專利名稱：Tmem22肽及包含它們的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科學(xué) 領(lǐng)域，更具體的說是癌癥治療領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及作為癌癥疫苗極為有用的新肽，以及用于治療和預(yù)防腫瘤的藥物。優(yōu)先權(quán)本申請(qǐng)要求2009年12月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/286，213、2009年12月17日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/287，650、及2010年4月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/326，380的權(quán)益,通過述及將其全部?jī)?nèi)容收入本文。
背景技術(shù)：
已經(jīng)證明，⑶8陽(yáng)性CTL可識(shí)別主要組織相容性復(fù)合物(MHC) I類分子上出現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)所衍生的表位肽，然后殺死腫瘤細(xì)胞。從TAA的第一個(gè)例子一黑素瘤抗原(MAGE)家族被發(fā)現(xiàn)起，人們主要通過免疫學(xué)手段(NPL1，2)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多其它TAA。這些TAA中的一些目前正在作為免疫治療靶標(biāo)接受臨床開發(fā)。有利的TAA對(duì)于癌細(xì)胞的擴(kuò)增和存活而言是不可或缺的。使用這樣的TAA作為免疫治療的靶標(biāo)，可以最大程度的減小人們熟知的癌細(xì)胞免疫逃逸的風(fēng)險(xiǎn)。癌細(xì)胞免疫逃逸可歸因于治療驅(qū)動(dòng)的免疫選擇(therapeutically driven immune selection)而導(dǎo)致的TAA刪除、突變或下調(diào)。因此，能夠誘導(dǎo)強(qiáng)力且特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答的新TAA的鑒定保證了進(jìn)一步開發(fā)，而且針對(duì)各種類型癌癥的肽疫苗接種策略的臨床考察正在進(jìn)行中(NPL3-10)。迄今為止，已經(jīng)有數(shù)項(xiàng)使用這些TAA衍生的肽進(jìn)行臨床試驗(yàn)的報(bào)告。不幸的是，當(dāng)前進(jìn)行的癌癥疫苗試驗(yàn)很多只觀察到較低的客觀應(yīng)答率(NPL 11-13)。因此，仍然需要鑒定能作為免疫治療靶的新TAA。為了這個(gè)目的，通過用含有23648組基因的全基因組cDNA微陣列進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，鑒定了 TMEM22 (GenBank Accession No. NM_025246, NM_001097599, NM_001097600),即跨膜蛋白22，是一種與腎細(xì)胞癌(RCC)的細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的跨膜蛋白(NPL14)。Northern印跡分析已經(jīng)確認(rèn)TMEM22在所檢查的大部分RCC臨床樣品和細(xì)胞系中特異性上調(diào)，而在所檢查的正常人組織中的表達(dá)幾乎檢測(cè)不到。此外，還顯示用特異性SiRNA下調(diào)TMEM22表達(dá)導(dǎo)致RCC細(xì)胞生長(zhǎng)的顯著降低(NPL15)。但是，關(guān)于TMEM-22在癌細(xì)胞背景下的病理生理角色和生物學(xué)功能還沒有報(bào)道。弓丨用表非專利文獻(xiàn)[NPL I]Boon T, Int J Cancer 1993,54(2):177-80[NPL 2]Boon T&van der Bruggen P, J Exp Med 1996,183 (3):725-9[NPL 3]Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996,88(20):1442-55[NPL 4]Butterfield LH et al. , Cancer Res 1999,59(13):3134-42[NPL 5]Vissers JL et al. , Cancer Res 1999, 59(21):5554-9[NPL 6]van der Burg SH et al. , J Immunol 1996, 156(9):3308-14
