專利名稱：組合使用Cry1Ab 與Cry1Be 用于抗性昆蟲(chóng)的管理的制作方法
組合使用CryIAb與CryIBe用于抗性昆蟲(chóng)的管理
背景技術(shù)：
人類(lèi)種植谷物用于糧食和能源應(yīng)用。人類(lèi)還種植許多其它的作物，包括大豆和棉花。昆蟲(chóng)吃掉并毀壞植物從而破壞了人類(lèi)的努力。人們每年要花費(fèi)數(shù)十億美元用于控制害蟲(chóng)，并且它們還會(huì)造成另外數(shù)十億美元的損失。合成的有機(jī)化學(xué)殺蟲(chóng)劑為用于控制害蟲(chóng)的主要工具，但是在一些區(qū)域，生物殺蟲(chóng)劑，例如來(lái)自蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis) (Bt)的殺蟲(chóng)蛋白，發(fā)揮著重要的作用。通過(guò)轉(zhuǎn)化Bt殺蟲(chóng)蛋白基因產(chǎn)生昆蟲(chóng)抗性植物的能力給現(xiàn)代農(nóng)業(yè)帶來(lái)了革命，并提高了殺蟲(chóng)蛋白及其基因的重要性和價(jià)值。已經(jīng)有數(shù)種Bt蛋白用于產(chǎn)生抗昆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植物，它們現(xiàn)在已經(jīng)被成功地注冊(cè)并商業(yè)化。這些包括谷物/玉米(corn)中的CrylAb, CrylAc, CrylF和Cry3Bb,棉花中的 CrylAc和Cry2Ab,和馬鈴薯中的Cry3A。表達(dá)這些蛋白的商業(yè)產(chǎn)品表達(dá)單一的蛋白，但是在如下情況下例外，即期望2種蛋白的組合殺蟲(chóng)譜(例如在玉米中組合CrylAb和Cry3Bb以分別提供對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)和食根昆蟲(chóng)的抗性)，或者蛋白的獨(dú)立作用使它們可用作在易感昆蟲(chóng)群體中延遲抗性產(chǎn)生的工具(例如在棉花中組合CrylAc和Cry2Ab以提供對(duì)煙草青蟲(chóng)(tobacco budworm)的抗性管理)。另見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)No. 2009/0313717，其涉及Cry2蛋白加Vip3Aa, CrylF或CrylA,用于控制谷實(shí)夜蛾(Helicoverpa zea)或棉鈴蟲(chóng)(armigerain)。WO 2009/132850涉及CrylF或CezrylA和Vip3Aa,用于控制秋粘蟲(chóng)(Spodoptera frugiperda)。美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)No. 2008/0311096部分涉及CryIAb,用于控制CryIF抗性的歐洲玉米螟(ECB;Ostrinianubilalis (Hiibner))。也就是說(shuō)，昆蟲(chóng)抗性轉(zhuǎn)基因植物的一些品質(zhì)雖然使這種技術(shù)被快速而廣泛地采用，但是也帶來(lái)了擔(dān)憂，即害蟲(chóng)群體可能對(duì)這些植物所產(chǎn)生的殺蟲(chóng)蛋白產(chǎn)生抗性。已經(jīng)提出了多種策略用于防止(preserve)基于Bt的昆蟲(chóng)抗性性狀的效用，包括以高劑量使用蛋白質(zhì)并與避難所組合，不同毒素交替使用或者共使用(McGaughey等.(1998)，“B.t. Resistance Management,，，Nature Biotechnol. 16:144-146)。被選擇用于昆蟲(chóng)抗性管理(IRM)混雜的蛋白質(zhì)需要獨(dú)立地發(fā)揮其殺蟲(chóng)效果，從而對(duì)一種蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗性不會(huì)賦予對(duì)第二種蛋白質(zhì)的抗性(即對(duì)于蛋白質(zhì)無(wú)交叉抗性)。如果例如選擇對(duì)“蛋白A”有抗性的害蟲(chóng)群體對(duì)“蛋白B”敏感，則人們可以得出結(jié)論，蛋白A和蛋白B無(wú)交叉抗性并且它們的組合可有效延遲對(duì)單一蛋白A的抗性。當(dāng)沒(méi)有抗性昆蟲(chóng)群體時(shí)，可以基于假定與作用機(jī)制和交叉抗性潛力相關(guān)的其它特征進(jìn)行評(píng)估。已經(jīng)有提議使用受體介導(dǎo)的結(jié)合來(lái)鑒定可能不會(huì)顯示交叉抗性的殺蟲(chóng)蛋白(van Mellaert等1999)。在這種方法中固有的缺少交叉抗性的關(guān)鍵預(yù)測(cè)子(predictor)是殺蟲(chóng)蛋白在敏感昆蟲(chóng)物種中不會(huì)競(jìng)爭(zhēng)受體。在兩種Bt毒素競(jìng)爭(zhēng)昆蟲(chóng)中的相同受體的情況下，如果昆蟲(chóng)中的受體發(fā)生突變使得毒素之一不再與該受體結(jié)合從而對(duì)該昆蟲(chóng)不再具有殺蟲(chóng)性，則可能的情況是昆蟲(chóng)對(duì)第二種毒素(其競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合相同的受體)也有抗性。也就是說(shuō)，昆蟲(chóng)對(duì)兩種Bt毒素有交叉抗性。然而，如果兩種毒素結(jié)合兩種不同的受體，這可以指示昆蟲(chóng)不會(huì)同時(shí)對(duì)這兩種毒素具有抗性。例如，CrylFa蛋白可用于控制許多鱗翅類(lèi)害蟲(chóng)物種，包括ECB和秋粘蟲(chóng)(FAff; Spodoptera frugiperda),并且針對(duì)鹿螟(SCB; Diatraea saccharalis)有活性。CrylFa蛋白，如在含有事件TC1507的轉(zhuǎn)基因玉米植物中產(chǎn)生的，負(fù)責(zé)工業(yè)領(lǐng)先的用于FAW控制的昆蟲(chóng)抗性性狀。CrylFa進(jìn)一步應(yīng)用于Herculex' SmartStax 和WideStrike11^S中。使用CrylFa蛋白進(jìn)行(競(jìng)爭(zhēng)或同源)受體結(jié)合研究的能力已受到限制，因?yàn)榭捎糜跇?biāo)記蛋白在受體結(jié)合測(cè)定法中進(jìn)行檢測(cè)的常用技術(shù)傾向于使CrylFa蛋白的殺蟲(chóng)活性失活。在官方B. t.命名委員會(huì)的網(wǎng)站上列出了其它的Cry毒素(Crickmore等；lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。當(dāng)前有接近 60 個(gè)主要的 “Cry”毒素組(Cryl-Cry59)，還有額外的Cyt毒素和VIP毒素等。各數(shù)字組中的很多還有大寫(xiě)字 母的亞群，并且大寫(xiě)字母亞群又有小寫(xiě)字母的子亞群。(例如，Cryl具有A-L，而CrylA具
si i) o

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明部分地涉及令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即CrylAb和CrylBe不競(jìng)爭(zhēng)對(duì)歐洲玉米螟(ECB; Ostrinia nubilalis (Hiibner))或秋粘蟲(chóng)(FAff; Spodoptera frugiperda)腸細(xì)胞膜制備物中的位點(diǎn)的結(jié)合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到這一公開(kāi)的利益，可產(chǎn)生這兩種蛋白(包括全長(zhǎng)蛋白的殺蟲(chóng)部分)的植物能夠延遲或防止對(duì)這些殺蟲(chóng)蛋白單獨(dú)的任何一個(gè)產(chǎn)生抗性。玉米和大豆是一些優(yōu)選的植物。ECB是本毒素對(duì)優(yōu)選的靶昆蟲(chóng)。因此，本發(fā)明部分地涉及組合使用CrylAb蛋白和CrylBe蛋白。可同時(shí)產(chǎn)生這兩種蛋白的植物(和種植有這類(lèi)植物的田畝)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明還部分地涉及三種(或更多種)毒素的三重混雜或“錐形混雜”，以CrylAb和CrylBe作為基礎(chǔ)配對(duì)。在一些優(yōu)選的錐形混雜實(shí)施方案中，所選毒素的組合提供了三個(gè)針對(duì)ECB的作用位點(diǎn)。一些優(yōu)選的“三作用位點(diǎn)”錐形混雜組合包括本基礎(chǔ)蛋白配對(duì)加Cry2A、CrylI和DIG-3，作為用于靶向ECB的第三蛋白。