Cry59)，還有額外的Cyt毒素和VIP毒素等。各數(shù)字組中的很多還有大寫字母的亞群，并且大寫字母亞群又有小寫字母的子亞群。(例如，Cryl具有A-L，而 CrylA 具有 a_i)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明部分地涉及一項(xiàng)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即CrylCa對(duì)蔗螟，包括對(duì)CrylAb有抗性的蔗螟群體非常有活性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到此發(fā)現(xiàn)的益處，可產(chǎn)生CrylCa和CrylAb (包括其殺蟲部分)的植物可用于延遲或防止對(duì)這些殺蟲蛋白單獨(dú)的任何一個(gè)產(chǎn)生抗性。例如，crylFa基因也可與這兩個(gè)基礎(chǔ)配對(duì)基因/蛋白混雜。本發(fā)明還涉及一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)，即CrylCa和CrylAb彼此不會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合來自秋粘蟲(Spodoptera frugiperda;FAff)的腸受體。附圖
簡(jiǎn)述
圖I-CrylAb核心毒素、CrylCa核心毒素和1251-標(biāo)記的CrylCa核心毒素蛋白對(duì) 秋粘蟲BBMV’ s的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。圖2-CrylCa核心毒素、CryIAb核心毒素和1251-標(biāo)記的CrylAb核心毒素蛋白對(duì)秋粘蟲BBMV’ s的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。序列簡(jiǎn)述SEQ ID NO: I-CrylCa 核心 /CrylAb 原毒素嵌合蛋白 1164aa(DIG_152)SEQ ID NO: 2-CrylCa 核心毒素SEQ ID NO:3-CrylAb 核心毒素發(fā)明詳述本發(fā)明部分地涉及令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即CrylCa對(duì)于針對(duì)CrylAb有抗性的蔗螟(SCB;Diatraea saccharalis)群體非常有活性。因此，本發(fā)明部分地涉及令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即CrylCa可用于與CrylAb組合或“混雜”，從而阻止SCB對(duì)這些殺蟲蛋白的任何單獨(dú)一個(gè)產(chǎn)生抗性。換言之，本發(fā)明部分地涉及令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即選擇對(duì)CrylAb有抗性的蔗螟群體對(duì)CrylCa無抗性；對(duì)CrylAb毒素有抗性的鹿螟對(duì)CrylCa易感(即無交叉抗性)。因此，本發(fā)明包括使用CrylCa毒素控制對(duì)CrylAb有抗性的鹿螟群體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到本公開的益處,表達(dá)CrylCa和CrylAb (包括其殺蟲部分)的植物可用于延遲或防止對(duì)這些殺蟲蛋白的任何單獨(dú)一個(gè)產(chǎn)生抗性。本發(fā)明包括使用CryICa保護(hù)甘蔗和其它重要經(jīng)濟(jì)植物物種免于由蔗螟或者由已經(jīng)對(duì)CrylAb產(chǎn)生抗性的蔗螟群體導(dǎo)致的損害和收得率損失(yield loss)。蔗螟也可為谷物/玉米的害蟲。在一些中美洲和南美洲國(guó)家(如巴西和阿根廷)更是如此。因此，例如谷物/玉米也可以根據(jù)本發(fā)明得到保護(hù)。因此，本發(fā)明教導(dǎo)了一種昆蟲抗性管理(IRM)混雜，用以防止或減緩(mitigate)鹿螟對(duì)CrylAb和/或CrylCa產(chǎn)生抗性。此外，使用放射性標(biāo)記的CrylCa和秋粘蟲(Spodoptera frugipera) (FAff)昆蟲組織的受體結(jié)合研究顯示，CrylAb不會(huì)競(jìng)爭(zhēng)CrylCa結(jié)合的高親和性結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)果表明，CrylAb和CrylCa的組合可以用作有效的手段，為產(chǎn)生CrylAb和CrylCa蛋白的植物(例如玉米和甘蔗)減緩昆蟲群體(如FAW和SCB)對(duì)CrylAb和/或CrylCa產(chǎn)生抗性。