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明部分地基于可作為免疫療法的合適靶標(biāo)的新肽的發(fā)現(xiàn)。由于TAA —般被免疫系統(tǒng)察覺為“自身”并因此常常沒有免疫原性，適宜靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)是極其重要的。意識(shí)到TMEM22(例如如上文SEQ ID NO: 91和92所描述的，又如GenBank登錄號(hào)NM_025246, NM_001097599，NM_001097600所示)已經(jīng)被鑒定為在癌癥(包括但不限于髓細(xì)胞性白血病(AML)、膀胱癌、膽管細(xì)胞癌(CCC)、食道癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌(RCC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)中上調(diào)，本發(fā)明聚焦于TMEM22作為候選的免疫療法靶標(biāo)。為此目的，本發(fā)明至少部分地致力于TMEM22的具有誘導(dǎo)針對(duì)TMEM22的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的能力的特異性表位肽的鑒定。如下文詳細(xì)討論的，使用源自TMEM22的HLA-A*2402或HLA-A*0201結(jié)合性候選肽刺激從健康供體獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。然后建立了可特異性識(shí)別經(jīng)每種候選肽沖激的HLA-A24或HLA-A2陽(yáng)性靶細(xì)胞的CTL0綜合起來，這些結(jié)果證明這些肽是鑒定了能誘導(dǎo)針對(duì)TMEM22的強(qiáng)而特異性的免疫應(yīng)答的HLA-A24或HLA-A2限制型表位肽。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了 TMEM22具有強(qiáng)免疫原性，而且它的表位是腫瘤免疫療法的有效靶標(biāo)。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供結(jié)合HLA抗原并具有CTL誘導(dǎo)能力的分離的TMEM22 (SEQ ID N0:92)肽或其片段。這樣的肽可以用來離體誘導(dǎo)CTL或者用來施用給受試者以誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答，癌癥的例子包括但不限于AML、膀胱癌、CCC、食道癌、淋巴瘤、前列腺癌、RCC和SCLC。優(yōu)選的肽是九肽或者十肽，更優(yōu)選地是顯示強(qiáng)的CTL誘導(dǎo)能力，并具有選自 SEQID NO: I, 2，3，4，5，6，10，12，16，18，19，22，28，31，35，38，41，48，61，62，65，67，70，74，77和83的氨基酸序列的肽。本發(fā)明還考慮修飾的肽，它們具有SEQ ID NO: I, 2，3，4，5，6，10，12，16，18，19，22，28，31，35，38，41，48，61，62，65，67，70，74，77和83的氨基酸序列，其中替換、缺失或添加了一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸，只要所述的修飾的肽保留所需的原始肽的CTL誘導(dǎo)能力。進(jìn)一步，本發(fā)明提供編碼任何本發(fā)明的肽的分離的多核苷酸。這些多核苷酸可以用來誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞(APC)或者可以和本發(fā)明的肽一樣施用給受試者以誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答。當(dāng)施用給受試者時(shí)，本發(fā)明的肽被呈遞在抗原呈遞細(xì)胞的表面上，以誘導(dǎo)靶向相應(yīng)肽的CTL。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供誘導(dǎo)CTL的作用劑，此類作用劑包括一種或多種本發(fā)明的肽或者編碼此類肽的多核苷酸。本發(fā)明還考慮包含一種或多種本發(fā)明的肽或編碼此類肽的多核苷酸的藥劑，這樣的藥劑可以用來治療和/或預(yù)防癌癥，癌癥的例子包括但不限于AML、膀胱癌、CCC、食道癌、淋巴瘤、前列腺癌、RCC和SCLCjP /或防范其手術(shù)后復(fù)發(fā)，但不限于此。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供配制為用于治療和/或預(yù)防癌癥，和/或防范其手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥劑，其包含任何本發(fā)明的肽或多核苷酸。作為本發(fā)明的肽或多核苷酸的替代或者補(bǔ)充，本發(fā)明的藥劑可任選地包括呈遞任何本發(fā)明的肽的APC或外來體作為有效成分。本發(fā)明的肽或多核苷酸可以用來誘導(dǎo)在表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明的肽的復(fù)合物的APC，例如通過使源自受試者的APC與本發(fā)明的肽接觸，或者通過將編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸導(dǎo)入到APC中。這樣的APC具有針對(duì)靶肽的高的CTL誘導(dǎo)能力，因而能夠用于癌癥免疫療法。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供用于誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的APC的方法和通過該方法獲得的APC。