根據(jù)本發(fā)明，這些特定的三重混雜可有利地且令人驚訝地提供三個(gè)針對(duì)ECB的作用位點(diǎn)。這有助于減少或消除對(duì)避難所田畝的需要。盡管本發(fā)明在本文公開(kāi)為基礎(chǔ)毒素對(duì)CrylAb和CrylBe，其單獨(dú)或者在三種或更多種毒素的“錐形混雜”中提供針對(duì)玉米中ECB的昆蟲(chóng)抗性，但是應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的CrylAb和CrylBe組合也可與其它的蛋白質(zhì)一起使用，用于在大豆或玉米中祀向FAW?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明添加額外的毒素/基因。例如，如果CrylFa與本蛋白對(duì)混雜(CrylFa和CrylBe均針對(duì)FAW和ECB兩者有活性)，則向此三重混雜添加額外的蛋白質(zhì)，其中該第四種添加的蛋白靶向ECB，可以提供三個(gè)針對(duì)FAW的作用位點(diǎn)和三個(gè)針對(duì)ECB的作用位點(diǎn)。這種添加的蛋白(革巴向FAW第四蛋白)可選自下組CrylFa、Vip3Ab或CrylE。這可以產(chǎn)生四蛋白混雜，其具有針對(duì)兩種昆蟲(chóng)(ECB和FAW)的三作用位點(diǎn)。表格簡(jiǎn)述表I :提供了 4種氨基酸類(lèi)型中氨基酸的實(shí)例。
附圖
簡(jiǎn)述圖I :圖解了標(biāo)記的CryIAb與CryIBe對(duì)ECB BBMV的百分比結(jié)合。 圖2 :圖解了標(biāo)記的CryIAb與CryIBe對(duì)FAW BBMV的百分比結(jié)合。圖3 :圖解了標(biāo)記的CryIBe與CryIAb對(duì)FAW BBMV的百分比結(jié)合。發(fā)明詳述
本發(fā)明部分地涉及令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即CrylAb和CrylBe在歐洲玉米螟(ECB; Ostrinia nubilalis (Hiibner ))或秋粘蟲(chóng)(FAff; Spodoptera frugiperda)的腸中彼此不競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)。因此，CrylAb蛋白可與CrylBe蛋白組合用于轉(zhuǎn)基因玉米(和其它植物；例如棉花和大豆)中，以延遲或防止ECB對(duì)這些蛋白的單獨(dú)任一個(gè)產(chǎn)生抗性。本發(fā)明蛋白對(duì)能夠有效地保護(hù)植物(例如玉米植物)免于Cry抗性ECB的傷害。也就是說(shuō)，本發(fā)明的一個(gè)用途是保護(hù)玉米和其它經(jīng)濟(jì)上重要的植物物種免于由于可對(duì)CrylAb或CrylBe產(chǎn)生抗性的ECB群體導(dǎo)致的傷害和收得率損失(yield loss)。因此，本發(fā)明教導(dǎo)了包含CryIAb和CryIBe的昆蟲(chóng)抗性管理(IRM)混雜，以防止或減緩ECB對(duì)這些蛋白之一或兩者產(chǎn)生抗性。進(jìn)一步，盡管本文中公開(kāi)的本發(fā)明教導(dǎo)了包含了 CrylAb和CrylBe的IRM混雜用于防止ECB對(duì)這些蛋白之一或兩者的抗性，但本文公開(kāi)的本發(fā)明范圍內(nèi)的是，CrylAb和CrylBe中的一種或兩者可以單獨(dú)或組合采用，以防止FAW對(duì)這些蛋白之一或兩者的抗性。本發(fā)明提供了用于控制鱗翅類(lèi)害蟲(chóng)的組合物，其包含可產(chǎn)生含有CrylAb核心毒素的蛋白和含有CrylBe核心毒素的蛋白的細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步包括經(jīng)轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生CrylAb殺蟲(chóng)蛋白和CrylBe殺蟲(chóng)蛋白的宿主,其中所述宿主是微生物或植物細(xì)胞。本多核苷酸優(yōu)選地在遺傳構(gòu)建體中在非蘇云金芽孢桿菌啟動(dòng)子的控制之下。本多核苷酸可以包含用于在植物中增強(qiáng)表達(dá)的密碼子選擇。另外預(yù)期的是，本發(fā)明提供了一種控制鱗翅類(lèi)害蟲(chóng)的方法，包括使所述害蟲(chóng)或所述害蟲(chóng)的環(huán)境與有效量的組合物接觸，該組合物含有CrylAb殺蟲(chóng)蛋白，并進(jìn)一步含有CrylBe殺蟲(chóng)蛋白。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包含玉米植物，其包含編碼含有CrylBe核心毒素的蛋白的植物可表達(dá)基因和編碼含有CrylAb核心毒素的蛋白的植物可表達(dá)基因，和這種植物的種子。本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案包含玉米植物，其中編碼CrylBe殺蟲(chóng)蛋白的植物可表達(dá)基因和編碼CrylAb殺蟲(chóng)蛋白的植物可表達(dá)基因被漸滲入所述玉米植物中，和這種植物的種子。如實(shí)施例中所述，使用放射性標(biāo)記的CrylAb和CrylBe蛋白的競(jìng)爭(zhēng)受體結(jié)合研究顯示,CrylBe蛋白不競(jìng)爭(zhēng)ECB或FAW組織中結(jié)合CrylAb的結(jié)合。這些結(jié)果還表明，CrylAb和CrylBe蛋白的組合可為在ECB和FAW群體中延緩對(duì)這些蛋白之一產(chǎn)生抗性的有效手段。因此，部分地基于本文所述的數(shù)據(jù)，認(rèn)為CrylAb和CrylBe蛋白的共產(chǎn)生(混雜)可用于產(chǎn)生對(duì)于ECB的高劑量IRM混雜?？梢韵蜻@個(gè)配對(duì)添加其它的蛋白質(zhì)。例如，本發(fā)明還部分地涉及三種(或更多種)毒素的三重混雜或“錐形混雜”，以CrylAb和CrylBe蛋白作為基礎(chǔ)配對(duì)。在一些優(yōu)選的錐形混雜實(shí)施方案中，所選的毒素具有針對(duì)FAW的三個(gè)不同的作用位點(diǎn)。一些優(yōu)選的“三作用位點(diǎn)”錐形混雜組合包括本基礎(chǔ)蛋白配對(duì)加CrylFa，Vip3Ab, Cry 1C, CrylD或CrylE作為靶向FAW的第三蛋白。根據(jù)本發(fā)明，這些特定的三重混雜有利地且令人驚訝地提供三個(gè)針對(duì)FAW的作用位點(diǎn)。這有助于減少或消除對(duì)于避難所田畝的需要?！安煌淖饔梦稽c(diǎn)”，意思是給定蛋白彼此不會(huì)導(dǎo)致交叉抗性。也可以根據(jù)本發(fā)明添加額外的毒素/基因。例如，如果CrylFa與本蛋白對(duì)混雜(CrylFa和CrylBe均針對(duì)FAW和歐洲玉米螟(ECB)兩者有活性)，則向此三重混雜添加一種額外的蛋白質(zhì)，其中該第四種添加的蛋白靶向ECB，可提供三個(gè)針對(duì)FAW的作用位點(diǎn)和三個(gè)針對(duì)ECB的作用位點(diǎn)。此添加的蛋白(第四蛋白)可選自下組Cry2A，CrylI和DIG-3(參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)序列No. 61/284，278(2009年12月16日提交)和US 201000269223)。這可產(chǎn)生四蛋白混雜，其具有針對(duì)兩種昆蟲(chóng)(ECB和FAW)的三作用位點(diǎn)。因此，一個(gè)應(yīng)用選擇是組合使用本蛋白配對(duì)與第三毒素/基因，并使用這種三重混雜在ECB和/或FAW中減緩對(duì)這些毒素中的任何一種產(chǎn)生抗性。因此，本發(fā)明還部分地涉及三種(或更多種)毒素的三重混雜或“錐形混雜”。在一些優(yōu)選的錐形混雜實(shí)施方案中，所選毒素具有針對(duì)ECB和/或FAW的三個(gè)不同的作用位點(diǎn)。 在本發(fā)明的各種應(yīng)用選擇中包括在FAW可產(chǎn)生抗性群體的作物生長(zhǎng)區(qū)中使用本蛋白中的兩種、三種或更多種蛋白。關(guān)于使用CrylFa和CrylBe (用于控制ECB和/或FAW)的指導(dǎo)，參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)序列No. 61/284，290 (2009年12月16日提交)。因?yàn)镃rylFa針對(duì)ECB (和FAW)有活性，根據(jù)本發(fā)明，CrylAb加CrylBe加CrylFa可以有利地且令人驚訝地提供三個(gè)針對(duì)ECB的作用位點(diǎn)。這有助于減少或消除對(duì)于避難所田畝的需要。CrylFa 用于HerCL丨lex'SmartStax 和 WidesStrike 產(chǎn)品中。