盡管毒素疊加研究證明，CrylCa蛋白與來自秋粘蟲(S. frugiperda)的BBMV’ s的兩個(gè)蛋白結(jié)合，其中一個(gè)40kDa,另一個(gè)44 kDa,而CrylAb蛋白與150 kDa的單一蛋白結(jié)合(Aranda等，1996)，這與非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合研究無關(guān)。因此，本發(fā)明還包括CrylCa和CrylAb的組合，作為IRM混雜以延緩秋粘蟲和/或蔗螟對(duì)其中任一蛋白產(chǎn)生抗性，或者延緩已對(duì)CrylAb產(chǎn)生抗性的蔗螟群體產(chǎn)生抗性。本發(fā)明提供了一種用于控制鱗翅類害蟲的組合物，包含表達(dá)含有CrylCa核心毒素的蛋白和含有CrylAb核心毒素的蛋白的細(xì)胞；經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)含有CrylCa核心毒素的蛋白和含有CrylAb核心毒素的蛋白的宿主，其中所述宿主是微生物或植物細(xì)胞(本多核苷酸優(yōu)選在遺傳構(gòu)建體中，在非蘇云金芽孢桿菌啟動(dòng)子的控制之下(與之可操作連接/包含)；本多核苷酸可包含用于增強(qiáng)在植物中表達(dá)的密碼子選擇)；
一種控制鱗翅類害蟲的方法，其包括使所述害蟲或所述害蟲的環(huán)境與有效量的可 產(chǎn)生含有CrylAb核心毒素的蛋白的組合物和表達(dá)含有CrylC核心毒素的蛋白的細(xì)胞相接觸；一種植物(例如玉米植物或大豆或棉花或甘蔗)，其包含編碼含有CrylCa核心毒素的蛋白的DNA和編碼含有CrylAb核心毒素的蛋白的DNA，和所述植物的種子；一種植物(例如玉米植物或大豆或棉花或甘蔗)，其中編碼含有CrylCa核心毒素的蛋白的DNA和編碼含有CrylAb核心毒素的蛋白的DNA被漸滲入所述玉米植物，和所述植物的種子。我們證明，例如，CrylCa(來自重組突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MR1206/DC639的蛋白；質(zhì)粒pMYC2547)在人工飲食生物測(cè)試法中可以非常有效地控制經(jīng)選擇對(duì)CrylAb有抗性的鹿螟(SCB;Diatraea saccharalis)群體。這表明，CrylCa可用于控制已對(duì)CrylAb產(chǎn)生抗性的SCB群體，或減緩SCB群體中CrylAb抗性的產(chǎn)生。部分地根據(jù)本文描述的數(shù)據(jù)，共表達(dá)CrylCa和CrylAb能夠產(chǎn)生高劑量的IRM混雜，用于控制SCB?？梢韵蛟摻M合添加其它蛋白以增加抗蟲譜。例如，在谷物/玉米中，添加CrylFa可以產(chǎn)生對(duì)于歐洲玉米螟(ECB)Ostrinia nubilalis (Hiibner)的IRM混雜，而添加另外一種MOA用于控制SCB。關(guān)于CrylC作為植物中的潛在生物殺蟲劑的綜述見(Avisar等2009)。AvisarD, Eilenberg H，Keller M, Reznik N，Segal M, Sneh B，Zilberstein A (2009)The Bacillusthuringiensis delta—endotoxin CrylC as a potential bioinsecticide in plants.Plant Science 176:315-3240昆蟲受體。如實(shí)施例中所述，使用放射性標(biāo)記的CrylCa核心毒素蛋白的競(jìng)爭(zhēng)受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示，CrylAb核心毒素蛋白不競(jìng)爭(zhēng)FAW昆蟲組織中存在的結(jié)合CrylCa的高親和性結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)果表明，CrylAb和CrylCa蛋白的組合是減緩FAW群體對(duì)CrylAb產(chǎn)生抗性(和同樣地，對(duì)CrylCa產(chǎn)生抗性)的有效手段，并且可在表達(dá)這兩種蛋白質(zhì)的谷物/玉米植物中增加對(duì)這種害蟲的抗性水平。這些數(shù)據(jù)還提示，CrylCa可以有效控制已對(duì)CrylAb產(chǎn)生抗性的SCB群體。一種應(yīng)用選擇是在已經(jīng)由于產(chǎn)生了抗性而使CrylAb不能有效控制SCB的地域使用這些Cry蛋白。另一種應(yīng)用選擇是CrylCa與CrylAb組合使用，從而減緩SCB對(duì)CrylAb產(chǎn)生抗性。