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于誘導(dǎo)CTL的方法，所述方法包括將CD8-陽(yáng)性細(xì)胞與在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC或外來體接觸的步驟，或者導(dǎo)入包括編碼結(jié)合本發(fā)明 的肽的T細(xì)胞受體(TCR)亞單位的多核苷酸的基因的步驟。通過本方法能夠獲得的CTL也能夠用于癌癥的治療和/或預(yù)防，所述癌癥的例子包括但不限于AML、膀胱癌、CCC、食道癌、淋巴瘤、前列腺癌、RCC和SCLC。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供通過本發(fā)明的方法獲得的 CTL。本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供在有需要的受試者體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括施用含有TMEM22或其片段、編碼TMEM22或其片段的多核苷酸、以及呈遞TMEM22或其片段的APC或外來體的作用劑或組合物的步驟。本發(fā)明的應(yīng)用可延及多種與TMEM22過表達(dá)相關(guān)，或者源于TMEM22過表達(dá)的疾病中的任何一種，包括癌癥，癌癥的例子包括但不限于AML、膀胱癌、CCC、食道癌、淋巴瘤、前列腺癌、RCC和SCLC。除了上述之外，在聯(lián)系附圖
和實(shí)施例閱讀下面的詳細(xì)說明時(shí)，本發(fā)明的這些和其它目的和特征將變得更加顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解，前面的發(fā)明概要和后面的詳細(xì)說明都僅僅提出了示例性的實(shí)施方案，并不對(duì)本發(fā)明或本發(fā)明的其它可替換實(shí)施方案構(gòu)成限制。尤其是，雖然在本文中就若干具體的實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說明，應(yīng)當(dāng)理解這些描述對(duì)本發(fā)明而言是示例說明性的，不解釋成對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離如隨附的權(quán)利要求所描述的本發(fā)明的精神和范圍的前提下本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地想到本發(fā)明的多種修改和應(yīng)用。類似地，本發(fā)明的其它目的、特征、好處和優(yōu)勢(shì)是從此處的概要和下文描述的特定實(shí)施方案可以容易地想到的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以顯見的。根據(jù)上文的內(nèi)容并結(jié)合隨附的實(shí)施例、數(shù)據(jù)、附圖以及從中能夠合理推斷的內(nèi)容，或者進(jìn)一步考慮本文中引用的參考文獻(xiàn)，這樣的目的、特征、好處和優(yōu)勢(shì)是容易想到的。附圖簡(jiǎn)述本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮了下文的附圖簡(jiǎn)要說明及對(duì)本發(fā)明及其優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明后將清楚地得知本發(fā)明的各個(gè)方面的應(yīng)用。圖I描繪顯示對(duì)用源自TMEM22的肽誘導(dǎo)的CTL進(jìn)行的IFN- y ELISP0T測(cè)定的結(jié)果的照片。用 TMEM22-A24-9-390 (SEQ ID NO: I) (a)刺激的 4 號(hào)孔，用 TMEM22-A24-9-274 (SEQID NO: 2) (b)刺激的 7 號(hào)孔、用 TMEM22-A24-9-372 (SEQ ID NO: 3) (c)刺激的 3 號(hào)和 5 號(hào)孔、用 TMEM22-A24-9-331(SEQ ID NO: 4) (d)刺激的 8 號(hào)孔、用 TMEM22-A24-9-385 (SEQID NO:5) (e)刺激的 4,6 和 7 號(hào)孔、用 TMEM22-A24-9-204(SEQ ID NO:6) (f)刺激的 3，4 和 5 號(hào)孔、用 TMEM22-A24-9-297 (SEQ ID NO: 10) (g)刺激的 3，6 和 8 號(hào)孔、用TMEM22-A24-9-98 (SEQ ID NO: 12) (h)刺激的 3 號(hào)孔、用 TMEM22-A24-9-375 (SEQ IDNO: 16)⑴刺激的 2 和 4 號(hào)孔、用 TMEM22-A24-10-137(SEQ ID NO: 18) (j)刺激的 5 號(hào)孔、用 TMEM22-A24-10-140 (SEQ ID NO: 19) (k)刺激的 I 號(hào)孔、用 TMEM22-A24-10-204 (SEQ IDNO: 22) (I)刺激的 2，3 和 4 號(hào)孔、用 TMEM22-A24-10-282 (SEQ ID NO: 28) (m)刺激的 I, 6，8號(hào)孔、和用TMEM22-A24-10-177(SEQ ID NO:31) (n)刺激的7號(hào)孔中的CTL分別與對(duì)照相比顯示了強(qiáng)的IFN-Y生成。