本基因?qū)?CrylAb和 CrylBe)可組合入例如 CrylFa 產(chǎn)品如HerCU丨ex_\, SmartStax 和 WideStrike 。因此，本蛋白對(duì)可顯著減少對(duì)這些和其它蛋白的選擇壓力。本蛋白配對(duì)因此可以用在三基因組合中，用于玉米和其它植物(例如棉花和大豆)。如上面所討論的，也可以根據(jù)本發(fā)明添加另外的毒素/基因。為了靶向ECB，可以使用Cry2A, CrylI和/或DIG-3。見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)序列No. 61/284，278 (2009年12月16日提交)和US 201000269223。對(duì)于CrylF和CrylAb的組合(用于控制ECB)，參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi) No. 2008/0311096?？僧a(chǎn)生任何本蛋白組合的植物(和種植有這類(lèi)植物的田畝)包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。也可以添加額外的毒素/基因，但是上面討論的特定混雜有利地且令人驚訝地提供針對(duì)ECB和/或FAW的多個(gè)作用位點(diǎn)。這有助于減少或消除對(duì)于避難所田畝的需要。因此，如此種植超過(guò)10英畝的田地包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢允褂肎ENBANK犾得本文討論的任何基因和蛋白的序列。見(jiàn)下面的附錄A。還可以使用專利。例如，美國(guó)專利No. 5，188，960和美國(guó)專利No. 5，827，514描述了適于實(shí)施本發(fā)明的含CrylFa核心毒素的蛋白質(zhì)。美國(guó)專利No. 6，218，188描述了適用于本發(fā)明的編碼含CrylFa核心毒素的蛋白質(zhì)的植物優(yōu)化的DNA序列。本文所述的蛋白的組合可用于控制鱗翅類(lèi)害蟲(chóng)。成年鱗翅類(lèi)，例如蝶和蛾，主要以花蜜為食并且是顯著的授粉效應(yīng)物。幾乎所有的鱗翅類(lèi)幼蟲(chóng)，即毛蟲(chóng)，以植物為食，并且許多是嚴(yán)重的害蟲(chóng)。毛蟲(chóng)在葉子上面或內(nèi)部或者植物根或莖上進(jìn)食，剝奪植物營(yíng)養(yǎng)，并且常常會(huì)破壞植物的物理支撐結(jié)構(gòu)。此外，毛蟲(chóng)還以果實(shí)、織物、儲(chǔ)存的谷粒和面粉為食，使這些產(chǎn)品毀壞而不能出售或者嚴(yán)重降低其價(jià)值。如本文所使用的，鱗翅類(lèi)害蟲(chóng)是指害蟲(chóng)的各個(gè)生命階段，包括幼蟲(chóng)階段。本發(fā)明的一些嵌合毒素包括Bt毒素的完整N-端核心毒素部分，并且在核心毒素部分末端之后的某點(diǎn)，蛋白質(zhì)具有向異源原毒素(protoxin)序列的轉(zhuǎn)變。Bt毒素的N端具有殺蟲(chóng)活性的毒素部分稱作“核心”毒素。從核心毒素區(qū)段向異源原毒素區(qū)段的轉(zhuǎn)變可發(fā)生在毒素/原毒素連接點(diǎn)附近，或者可選擇地，天然原毒素的一部分(延伸越過(guò)核心毒素部分)可以被保留，而向異源原毒素部分的轉(zhuǎn)變發(fā)生在其下游。作為一個(gè)實(shí)例，本發(fā)明的一種嵌合毒素為CrylAb的完整核心毒素部分(大約氨基酸1-601)和/或異源原毒素(大約氨基酸602至C端)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,包含原毒素的嵌合毒素的部分源自CrylAb蛋白毒素。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,包含原毒素的嵌合毒素的部分源自CrylAb蛋白毒素。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，Bt毒素，甚至在某種類(lèi)型的毒素如CrylBe中，可以 在一定程度上改變長(zhǎng)度以及從核心毒素部分向原毒素部分轉(zhuǎn)變的確切位置。通常，CrylBe毒素長(zhǎng)度為大約1150-大約1200個(gè)氨基酸。從核心毒素部分向原毒素部分的轉(zhuǎn)變通常發(fā)生在全長(zhǎng)毒素的大約50%-大約60%。本發(fā)明的嵌合毒素包括該N端核心毒素部分的完整區(qū)域(expanse)。因此,嵌合毒素包括全長(zhǎng)CrylBe蛋白的至少大約50%。這通常為至少大約590個(gè)氨基酸。關(guān)于原毒素部分，CrylAb原毒素部分的完整區(qū)域從核心毒素部分的末端延伸到該分子的C端?；蚝投舅?。根據(jù)本發(fā)明，有用的基因和毒素不僅包括公開(kāi)的全長(zhǎng)序列，還包括保留了本文特別例示的毒素的特征殺蟲(chóng)活性的這些序列的片段、變體、突變體和融合蛋白。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)基因的“變體”或“變異”是指編碼相同毒素或者編碼具有殺蟲(chóng)活性的等價(jià)毒素的核苷酸序列。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“等價(jià)毒素”是指對(duì)靶害蟲(chóng)具有與所要求保護(hù)的毒素相同或基本上相同的生物活性的毒素。如本文所使用的，邊界表示大約95% (CryIAb的和CryIBe的)、78% (CryIA的和CrylB 的)和 45%(Cryl 的)序列同一性，參見(jiàn) “Revision of the Nomenclature for theBacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins, , N. Crickmore, D. R. Zeigler, J.Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum,和 D. H. Dean. Microbiology andMolecular Biology Reviews (1998) Vol 62:807-813。這些截?cái)嘀?cut offs)也可僅應(yīng)用于核心毒素。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)顯而易見(jiàn)，編碼活性毒素的基因可以通過(guò)多種手段鑒定和獲得。本文例示的特定基因或基因部分可從在培養(yǎng)物保藏中心保藏的分離物獲得。這些基因或其部分或變體也可以通過(guò)例如使用基因合成儀合成構(gòu)建。基因的變異可以使用用于制備點(diǎn)突變的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易地構(gòu)建。另外，這些基因的片段可使用商業(yè)上可獲得的外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的程序進(jìn)行制備。例如，可以使用酶如Bal31或定點(diǎn)誘變從這些基因的末端系統(tǒng)地切除核苷酸。編碼活性片段的基因也可使用多種限制酶獲得?？梢允褂玫鞍酌钢苯荧@得這些蛋白毒素的活性片段。保留例示的毒素的殺蟲(chóng)活性的片段和等價(jià)物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，由于遺傳密碼的冗余性，多種不同的DNA序列可編碼本文公開(kāi)的氨基酸序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全可以生成這些編碼相同的或者基本上相同的毒素的可替換的DNA序列。這些變體DNA序列也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文所使用的，“基本上相同的”序列是指具有不會(huì)實(shí)質(zhì)上影響殺蟲(chóng)活性的氨基酸取代、缺失、添加或插入的序列。編碼保留了殺蟲(chóng)活性的蛋白的基因片段也包括在這個(gè)定義內(nèi)。另一種用于鑒定根據(jù)本發(fā)明有用的編碼毒素的基因和基因部分的方法是通過(guò)使用寡核苷酸探針。這些探針是可檢測(cè)的核苷酸序列。這些序列可以通過(guò)用合適的標(biāo)記加以檢測(cè)或者可制成固有地發(fā)熒光，如國(guó)際申請(qǐng)No. W093/16094中所述。如本領(lǐng)域眾所熟知的，如果探針?lè)肿优c核酸樣品通過(guò)在兩分子之間形成強(qiáng)鍵而雜交，則有理由假定，探針和樣品具有相當(dāng)?shù)耐葱浴?yōu)選地，雜交通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)在嚴(yán)格條件下進(jìn)行，如例如在Keller, G. H. , M. M. Manak(1987)DNA Probes, Stockton Press, New York, N. Y. , pp. 169-170中所述。