本發(fā)明所述的毒素的組合可用于控制鱗翅類害蟲。成年鱗翅類，即蝶和蛾，主要以花蜜為食。幼蟲，即毛蟲，幾乎全部以植物為食，并且許多是嚴(yán)重的害蟲。毛蟲在葉子上面或內(nèi)部或者植物根或莖上進(jìn)食，剝奪植物營(yíng)養(yǎng)，并且常常會(huì)破壞植物的物理支撐結(jié)構(gòu)。此外，毛蟲還以果實(shí)、織物、儲(chǔ)存的谷粒和面粉為食，使這些產(chǎn)品毀壞而不能出售或者嚴(yán)重降低其價(jià)值。如本文所使用的，鱗翅類害蟲是指害蟲的各個(gè)生命階段，包括幼蟲階段。本發(fā)明的嵌合毒素包括B. t.毒素的完整核心N-端毒素部分，并且在毒素部分末端之后的某點(diǎn)，蛋白質(zhì)具有向異源原毒素(protoxin)序列的轉(zhuǎn)變。B. t.毒素的N端毒素部分在本文稱作“核心”毒素。向異源原毒素區(qū)段的轉(zhuǎn)變可以發(fā)生在毒素/原毒素連接點(diǎn)附近，或者可選擇地，天然原毒素的一部分(延伸越過毒素部分)可以被保留，而向異源原毒素的轉(zhuǎn)變發(fā)生在其下游。作為實(shí)例，本發(fā)明的一種嵌合毒素具有CrylAb的完整核心毒素部分(氨基酸1-601)和異源原毒素(氨基酸602至C端)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,包含原毒素的嵌合毒素的部分源自CrylAb蛋白毒素。作為第二個(gè)實(shí)例，本發(fā)明的第二種嵌合毒素，如SEQ ID N0:1(DIG-152)中公開的，具有CrylCa的完整核心毒素部分(氨基酸1_619)和異源原毒素(氨基酸620至C端)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，包含原毒素的嵌合毒素的部分源自CrylAb蛋白毒素。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，B. t.毒素，甚至在某種類型的毒素如CryICa中，可以在一定程度上改變長(zhǎng)度以及從毒素部分向原毒素部分轉(zhuǎn)變的確切位置。通常，crylCa毒素長(zhǎng)度為大約1150-大約1200個(gè)氨基酸。從毒素部分向原毒素部分的轉(zhuǎn)變通常發(fā)生在全長(zhǎng)毒素的大約50%-大約60%。本發(fā)明的嵌合毒素包括該核心N端毒素部分的完整區(qū)域(expanse)。因此,嵌合毒素包括全長(zhǎng)crylCa或CrylAb B. t.毒素的至少大約50%。這通常為至少大約590個(gè)氨基酸。關(guān)于原毒素部分，CrylA(b)原毒素部分的完整區(qū)域從毒素部分的末端延伸到該分子的C端。這一部分的最后大約100-150個(gè)氨基酸是最關(guān)鍵的，應(yīng)包含在本發(fā)明的嵌合毒素中。 基因和毒素根據(jù)本發(fā)明，有用的基因和毒素不僅包括公開的全長(zhǎng)序列，還包括保留了本文特別例示的毒素的特征殺蟲活性的這些序列的片段、變體、突變體和融合蛋白。如本文所使用的，術(shù)語基因的“變體”或“變異”是指編碼相同毒素或者編碼具有殺蟲活性的等價(jià)毒素的核苷酸序列。如本文所使用的，術(shù)語“等價(jià)毒素”是指對(duì)靶害蟲具有與所要求保護(hù)的毒素相同或基本上相同的生物活性的毒素。如本文所使用的，邊界表示大約95% (CrylAb和ICa的)、78% (CrylA和CrylC的)和 45%(Cryl 的)序列同一性，參見 “Revision of the Nomenclature for theBacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins, , N. Crickmore, D. R. Zeigler, J.Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum,和 D. H. Dean. Microbiology andMolecular Biology Reviews (1998) Vol 62:807-813。這些截?cái)嘀?cut offs)也可僅應(yīng)用于核心毒素(對(duì)于CrylAb和CrylCa毒素)。所附的附錄A中列出的GENBANK編號(hào)也可用于獲得本文公開或提及的任何基因和蛋白的序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)顯而易見，編碼活性毒素的基因可以通過多種手段鑒定和獲得。本文例示的特定基因或基因部分可以從在培養(yǎng)物保藏中心保藏的分離物獲得，如上所述。這些基因或其部分或變體也可以通過例如使用基因合成儀合成構(gòu)建?