這些圖片上孔上的方框表示來自相應(yīng)孔中的細(xì)胞被擴(kuò)增以建立CTL系。對(duì)比地，作為典型的陰性數(shù)據(jù)實(shí)例，用TMEM22-A24-10-8(SEQ ID NO: 17) (o)刺激的CTL未檢出特異性的IFN-Y生成。這些圖片上孔上的方框表示來自相應(yīng)孔中的細(xì)胞被擴(kuò)增以建立CTL系。在圖中，〃+〃指示針對(duì)經(jīng)適宜肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- y生成，而〃-〃指示針對(duì)未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成。圖2描繪顯示用IFN-YELISA測(cè)定法測(cè)得的、用TMEM22-A24-9-390 (SEQID NO:I) (a), TMEM22-A24-9-274(SEQ ID NO: 2(b), TMEM22-A24-9-372 (SEQ ID NO:3) (c), TMEM22-A24-9-331 (SEQ ID NO:4) (d)TMEM22-A24-9-385 (SEQ ID NO:5)(e)，TMEM22-A24-9-204 (SEQ ID NO :6) (f)，TMEM22-A24-9-297 (SEQ ID NO:10)(g),TMEM22-A24-9-375(SEQ ID NO:16) (h)，TMEM22-A24-10-137 (SEQ ID NO:18)(i), TMEM22-A24-10-204(SEQ ID NO:22)(j)TMEM22-A24-10-282 (SEQ ID NO:28) (k),和TMEM22-A24-10-177(SEQ ID N0:31) (I)刺激的CTL的IFNi生成的線圖。結(jié)果顯示用每種肽刺激而建立的CTL與對(duì)照相比顯示了強(qiáng)的IFN-Y生成。在圖中，〃+〃指示針對(duì)經(jīng)適宜肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- y生成，而〃-〃指示針對(duì)未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- y生成。圖 3 描繪顯示用 TMEM22-A24-9-331(SEQ ID NO:4) (a), TMEM22-A24-9-204 (SEQ IDNO:6) (b), TMEM22-A24-9-297 (SEQ ID NO: 10) (c)，和 TMEM22-A24-10-204 (SEQ ID NO:22)(d)刺激的CTL系通過有限稀釋而建立的CTL克隆的IFN-Y的生成的線圖。結(jié)果證明了通過用每種肽刺激而建立的CTL克隆顯示與對(duì)照相比強(qiáng)的IFN-Y生成。在圖中，〃+〃指示針對(duì)經(jīng)適宜肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- y生成，而〃-〃指示針對(duì)未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成。圖4是描繪針對(duì)表達(dá)TMEM22和HLA_A*2402的靶細(xì)胞的特異性CTL活性的線圖。制備用HLA-A*2402或用全長(zhǎng)TMEM22基因轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞作為對(duì)照。用TMEM22-A24-9-385 (SEQ ID NO: 5)建立的 CTL 克隆顯示針對(duì)用 TMEM22 和 HLA_A*2402 二者轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞的特異性CTL活性(菱形)。另一方面，沒有檢測(cè)到顯著的針對(duì)表達(dá)HLA-A*2402 (三角形)或TMEM22 (圓形)任一的靶細(xì)胞的特異性CTL活性。 圖5a-f提供顯示對(duì)用源自TMEM22的肽誘導(dǎo)的CTL進(jìn)行的IFN- y ELI SPOT測(cè)定的結(jié)果的照片。用TMEM22-A02-9-338 (SEQ ID NO: 35) (a)刺激的4號(hào)孔、TMEM22-A02-9-381(SEQ ID NO: 38) (b)刺激的 2 號(hào)孔、TMEM22-A02-9-367 (SEQ IDNO:41) (c)刺激的 6 號(hào)孔、TMEM22-A02-9-218(SEQ ID NO:48) (d)刺激的 3 號(hào)孔、TMEM22-A02-10-217(SEQ ID NO:61) (e)刺激的 5 號(hào)孔、和 TMEM22-A02-10-304(SEQ IDNO :62) (f)刺激的8號(hào)孔中的CTL分別與對(duì)照相比顯示了強(qiáng)的IFN-Y生成。這些圖片上孔上的方框表示來自相應(yīng)孔中的細(xì)胞被擴(kuò)增以建立CTL系。對(duì)比地，作為典型的陰性數(shù)據(jù)實(shí)例，用TMEM22-A02-9-305 (SEQ ID NO: 33) (m)刺激的CTL未檢出特異性的IFN-y生成。這些圖片上孔上的方框表示來自相應(yīng)孔中的細(xì)胞被擴(kuò)增以建立CTL系。