鹽濃度和溫度組合的一些實(shí)例如下(按照嚴(yán)格性增強(qiáng)的順序)2X SSPE或SSC在 室溫；1X SSPE 或 SSC 在 42°C ；0. IX SSPE 或 SSC 在 42°C ；0. IX SSPE 或 SSC 在 65°C。探針的檢測(cè)提供了一種用已知的方式確定雜交是否發(fā)生的方法。這種探針?lè)治鎏峁┝擞糜阼b定本發(fā)明毒素編碼基因的快速方法。根據(jù)本發(fā)明用作探針的核苷酸區(qū)段可以用DNA合成儀和標(biāo)準(zhǔn)的步驟合成。這些核苷酸序列也可以用作PCR引物以擴(kuò)增本發(fā)明的基因。變體毒素。本文特別例示了本發(fā)明的某些毒素。因?yàn)檫@些毒素僅僅是本發(fā)明毒素的實(shí)例，因此應(yīng)當(dāng)顯而易見(jiàn)，本發(fā)明包括具有與例示毒素相同或相似殺蟲(chóng)活性的變體或等價(jià)毒素(和編碼等價(jià)毒素的核苷酸序列)。等價(jià)毒素與例示毒素具有氨基酸同源性。該氨基酸同源性通常為大于75%，優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于95%。氨基酸同源性在毒素的關(guān)鍵區(qū)域最高，所述關(guān)鍵區(qū)域決定其生物活性或者涉及最終負(fù)責(zé)生物活性的三維構(gòu)型的確定。在此方面，某些氨基酸取代是可以接受的，并且如果這些取代位于對(duì)于活性非關(guān)鍵的區(qū)域內(nèi)或者是不影響分子三維構(gòu)型的保守氨基酸取代的話，其是可以預(yù)期的。例如，氨基酸可以在下面的分類(lèi)中被替換非極性、極性不帶電荷、堿性和酸性。只要取代不會(huì)實(shí)質(zhì)改變化合物的生物活性，一個(gè)類(lèi)型的氨基酸被相同類(lèi)型的另一種氨基酸代替的保守取代就屬于本發(fā)明的范圍。下面是屬于每種類(lèi)型的氨基酸的實(shí)例的列表。表I :4種氨基酸類(lèi)型中氨基酸的實(shí)例
氨基酸類(lèi)型氨基酸實(shí)例
非極性Ala，Val, Leu, He, Pro, Met, Phe，Trp
極性不帶電荷Gly，Ser，Thr，Cys, Tyr，Asn, Gln
酸性Asp，Glu
堿性Lys，Arg，His在一些情況下，也可以進(jìn)行非保守取代。關(guān)鍵的因素是這些取代不會(huì)顯著降低毒素的生物活性。重組宿主。編碼本發(fā)明毒素的基因可以被引入到很多種微生物或植物宿主內(nèi)。毒素基因的表達(dá)直接或間接地導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和保持殺蟲(chóng)劑。交配轉(zhuǎn)移和重組轉(zhuǎn)移可用于產(chǎn)生表達(dá)本發(fā)明兩種毒素的Bt株。其它的宿主生物體也可以用一種或兩種毒素基因轉(zhuǎn)化，然后用于實(shí)現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。通過(guò)合適的微生物宿主例如假單胞菌屬(Pseudomonas),可以將微生物施加到害蟲(chóng)位置，并在那里增殖和被攝取。結(jié)果是控制害蟲(chóng)?？蛇x擇地，具有毒素基因的微生物可以在使毒素的活性延長(zhǎng)并使細(xì)胞穩(wěn)定的條件下被處理。然后將保留毒性活性的經(jīng)處理的細(xì)胞施加到靶害蟲(chóng)的環(huán)境中。當(dāng)藉由合適的載體將Bt毒素基因引入到微生物宿主中，并將所述宿主以存活狀態(tài)施加于環(huán)境時(shí)，重要的是應(yīng)使用某些宿主微生物。選擇已知占據(jù)一種或多種目標(biāo)作物的“植物圈”(葉面(phylloplane)、葉圍(phyIIosphere)、根圍(rhizosphere)和 / 或根面(rhizoplane))的微生物宿主。選擇這些微生物使得能夠與野生型微生物成功地競(jìng)爭(zhēng)特定的環(huán)境(作物或其它昆蟲(chóng)棲息地)，以提供穩(wěn)定地保持和表達(dá)可表達(dá)多肽殺蟲(chóng)劑的基因，并且理想地，提供使殺蟲(chóng)劑免于環(huán)境降解和失活的改進(jìn)的保護(hù)。已知大量的微生物在多種重要作物的葉面(植物葉子的表面)和/或根圍(圍繞植物根系的土壤)棲息。這些微生物包括細(xì)菌、藻類(lèi)和真菌。特別感興趣的是微生物，如細(xì)菌例如假單胞菌屬、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、黃單抱菌屬(Xanthomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、根瘤菌屬(Rhizobium)、紅假單細(xì)胞屬(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌屬(Methylophilius)、土壤桿菌屬(Agrobactenum)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、固氮菌屬(Azotobacter)、明串球菌屬(Leuconostoc)和產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes);真菌，特別是酵母，例如酵母屬(Saccharomyces)、隱球菌屬(Cryptococcus)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、擲抱酵母屬(Sporobolomyces)、紅酵母屬(Rhodotorula)和短梗霉屬(Aureobasidium)。特別感興趣的是如下的植物圈細(xì)菌物種，如丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)、突光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescens) >粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋酸桿菌(Acetobacter xylinum)、根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、渾球紅假單胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黃單抱菌(Xanthomonas campestris)、苜猜根瘤菌(Rhizobium melioti)、真養(yǎng)產(chǎn)喊菌(Alcaligenes entrophus)和維捏蘭德固氮菌(Azotobacter vinlandii);和植物圈酵母物種，如深紅酵母(Rhodotorula rubra)、粘紅酵母(R. Glutinis)、海洋紅酵母(R. Marina)、澄紅酵母(R. aurantiaca)、淺白隱球菌(Cryptococcus albidus)、流散隱球菌(C. diffluens)、羅倫特隱球菌(C. Laurentii)、羅斯酵母(Saccharomyces rosei)、有抱酵母(S. pretoriensis)、釀酒酵母(S. cerevisiae)、玫瑰擲抱酵母(Sporobolomycesroseus)、香味擲抱酵母(S. odorus)、維羅納克魯維酵母(Kluyveromyces veronae)和出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)。特別感興趣的是染色的微生物(pigmentedmicroorganisms)。可以獲得大量的方法用于將編碼毒素的Bt基因在允許所述基因穩(wěn)定保持和表達(dá) 的條件下引入到微生物宿主中。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且例如在美國(guó)專利No. 5，135，867中描述，該專利通過(guò)提述并入本文。細(xì)胞的處理。可以對(duì)表達(dá)Bt毒素的蘇云金芽孢桿菌或重組細(xì)胞進(jìn)行處理以延長(zhǎng)毒素活性和穩(wěn)定細(xì)胞。在將所形成的殺蟲(chóng)微囊施于靶害蟲(chóng)的環(huán)境時(shí)，所述微囊將Bt毒素包含于已穩(wěn)定化的細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)并保護(hù)所述毒素。合適的宿主細(xì)胞可以包括原核生物或真核生物，通常被限制于那些不會(huì)對(duì)高等生物如哺乳動(dòng)物產(chǎn)生實(shí)質(zhì)毒性的細(xì)胞。然而，當(dāng)毒性物質(zhì)不穩(wěn)定或者施加水平足夠低以至可以避免對(duì)哺乳動(dòng)物宿主的任何可能的毒性時(shí)，也可以使用會(huì)產(chǎn)生對(duì)高等生物有毒性的物質(zhì)的生物。作為宿主，特別感興趣的是原核生物和低等真核生物，如真菌。