；虻淖儺惪梢允褂糜糜谥苽潼c(diǎn)突變的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易地構(gòu)建。另外，這些基因的片段可使用商業(yè)上可獲得的外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的程序進(jìn)行制備。例如，可以使用酶如Bal31或定點(diǎn)誘變從這些基因的末端系統(tǒng)地切除核苷酸。另外，編碼活性片段的基因可使用多種限制酶獲得?？梢允褂玫鞍酌钢苯荧@得這些毒素的活性片段。保留例示的毒素的殺蟲活性的片段和等價(jià)物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，由于遺傳密碼的冗余性，多種不同的DNA序列可編碼本文公開的氨基酸序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全可以生成這些編碼相同的或者基本上相同的毒素的可替換的DNA序列。這些變體DNA序列也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文所使用的，“基本上相同的”序列是指具有不會(huì)實(shí)質(zhì)上影響殺蟲活性的氨基酸取代、缺失、添加或插入的序列。保留了殺蟲活性的片段也包含在這個(gè)定義內(nèi)。 另一種用于鑒定根據(jù)本發(fā)明有用的編碼毒素的基因和基因部分的方法是通過使用寡核苷酸探針。這些探針是可檢測(cè)的核苷酸序列。這些序列可以通過用合適的標(biāo)記加以檢測(cè)或者可制成固有地發(fā)熒光，如國(guó)際申請(qǐng)No. W093/16094中所述。如本領(lǐng)域眾所熟知的，如果探針分子與核酸樣品通過在兩分子之間形成強(qiáng)鍵而雜交，則有理由假定，探針和樣品具有相當(dāng)?shù)耐葱浴?yōu)選地，雜交通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)在嚴(yán)格條件下進(jìn)行，如例如在Keller, G. H. , M. M. Manak(1987)DNA Probes, Stockton Press, New York, N. Y, pp. 169-170中所述。鹽濃度和溫度組合的一些實(shí)例如下(按照嚴(yán)格性增強(qiáng)的順序)2X SSPE或SSC在室溫；1X SSPE 或 SSC 在 42°C ；0. IX SSPE 或 SSC 在 42°C ；0. IX SSPE 或 SSC 在 65°C。探針的檢測(cè)提供了一種用已知的方式確定雜交是否發(fā)生的方法。這種探針分析提供了用于鑒定本發(fā)明毒素編碼基因的快速方法。根據(jù)本發(fā)明用作探針的核苷酸區(qū)段可以用DNA合成儀和標(biāo)準(zhǔn)的步驟合成。這些核苷酸序列也可以用作PCR引物以擴(kuò)增本發(fā)明的基因。本文特別例示了本發(fā)明的某些毒素。因?yàn)檫@些毒素僅僅是本發(fā)明毒素的實(shí)例，因此應(yīng)當(dāng)顯而易見，本發(fā)明包括具有與例示毒素相同或相似殺蟲活性的變體或等價(jià)毒素(和編碼等價(jià)毒素的核苷酸序列)。等價(jià)毒素與例示毒素具有氨基酸同源性。該氨基酸同源性通常為大于75%，優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于95%。氨基酸同源性在毒素的關(guān)鍵區(qū)域最高，所述關(guān)鍵區(qū)域決定其生物活性或者涉及最終負(fù)責(zé)生物活性的三維構(gòu)型的確定。在此方面，某些氨基酸取代是可以接受的，并且如果這些取代位于對(duì)于活性非關(guān)鍵的區(qū)域內(nèi)或者是不影響分子三維構(gòu)型的保守氨基酸取代的話，其是可以預(yù)期的。例如，氨基酸可以在下面的分類中被替換非極性、極性不帶電荷、堿性和酸性。只要取代不會(huì)實(shí)質(zhì)改變化合物的生物活性，一個(gè)類型的氨基酸被相同類型的另一種氨基酸代替的保守取代就屬于本發(fā)明的范圍。表I提供了屬于每種類型的氨基酸的實(shí)例的列表。
氨基酸類型氨基酸實(shí)例
非極性Ala，Val, Leu, He, Pro, Met, Phe，Trp
極性不帶電荷Gly，Ser，Thr，Cys, Tyr，Asn, Gln
酸性Asp，Glu
權(quán)利要求
1.ー種轉(zhuǎn)基因植物，包括編碼CrylC殺蟲蛋白的DNA和編碼CrylAb殺蟲蛋白的DNA。
2.權(quán)利要求I的植物的種子。
3.權(quán)利要求I的轉(zhuǎn)基因植物，其中編碼CrylCa殺蟲蛋白的DNA和編碼CrylAb殺蟲蛋白的DNA被漸滲到所述植物中。