在圖中，〃+〃指示針對(duì)經(jīng)適宜肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- Y生成，而〃_〃指示針對(duì)未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- y生成。圖5g-m描繪顯示對(duì)用源自TMEM22的肽誘導(dǎo)的CTL進(jìn)行的IFN- y ELI SPOT測(cè)定的結(jié)果的照片。用TMEM22-A02-10-167 (SEQ ID NO:65) (g)刺激的4號(hào)孔、TMEM22-A02-10-363 (SEQ ID NO: 67) (h)刺激的 6 號(hào)孔、TMEM22-A02-10-103 (SEQ IDNO: 70)⑴刺激的 5 號(hào)孔、TMEM22-A02-10-195 (SEQ ID NO: 74) (j)刺激的 5 號(hào)孔、TMEM22-A02-10-229 (SEQ ID NO: 77) (k)刺激的 5 號(hào)孔，和 TMEM22-A02-10-356 (SEQ IDNO: 83)⑴刺激的6號(hào)孔中的CTL分別與對(duì)照相比顯示了強(qiáng)的IFN-Y生成。這些圖片上孔上的方框表示來自相應(yīng)孔中的細(xì)胞被擴(kuò)增以建立CTL系。對(duì)比地，作為典型的陰性數(shù)據(jù)實(shí)例，用TMEM22-A02-9-305(SEQ ID NO: 33) (m)刺激的CTL未檢出特異性的IFNi生成。這些圖片上孔上的方框表示來自相應(yīng)孔中的細(xì)胞被擴(kuò)增以建立CTL系。在圖中，〃+〃指示針對(duì)經(jīng)適宜肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- Y生成，而〃_〃指示針對(duì)未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- y 生成。圖6a-f 描繪顯示用 IFN-YELISA 測(cè)定法測(cè)得的、用 TMEM22-A02-9-338(SEQ IDNO:35) (a), TMEM22-A02-9-381 (SEQ ID NO:38)(b)，TMEM22-A02-9-218 (SEQ ID NO :48)(c), TMEM22-A02-10-217(SEQ ID NO:61) (d)，TMEM22-A02-10-304(SEQ ID NO:62)(e),和TMEM22-A02-10-167 (SEQ ID NO:65) (f)刺激的CTL的IFN-Y生成。結(jié)果顯示用每種肽刺激而建立的CTL與對(duì)照相比顯示了強(qiáng)的IFN-Y生成的線圖。在圖中，〃+〃指示針對(duì)經(jīng)適宜肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- y生成，而〃-〃指示針對(duì)未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- y生成。圖6g-j 描繪顯示用 IFN- y ELISA 測(cè)定法測(cè)得的、用 TMEM22-A02-10-363 (SEQ IDNO:67)(g), TMEM22-A02-10-103(SEQ ID NO:70)(h)，TMEM22-A02-10-195(SEQ ID NO:74)(i)，和 TMEM22-A02-10-356(SEQ ID NO:83) (j)刺激的 CTL 的 IFN-Y 生成的線圖。結(jié)果顯示用每種肽刺激而建立的CTL與對(duì)照相比顯示了強(qiáng)的IFN-Y生成。在圖中，〃+〃指示針對(duì)經(jīng)適宜肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- Y生成，而〃_〃指示針對(duì)未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- y生成。圖 7a-f 描繪顯示用 TMEM22-A02-9-381 (SEQ ID NO: 38)(a), TMEM22-A02-9-218 (SEQ ID NO:48) (b), TMEM22-A02-10-217 (SEQ ID NO:61)(c), TMEM22-A02-10-304(SEQ ID NO:62)(d)，TMEM22-A02-10-167(SEQ ID N0:65)(e)，和TMEM22-A02-10-363 (SEQ ID NO:67) (f)刺激的CTL系通過有限稀釋而建立的CTL克隆的IFN-Y的生成的線圖。結(jié)果證明了通過用每種肽刺激而建立的CTL克隆顯示與對(duì)照相比強(qiáng)的IFN-Y生成。在圖中，〃+〃指示針對(duì)經(jīng)適宜肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成，而〃-〃指示針對(duì)未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成。圖 7g-i 描繪顯示用 TMEM22-A02-10-103 (SEQ ID NO: 70)(g)，TMEM22-A02-10-195(SEQ ID NO:74) (h)和 TMEM22-A02-10-356 (SEQ ID NO:83)(i)刺激的CTL系通過有限稀釋而建立的CTL克隆的IFN-Y的生成的線圖。結(jié)果證明了通過用每種肽刺激而建立的CTL克隆顯示與對(duì)照相比強(qiáng)的IFN-Y生成。