盡管在一些情況下可以采用孢子，但是在處理時(shí)，細(xì)胞通常是完整的并且基本上處于可增殖的形式，而不是處于孢子形式。微生物細(xì)胞(例如含有Bt毒素基因的微生物)的處理可以通過(guò)化學(xué)或物理手段進(jìn)行，或者通過(guò)化學(xué)和/或物理手段的組合進(jìn)行，只要該技術(shù)不會(huì)有害地影響毒素的性質(zhì)并且不會(huì)消除細(xì)胞保護(hù)毒素的能力即可。化學(xué)試劑的實(shí)例是鹵化劑，特別是原子序號(hào)17-80的鹵素。更特別地，碘可以在溫和的條件下使用足夠長(zhǎng)的時(shí)間以獲得期望的結(jié)果。其它合適的技術(shù)包括醒處理，如戍二醒；抗感染劑處理，如氯化苯甲烴銨(zephiran chloride)和氯化十六燒卩比唳(cerylpyridinium chloride);醇處理,如異丙醇和乙醇；多種組織固定劑處理，如Lugol碘、布安氏固定劑(Bouin’ s fixative)、多種酸和海利氏固定劑(Helly’ sfixative)(參見(jiàn)Humason, Gretchen L. , Animal Tissue Techniques, ff. H. Freeman and Company, 1967);或物理(加熱)和化學(xué)劑的組合，它們?cè)诎鸭?xì)胞施加于宿主環(huán)境時(shí)可以保留和延長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的毒素的活性。物理手段的實(shí)例為短波輻射，如Y-輻射和X-輻射、冷凍、UV照射、冷凍干燥等。用于處理微生物細(xì)胞的方法在美國(guó)專利No. 4，695，455和4，695，462中公開(kāi)，所述專利通過(guò)提述并入本文。細(xì)胞一般具有增強(qiáng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，可提高對(duì)環(huán)境條件的抗性。當(dāng)殺蟲(chóng)劑處于原型(proform)時(shí),所選的細(xì)胞處理方法應(yīng)當(dāng)不抑制殺蟲(chóng)劑被祀害蟲(chóng)病原體從原型加工成成熟形式。例如，甲醛會(huì)交聯(lián)蛋白質(zhì)并可抑制多肽殺蟲(chóng)劑原型的加工。處理的方法應(yīng)當(dāng)能夠保留至少相當(dāng)部分的毒素的生物可用性或生物活性。出于生產(chǎn)目的在選擇宿主細(xì)胞時(shí)特別感興趣的特征包括將Bt基因引入宿主的便宜性，表達(dá)系統(tǒng)的可用性，表達(dá)效率，殺蟲(chóng)劑在宿主體內(nèi)的穩(wěn)定性，和附加遺傳能力的存在性。用作殺蟲(chóng)劑微囊的感興趣特征包括對(duì)殺蟲(chóng)劑的保護(hù)質(zhì)量，如厚細(xì)胞壁、染色和細(xì)胞內(nèi)包裝或形成包涵體；在含水環(huán)境中的存活；缺乏哺乳動(dòng)物毒性；吸引害蟲(chóng)攝食；容易殺死和固定而不會(huì)傷害毒素；等等。其它的考慮包括配制和操作的便宜性、經(jīng)濟(jì)性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性等。細(xì)胞生長(zhǎng)。含有Bt殺蟲(chóng)基因的細(xì)胞宿主可以在任何常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中DNA構(gòu)建體提供選擇優(yōu)勢(shì)，提供選擇性培養(yǎng)基使得基本上全部或者全部的細(xì)胞保留Bt基因。然后可以根據(jù)常規(guī)方法收獲這些細(xì)胞。可選擇地，細(xì)胞可以在收獲之前被處理。產(chǎn)生本發(fā)明毒素的Bt細(xì)胞可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)培養(yǎng)基和發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)。當(dāng)完成發(fā)酵循環(huán)時(shí)，可以首先通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的手段將Bt孢子和結(jié)晶與發(fā)酵液分離來(lái)收獲細(xì)菌?；厥盏腂t孢子和結(jié)晶可以通過(guò)添加表面活性劑、分散劑、惰性載體和其它有利于操作和施用于特定靶害蟲(chóng)的組分配制成可潤(rùn)濕的粉末、液體濃縮物、顆粒或其它配制物。這些配制物和施用步驟是本領(lǐng)域眾所周知的。配制物。含有引誘劑和Bt分離物孢子、結(jié)晶和毒素的配制的誘餌顆粒，或者含有可以從本文公開(kāi)的Bt分離物中獲得的基因的重組微生物，可施于土壤。配制的產(chǎn)品也能夠作為種子包被或根處理或全植物處理在作物周期(crop cycle)的晚期施加。Bt細(xì)胞的植物和土壤處理可以作為可潤(rùn)濕的粉末、顆?；驂m埃通過(guò)與多種惰性材料混合而加以利用，所述惰性材料如無(wú)機(jī)礦物質(zhì)(層狀硅酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等)或植物材料(粉末狀玉米穗軸、稻殼、核桃殼等)。配制物可以包括展布劑-粘著劑佐劑(spreader-stickeradjuvant)、穩(wěn)定劑、其它殺蟲(chóng)添加劑或表面活性劑。液體配制物可為基于水的或非水的，并作為泡沫、凝膠、懸浮液、可乳化的濃縮物等利用。成分可以包括流變劑、表面活性劑、乳化齊U、分散劑或聚合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，殺蟲(chóng)劑濃度可以變化很大，取決于特定制劑的性質(zhì)，特別是它是否是濃縮的或者是否直接使用。殺蟲(chóng)劑以按重量計(jì)至少1%存在，并可為按重量計(jì)100%。干燥配制物中具有按重量計(jì)約1-95%的殺蟲(chóng)劑，而液體配制物一般為在液相中按重量計(jì)約1-60%的固體。配制物一般具有大約IO2-大約IO4個(gè)細(xì)胞/mg。這些配制物以每公頃大約50mg(液體或固體)至Ikg或者更多施用。所述配制物可通過(guò)噴霧、揚(yáng)塵、撒布(sprinkling)等向鱗翅類(lèi)害蟲(chóng)的環(huán)境(例如葉子或土壤)中施加。植物轉(zhuǎn)化。用于產(chǎn)生本發(fā)明殺蟲(chóng)蛋白的優(yōu)選重組宿主是轉(zhuǎn)化的植物。編碼如本文 公開(kāi)的Bt毒素蛋白的基因可以用多種本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)插入植物細(xì)胞。例如，可以獲得大量含有在大腸桿菌中的復(fù)制系統(tǒng)和允許選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的標(biāo)記的克隆載體，用于將外源基因插入高等植物。所述載體包括例如pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，具有編碼Bt毒素蛋白序列的DNA片段可在合適限制位點(diǎn)插入所述載體。最終的質(zhì)?？捎糜谵D(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli)。大腸桿菌細(xì)胞在合適的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)，然后收獲和裂解?；厥召|(zhì)粒。作為分析方法，通常進(jìn)行序列分析、限制分析、電泳和其它生物化學(xué)-分子生物學(xué)方法。在每個(gè)操作后，可以將所用的DNA序列切割并連接到下一個(gè)DNA序列。每個(gè)質(zhì)粒序列可以克隆于相同和其它的質(zhì)粒中。根據(jù)將期望基因插入植物的方法，其它的DNA序列可為必需的。如果例如使用Ti或Ri質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，那么至少Ti或Ri質(zhì)粒T-DNA的右邊界，但常常是左右兩個(gè)邊界，必須連接作為待插入基因的側(cè)翼區(qū)。用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的T-DNA的使用已經(jīng)被廣泛研究，并充分描述于EP 120516, Lee和Gelvin (2008)，Hoekema(1985) ,Fraley等(1986)，和An等(1985)中有，并且在本領(lǐng)域已經(jīng)被良好建立。一旦所插入的DNA被整合于植物基因組中，就會(huì)相對(duì)穩(wěn)定。轉(zhuǎn)化載體通常含有選擇標(biāo)記，其賦予轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞對(duì)殺生物劑或抗生素(如雙丙氨磷、卡那霉素、G418、博來(lái)霉素或潮霉素等)的抗性。