4.權(quán)利要求3的植物的種子。
5.ー塊植物田，包括非-Bt避難所(refuge plant)植物和多個(gè)權(quán)利要求I的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述避難所植物占所述田地中全部作物植物的少于40%。
6.權(quán)利要求5的植物田，其中所述避難所植物占所述田地中全部作物植物的少于30%。
7.權(quán)利要求5的植物田，其中所述避難所植物占所述田地中全部作物植物的少于20%。
8.權(quán)利要求5的植物田，其中所述避難所植物占所述田地中全部作物植物的少于10%。
9.權(quán)利要求5的植物田，其中所述避難所植物占所述田地中全部作物植物的少于5%。
10.權(quán)利要求5的植物田，其中所述避難所植物成塊狀或條狀種植。
11.一種種子混合物，包括來自非Bt避難所植物的避難所種子和多個(gè)權(quán)利要求7的種子，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的少于40%。
12.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的少于30%。
13.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的少于20%。
14.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的少于10%。
15.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的少于5%。
16.—種管理昆蟲對(duì)Cry毒素產(chǎn)生抗性的方法，所述方法包括種植種子以產(chǎn)生權(quán)利要求5的植物田。
17.權(quán)利要求I的植物，所述植物進(jìn)ー步包含編碼含有CrylFa核心毒素的蛋白質(zhì)的DNA。
18.ー塊植物田，包括非-Bt避難所植物和多個(gè)權(quán)利要求17的玉米植物，其中所述避難所植物占所述田地中全部作物植物的少于大約20%。
19.ー塊植物田，包括多個(gè)權(quán)利要求17的植物，其中所述田地包含少于大約10%的避難所植物。
20.—種管理昆蟲對(duì)Cry毒素產(chǎn)生抗性的方法，所述方法包括種植種子以產(chǎn)生權(quán)利要求19的植物田。
21.一種控制鱗翅類害蟲的組合物，包含表達(dá)有效量的含CrylAb核心毒素的蛋白質(zhì)和含CrylC核心毒素的蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的組合物，包含經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)含CrylAb核心毒素的蛋白質(zhì)和含CrylC核心毒素的蛋白質(zhì)的宿主，其中所述宿主是微生物或植物細(xì)胞。
23.—種控制鱗翅類害蟲的方法，包括向所述害蟲或所述害蟲的環(huán)境提供有效量的權(quán)利要求21的組合物。
24.權(quán)利要求5或18的田地，其中所述植物占地超過10英畝。
25.權(quán)利要求1、3和17中任ー項(xiàng)的植物，其中所述植物選自玉米、大豆、甘蔗和棉花。
26.權(quán)利要求1、3和17中任ー項(xiàng)的植物，其中所述植物是玉米植物。
27.權(quán)利要求1、3、17、25和26中任ー項(xiàng)的植物的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞包含編碼所述CrylC殺蟲蛋白的所述DNA和編碼所述CrylAb殺蟲蛋白的所述DNA,其中所述CrylC殺蟲蛋白與SEQ ID NO: 2是至少99%同一的，而所述CrylD殺蟲蛋白與SEQ ID NO: 3是至少99%同一的。
28.權(quán)利要求1、3、17、25和26中任ー項(xiàng)的植物，其中所述CrylC殺蟲蛋白包含SEQ IDNO: 2，而所述CrylAb殺蟲蛋白包含SEQ ID NO: 3。
全文摘要
本發(fā)明包括用于控制鱗翅類昆蟲的方法和植物，所述植物包含Cry1Ca殺蟲蛋白和Cry1Ab殺蟲蛋白的組合，以延遲或防止昆蟲產(chǎn)生抗性。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102803495SQ201080063909
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者T.米德, K.納瓦, N.P.斯托爾, J.J.希茨, A.T.伍斯利, S.L.伯頓 申請(qǐng)人:陶氏益農(nóng)公司