因此，單獨(dú)使用的標(biāo)記應(yīng)當(dāng)允許選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，而非不含插入DNA的細(xì)胞。大量的技術(shù)可用于將DNA插入植物宿主細(xì)胞。這些技術(shù)包括使用根癌土壤桿菌或毛根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)作為轉(zhuǎn)化劑的T-DNA轉(zhuǎn)化、融合、注射、生物射彈(biolistics)(微粒子轟擊)或電穿孔以及其它可能的方法。如果使用土壤桿菌轉(zhuǎn)化，則待插入的DNA必須被克隆入特殊的質(zhì)粒，即克隆入中間載體或者克隆入二元載體中。中間載體可以通過(guò)同源重組整合入Ti或Ri質(zhì)粒，歸因于與T-DNA中的序列同源的序列。Ti或Ri質(zhì)粒還包括T-DNA轉(zhuǎn)移必需的vir區(qū)(vir region)。中間載體自身在土壤桿菌中不能復(fù)制。中間載體可以通過(guò)輔助質(zhì)粒(接合)轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌中。雙元載體自身能夠在大腸桿菌和土壤桿菌屬中復(fù)制。它們包括選擇標(biāo)記基因和被T-DNA左右邊界區(qū)框定的接頭或多接頭。它們能夠被直接轉(zhuǎn)化進(jìn)入土壤桿菌屬(Holsters等，1978)。用作宿主細(xì)胞的土壤桿菌屬包括攜帶致病區(qū)的質(zhì)粒。該致病區(qū)是將T-DNA轉(zhuǎn)移入植物細(xì)胞所必需的?？梢院蓄~外的T-DNA。使用如此轉(zhuǎn)化的細(xì)菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞?？梢杂欣赜酶┩寥罈U菌或毛根土壤桿菌培養(yǎng)植物外植體，用于將DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。然后在含有用于篩選的殺生物劑或抗生素的合適培養(yǎng)基中從感染的植物材料(例如葉片、莖桿區(qū)段、根，還有原生質(zhì)體或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞)再生整個(gè)植物。然后測(cè)試如此獲得的植物是否存在插入的DNA。在注射和電穿孔的情況中，對(duì)質(zhì)粒沒(méi)有特殊的要求?？梢允褂闷胀ǖ馁|(zhì)粒，例如PUC衍生物。被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以通常的方式在植物內(nèi)生長(zhǎng)。它們能夠形成生殖細(xì)胞并將轉(zhuǎn)化的性狀傳遞到后代植物。這些植物可以正常的方式生長(zhǎng)并與具有相同轉(zhuǎn)化遺傳因子和其它遺傳因子的植物雜交。所得的雜交個(gè)體具有相應(yīng)的表型特征。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用其中密碼子選擇已對(duì)植物進(jìn)行優(yōu)化的基因轉(zhuǎn)化植物。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利No. 5，380，831，其通過(guò)提述并入本文。雖然本文例示了一些截短的毒素，但是在Bt領(lǐng)域中眾所周知的是，130kDa型(全長(zhǎng))毒素具有作為核心毒素的N端半部和作為原毒素“尾”的C端半部。因此，適當(dāng)?shù)摹拔病笨膳c本發(fā)明的截短/核心毒素一起使用。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利No. 6，218，188和美國(guó)專利No. 6，673，990。此外，用于生成在植物中使用的合成Bt基因的方法是本領(lǐng)域已知的(Stewart和Burgin, 2007)。優(yōu)選的轉(zhuǎn)化 植物的一個(gè)非限制性實(shí)例是能育的玉米植物，其包含編碼CrylAb蛋白的植物可表達(dá)基因，并進(jìn)一步包含編碼CrylBe蛋白的第二植物可表達(dá)基因。將CrylAb-和CrylBe-確定的性狀轉(zhuǎn)移(或漸滲)到近交(inbred)玉米種系中可以通過(guò)輪回選擇育種，例如通過(guò)回交實(shí)現(xiàn)。在這種情況下，期望的輪回親本首先與攜帶賦予CrylA-和CrylBe-確定的性狀的合適基因的近交供體(非輪回親本)雜交。然后將該雜交的后代與輪回親本回交，其后選擇所得后代的從非輪回親本轉(zhuǎn)移來(lái)的期望性狀。在與輪回親本回交3個(gè)，優(yōu)選4個(gè)，更優(yōu)選5個(gè)或更多個(gè)世代并對(duì)期望性狀進(jìn)行選擇后，后代在控制被轉(zhuǎn)移性狀的座位(loci)處是雜合體，但在大多數(shù)或者基本上全部的其它基因處則與輪回親本相似(參見(jiàn)，例如Poehlman & Sleper (1995)Breeding Field Crops,第4 版，172-175;Fehr(1987)Principles of Cultivar Development,第 I 卷Theory andTechnique, 360-376)。昆蟲(chóng)抗件管理(IRM)策略。例如Roush等概述了(outline)雙毒素策略，也稱作“錐形”或“混雜”，用于管理殺蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因作物。(The Royal Society. Phil. Trans.R. Soc. Lond. B. (1998)353，1777-1786)。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局在其網(wǎng)站上(epa. gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006. htm)公布了如下的要求，要求提供非轉(zhuǎn)基因(SP，非B. t.)避難所(非Bt作物/谷物的部分(section))用于與可產(chǎn)生針對(duì)靶害蟲(chóng)的單一 Bt蛋白活性的轉(zhuǎn)基因作物一起使用。“針對(duì)抗玉米螟B(niǎo)t (CrylAb和CrylF)谷物/玉米產(chǎn)品的具體結(jié)構(gòu)要求(structuredrequirement)如下結(jié)構(gòu)避難所在谷物/玉米帶中，20%非鱗翅類(lèi)Bt谷物/玉米避難所在棉花帶中，50%非鱗翅類(lèi)Bt避難所塊狀地(blocks)內(nèi)部(即在Bt田地內(nèi))外部(即Bt田地1/2英里(如果可能1/4英里)內(nèi)的分離田地使隨機(jī)配合最大化)田地內(nèi)的條帶條帶必須至少4行寬(優(yōu)選6行)以降低幼蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)效應(yīng)”。此外，美國(guó)玉米生產(chǎn)者協(xié)會(huì)在其網(wǎng)站上(ncga. com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)也提供了關(guān)于避難所要求的相似指導(dǎo)。例如“玉米螟IRM的要求_(避難所)種植在至少20%的玉米田畝以避免雜交-在產(chǎn)棉區(qū)，避難所必須為50%
_(避難所)必須種植在避免雜交的1/2英里內(nèi)-避難所可以在Bt田內(nèi)成條狀種植；避難所條帶必須至少4行寬-只有對(duì)于靶昆蟲(chóng)達(dá)到了經(jīng)濟(jì)閾值時(shí)才可以用常規(guī)的殺蟲(chóng)劑處理避難所-基于Bt的可噴灑殺蟲(chóng)劑不能用在避難所玉米上-在每一塊具有Bt玉米的農(nóng)場(chǎng)上必須種植適當(dāng)?shù)谋茈y所”如Roush等所述(例如在1780和1784頁(yè)右欄)，將均對(duì)靶害蟲(chóng)有效并且沒(méi)有或者僅有很少交叉抗性的兩種不同蛋白混雜或錐形混雜，可允許使用更小的避難所。Roush建議，對(duì)于成功的混雜，小于避難所10%的避難所尺寸可以提供與對(duì)于單一(非錐形混雜)性狀大約50%避難所相當(dāng)?shù)目剐怨芾?。?duì)于目前可以獲得的錐形混雜的Bt谷物/玉米產(chǎn)物，美國(guó)環(huán)境保護(hù)局要求所種植的非Bt谷物/玉米的結(jié)構(gòu)避難所(一般5%)顯著小于對(duì)單一性狀產(chǎn)物的要求(一般20%)。存在提供避難所的IRM效果的多種方法，包括田地內(nèi)的多種幾何種植模式(如上所述)和包裝好(in-bag)的種子混合物,如Roush等(前文)和美國(guó)專利No. 6, 551, 962中進(jìn)一步討論的。上面的百分比或者相似的避難所比例可用于本雙重或三重混雜或錐形混雜。對(duì)于具有針對(duì)單一靶害蟲(chóng)的三個(gè)作用位點(diǎn)的三重混雜，目標(biāo)是零避難所(或者例如少于5%的避難所)。這對(duì)于商業(yè)田畝，例如超過(guò)10英畝的商業(yè)田畝，是特別真實(shí)的。本文提及或引用的所有專利、專利申請(qǐng)、臨時(shí)申請(qǐng)和出版物通過(guò)提述以其全部?jī)?nèi)容并入，其程度為它們與本說(shuō)明書(shū)的明確教導(dǎo)沒(méi)有不一致。除非特別指出或暗示，如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“一”、“一個(gè)”和“該”的意思是“至少一個(gè)”。下面是說(shuō)明實(shí)施本發(fā)明的步驟的實(shí)施例。這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是限制性的。除非另外指出，所有的百分比為按重量計(jì)，所有的溶劑混合物比例為按體積計(jì)。所有的溫度為攝氏度。
實(shí)施例實(shí)施例I - Cry蛋白的mI標(biāo)記Cry毒素的碘化純化的截短Cry毒素用Iodo-Beads (碘珠)或Iodo_gen(碘化齊[J) (Pierce)碘化。簡(jiǎn)言之，在鉛屏蔽下，兩個(gè)碘化珠用500 y L磷酸緩沖鹽水PBS (20mM磷酸鈉，0. 15M NaCl，pH7. 5)洗滌2次，并置于1.5mL離心管中。向此離心管中添加了IOOuL PBS0在排風(fēng)罩中使用合適的放射性操作技術(shù)，向具有碘珠的PBS溶液中添加0. 5mCi Na125I (17. 4Ci/mg, Lot 0114，Amersham)。組分在室溫反應(yīng)5分鐘，然后向溶液中添加2-25 u g高純度的截短Cry蛋白，再反應(yīng)3_5分鐘。通過(guò)從碘化珠移出溶液，并將溶液施加于0. 5mL在PBS中平衡的脫鹽Zeba 離心柱(Invitrogen)而終止反應(yīng)。碘化珠用10 y LPBS洗滌2次，并將洗滌溶液施加于脫鹽柱。通過(guò)在1，OOOx g離心2min將放射性溶液洗脫經(jīng)過(guò)脫鹽柱。在CrylDa情況中，使用Iodo-gen方法進(jìn)行放射性標(biāo)記程序。使用該程序，通過(guò)將IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH 8)中的Cry毒素多次通過(guò)小的0. 5ml多粘菌素柱來(lái)首先清除脂多糖(LPS)。向iodo-gen管(Pierce化學(xué)公司)添加20 u g無(wú)LPS的CrylDa毒素，然后添加0. 5mCi Na125I0反應(yīng)混合物在25。C振蕩15min。從管中除去溶液，并添加50 U 10. 2M非放射性標(biāo)記的NaI以淬滅反應(yīng)。相對(duì)于PBS透析蛋白，并更換3次緩沖液以除去任何未結(jié)合的125I。碘化Cry蛋白的放射性純度通過(guò)SDS-PAGE、磷光成像和、計(jì)數(shù)確定。簡(jiǎn)言之，通過(guò)SDS-PAGE分離2 ii I放射性蛋白。分離之后，用BioRad凝膠干燥裝置按照制造商的指示干燥凝膠。通過(guò)將干燥的凝膠包覆在Mylar膜(12 厚)中并在分子動(dòng)力學(xué)儲(chǔ)存熒光屏(Molecular Dynamics storage phosphor screen) (35cm x 43cm)下曝光 I 小時(shí)來(lái)對(duì)干燥的凝膠進(jìn)行成像。平板用分子動(dòng)力學(xué)Storm 820突光成像儀(Molecular Dynamics Storm 820phosphorimager)顯影,并使用ImageQuant 軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。用剃刀片從凝膠切下放射性條帶和緊鄰條帶的上下區(qū)域，并在Y計(jì)數(shù)器上進(jìn)行計(jì)數(shù)。僅在Cry蛋白條帶和條帶下面的區(qū)域內(nèi)檢測(cè)到放射性。在條帶上面沒(méi)有檢測(cè)到放射性，表明所有的放射性污染物均由比截短的Cry蛋白更小的蛋白組分構(gòu)成。這些組分最可能為降解產(chǎn)物。實(shí)施例2 - BBMV制備規(guī)稈可溶性BBMV’ s的制備和分級(jí)將末齡(last instar)秋粘蟲(chóng)(Spodopterafrugiperda),歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis),或 Heleothis. zea 幼蟲(chóng)禁食過(guò)夜，然后在早晨在冰上冷卻15分鐘后解剖。從體腔取出中腸組織，留下與包膜(integument)附著的后腸。將中腸置于9X體積的冰冷勻漿緩沖液(300mM甘露醇，5mM EGTA, 17mM Tris堿，pH7. 5)中，其中添加了如供應(yīng)商推薦的稀釋的Protrease Inhibitor Cocktail (混合物組分的終濃度(以 PM 表示)為 AEBSF (500)，EDTA (250mM), Bestatin (32)，E-64(0. 35)，Leupeptin (0. 25)和 Aprotinin (0. 075)) (Sigma P-2714)。用玻璃組織勻漿器 15 次沖擊將組織勻漿。通過(guò)Wolfersberger (1993)的MgCl2沉淀法制備BBMV’S。簡(jiǎn)言之，將等體積的300mM甘露醇中的24mM MgCl2溶液與中腸勻漿物混合，攪拌5分鐘，并在冰上放置15min。將溶液在4° C以2，500x g離心15min。保留上清，將沉淀懸浮于原始體積的0. 5-X稀釋的勻漿緩沖液中并再次離心。合并兩次的上清，并在4° C以27，OOOx g離心30min以形成BBMV級(jí)分。將沉淀懸浮于IOml勻漿緩沖液，補(bǔ)充于蛋白酶抑制劑并在4° C以27，000x g再次離心30min以洗滌BBMV’s。將所得的沉淀懸浮于BBMV儲(chǔ)存緩沖液(IOmM HEPES, 130mMKCl, 10%甘油，pH7. 4)中至大約3mg/mL的蛋白濃度。蛋白濃度使用Bradford法(1976)以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)確定。在冷凍樣品之前，使用Sigma測(cè)定法按照制造商的指示進(jìn)行堿性磷酸酶測(cè)定。這種標(biāo)志酶在BBMV級(jí)分中的比活性與中腸勻漿物級(jí)分中存在的相比通常增加7倍。將BBMV’ s等分成250 u L樣品，在液氮中速凍，并保存于_80° C。實(shí)施例3-測(cè)量mI Cry蛋白與BBMV蛋白的結(jié)合的方法125I Cry蛋白與BBMV’s的結(jié)合為了確定BBMV蛋白用于結(jié)合測(cè)定法中的最佳量，生成了飽和曲線。將125I放射標(biāo)記的Cry蛋白(0.5nM)與不同量的BBMV蛋白(結(jié)合緩沖液(8mM NaHPO4, 2mM KH2PO4, 150mM NaCl, 0. 1% 牛血清白蛋白，pH 7. 4)中 0-500 u g/ml)在28。C溫育lhr。總體積為0. 5ml。通過(guò)從I. 5ml離心管中取樣三份重復(fù)的150 U I反應(yīng)混合物到500 ill離心管中并在室溫將樣品以14，OOOx g離心6分鐘，而將結(jié)合的125I Cry蛋白與未結(jié)合的蛋白分離。輕柔地除去上清，用冰冷的結(jié)合緩沖液將沉淀輕柔洗滌三次。將含有沉淀的離心管底部切下，并置于13x 75-_玻璃培養(yǎng)管中。樣品各在Y計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)5分鐘。樣品中包含的計(jì)數(shù)減去背景計(jì)數(shù)(沒(méi)有任何蛋白質(zhì)的反應(yīng))，并相對(duì)于BBMV蛋白濃度繪圖。使用的蛋白的最佳量確定為0. 15mg/ml BBMV蛋白。為了確定結(jié)合動(dòng)力學(xué)，生成了飽和曲線。簡(jiǎn)言之，將BBMV’s (150 ii g/ml)與漸增濃度的125I Cry毒素(0. Ol-IOnM)在28° C溫育lhr。通過(guò)取樣每個(gè)濃度三個(gè)重復(fù)的150 yl，離心樣品并計(jì)數(shù)來(lái)確定總結(jié)合，如上所述。非特異性結(jié)合用相同的方式確定，只是向反應(yīng)混合物中添加1，OOOnM同源的胰酶消化非放射性Cry毒素以飽和全部的非特異性受體結(jié)合位點(diǎn)。計(jì)算總結(jié)合與非特異性結(jié)合之間的差值作為特異性結(jié)合。同源和異源競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法用150ii g/ml BBMV蛋白和0. 5nM的125I放射性標(biāo)記 的Cry蛋白進(jìn)行。添加到反應(yīng)混合物中的競(jìng)爭(zhēng)性非放射性標(biāo)記Cry毒素的濃度范圍是0. 045至l，000nM，并與放射性配體同時(shí)添加以確保真實(shí)的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)。溫育在28° C進(jìn)行l(wèi)h，與其受體毒素結(jié)合的125I Cry蛋白的量如上所述地減去非特異性結(jié)合來(lái)計(jì)算。在沒(méi)有任何競(jìng)爭(zhēng)配體的情況下確定百分之百的總結(jié)合。將結(jié)果在半對(duì)數(shù)圖(semi-logarithmic plot)繪圖，作為總特異性結(jié)合相對(duì)于所添加的競(jìng)爭(zhēng)性配體的濃度的百分比。實(shí)施例4-結(jié)果總結(jié)圖I顯示了 125I CrylAb (0. 5nM)在來(lái)自ECB的BBMV中的百分比特異性結(jié)合，與未標(biāo)記的同源CrylAb ( )和CrylBe ( # )競(jìng)爭(zhēng)。CrylAb同源競(jìng)爭(zhēng)的取代曲線(displacementcurve)是S型曲線,在大約0. 5nM的CrylAb顯示放射性配體的50%取代。CrylBe也可以將125I CrylBe從其結(jié)合位點(diǎn)取代下來(lái)，但是需要大約40nM濃度(CrylAb所需的80倍高)以將50%的125I CrylAb從其結(jié)合位點(diǎn)取代下來(lái)。圖2顯示了 125I CrylAb (0. 5nM)在來(lái)自FAW的BBMV中的百分比特異性結(jié)合，與未標(biāo)記的同源CrylAb( )和異源CrylBe( )競(jìng)爭(zhēng)。CrylAb同源競(jìng)爭(zhēng)的取代曲線(displacement curve)是S型曲線，在大約0. 3nM的CrylAb顯示放射性配體的50%取代。CrylBe在大約300nM或?yàn)镃rylAb所需的大約1，000倍高的濃度取代50%的125I CrylAb。誤差線代表由兩次測(cè)定獲得的值的范圍。圖3顯示了 125I CrylBe (0. 5nM)在來(lái)自FAW的BBMV中的百分比特異性結(jié)合，與未標(biāo)記的同源CrylBe( )和異源CrylAb(^)競(jìng)爭(zhēng)。CrylBe同源競(jìng)爭(zhēng)的取代曲線(displacement curve)是S型曲線，在大約2nM的CrylBe顯示放射性配體的50%取代。CrylAb在大約1，OOOnM的濃度(被取代的125I CrylBe的2，000倍高)得到大約50%的取代。與CrylBe結(jié)合相競(jìng)爭(zhēng)的CrylAb有低大約500倍的親和性。誤差線代表由三次測(cè)定獲得的值的范圍。參考文獻(xiàn)列表Heckel, D. 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CrvlAalAAA22353Schnepf 等1985Bt kurstaki HDl
CrvlAa2AAA22552Shibano 等1985Btsotto
CrylAa3BAA00257Shimizu 等1988Bt aizawai IPL7
CrvlAa4CAA31886Masson 等1989Bt entomocidus
CrvlAaSBAA04468Udayasuriyan 等1994Bt Fu-2-7 CrvlAa6AAA86265Masson 等1994Bt kurstaki NRD-12
CrvlAa7AAD46139Osman 等1999BtC12
CrvlAaS126149Liu1996僅 DNA 序列
CrvlAa9BAA77213Nagamatsu 等1999Bt dendrolimus T84A1
CrvlAalOAAD55382Hou 和 Chen1999Bt kurstaki HD-1-02
CrylAal ICAA70856Tounsi 等1999Bt kurstaki
CrvlAal2AAP謝46Yao 等2001Bt Ly30
CrvlAa13AAM44305Zhong 等2002Bt sotto
CrvlAa 14AAP40639Ren 等2002未發(fā)表
CrvlAalSAAY66993Saiika 等2005Bt INTA Mol-12
CrvlAblAAA22330Wabiko 等1986Bt berliner 171權(quán)利要求
1.ー種轉(zhuǎn)基因植物，包含編碼CrylAb殺蟲(chóng)蛋白的DNA和編碼CrylBe殺蟲(chóng)蛋白的DNA。
2.權(quán)利要求I的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物進(jìn)ー步包含編碼第三殺蟲(chóng)蛋白的DNA，所述第三蛋白選自下組Cry2A, CrylI和DIG-3。
3.權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物進(jìn)ー步包含編碼殺蟲(chóng)CrylFa蛋白的DNA，和編碼選自下組的第四殺蟲(chóng)蛋白的DNA CrylFa, Vip3Ab, CrylCa和CrylE。
4.權(quán)利要求1-3中任ー項(xiàng)的植物的種子。
5.—塊植物田，包含非-Bt避難所植物和多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1-3中任ー項(xiàng)的植物，其中所述避難所植物占所述田地中全部作物植物的少于40%。
6.權(quán)利要求5的植物田，其中所述避難所植物占所述田地中全部作物植物的少于30%。
7.權(quán)利要求5的植物田，其中所述避難所植物占所述田地中全部作物植物的少于20%。
8.權(quán)利要求5的植物田，其中所述避難所植物占所述田地中全部作物植物的少于10%。
9.權(quán)利要求5的植物田，其中所述避難所植物占所述田地中全部作物植物的少于5%。
10.權(quán)利要求5的植物田，其中所述避難所植物成塊狀或條狀種植。
11.一種種子混合物，包括來(lái)自非Bt避難所植物的避難所種子和多個(gè)權(quán)利要求4的種子，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的少于40%。
12.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的少于30%。
13.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的少于20%。
14.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的少于10%。
15.權(quán)利要求11的種子混合物，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的少于5%。
16.—種管理昆蟲(chóng)對(duì)Cry蛋白產(chǎn)生抗性的方法，所述方法包括種植種子以產(chǎn)生權(quán)利要求5-10中任ー項(xiàng)的植物田。
17.權(quán)利要求5-10中任ー項(xiàng)的田地，其中所述植物占地超過(guò)10英畝。
18.權(quán)利要求1-3中任ー項(xiàng)的植物，其中所述植物選自下組玉米、大豆和棉花。
19.權(quán)利要求18的植物，其中所述植物是玉米植物。
20.權(quán)利要求1-3中任ー項(xiàng)的植物的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞包含編碼所述CrylBe殺蟲(chóng)蛋白的所述DNA和編碼所述CrylAb殺蟲(chóng)蛋白的所述DNA,其中所述CrylBe殺蟲(chóng)蛋白與SEQ ID NO: I是至少99%同一的，而所述CrylAb殺蟲(chóng)蛋白與SEQ ID NO: 2是至少99%同一的。
21.權(quán)利要求1-3中任ー項(xiàng)的植物，其中所述CrylBe殺蟲(chóng)蛋白包含SEQIDΝΟ:1，而所述CrylAb殺蟲(chóng)蛋白包含SEQ ID NO:2。
22.—種產(chǎn)生權(quán)利要求20的植物細(xì)胞的方法。
23.—種控制歐洲玉米螟昆蟲(chóng)的方法,通過(guò)使所述昆蟲(chóng)與CrylBe殺蟲(chóng)蛋白和CrylAb殺蟲(chóng)蛋白接觸。
全文摘要
本發(fā)明包括用于控制歐洲玉米螟和/或秋粘蟲(chóng)的方法和植物，所述植物包括Cry1Ab殺蟲(chóng)蛋白和Cry1Be殺蟲(chóng)蛋白，和包含這種蛋白配對(duì)的其它蛋白的各種組合，用以延遲或防止昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102753695SQ201080063906
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者A.T.伍斯利, J.J.希茨, K.納瓦, N.P.斯托爾, S.L.伯頓, T.米德 申請(qǐng)人:陶氏益農(nóng)公司