在圖中，〃+〃指示針對(duì)經(jīng)適宜肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成，而〃-〃指示針對(duì)未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成。圖8是描繪針對(duì)表達(dá)TMEM22和HLA_A*0201的靶細(xì)胞的特異性CTL活性的線圖。制備用HLA-A*0201或用全長(zhǎng)TMEM22基因轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞作為對(duì)照。用TMEM22-A02-10-195 (SEQ ID NO: 74)建立的 CTL 克隆顯示針對(duì)用 TMEM22 和 HLA_A*0201 二者轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞的特異性CTL活性(黑色菱形)。另一方面，沒有檢測(cè)到顯著的針對(duì)表達(dá)HLA-A*0201 (三角形)或TMEM22 (圓形)任一的靶細(xì)胞的特異性CTL活性。實(shí)施方案的描述現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置、和材料，不過在實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明的實(shí)施方案時(shí)可使用與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本發(fā)明材料和方法之前，要理解本發(fā)明不限于特定大小、性狀、尺度、材料、方法學(xué)、方案等，因?yàn)樗鼈兛梢蜓袑?shí)驗(yàn)和優(yōu)化而變化。還要理解，所述描述中使用的術(shù)語(yǔ)只是出于描述特定樣式或?qū)嵤┓桨傅哪康?，而非意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只會(huì)由所附權(quán)利要求來限制。
通過提述明確地將本說明書中提到的每一篇出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)的公開文本完整收入本文。然而，本文中無一處可解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒有資格憑借發(fā)明在先而早于此類公開文本。除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常知曉的意義。如果有沖突，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)例僅為舉例說明而不構(gòu)成限制。I.定義如本文中使用的，詞語(yǔ)“一個(gè)/種”、“該”、和“所述”意味著“至少一個(gè)/種”，除非
另有明確說明。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是經(jīng)過修飾的殘基或非天然存在型殘基(諸如相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物)的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。本說明書中有時(shí)使用的術(shù)語(yǔ)“寡肽”用于指長(zhǎng)度為20個(gè)殘基或更少，典型地為15個(gè)殘基或更少的本發(fā)明的肽，通常由約8個(gè)-約11個(gè)殘基，經(jīng)常為9個(gè)或10個(gè)殘基組成。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及具有與天然存在的氨基酸相似的功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸指由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及在細(xì)胞中在翻譯后被修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、和0-磷酸絲氨酸)。短語(yǔ)“氨基酸類似物”指與天然存在型氨基酸具有相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)(a碳與氫、羧基、氨基、和R基團(tuán)結(jié)合)但具有經(jīng)過修飾的R基團(tuán)或經(jīng)過修飾的主鏈的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。短語(yǔ)“氨基酸模擬物”指與具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)但發(fā)揮與一般氨基酸相似的功能的化學(xué)化合物。氨基酸在本文中可以通過它們公知的三字母符號(hào)或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的單字母符號(hào)來指稱。術(shù)語(yǔ)“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中除非另有明確說明可互換使用，而且與氨基酸類似地通過它們普遍接受的單字母代碼來指稱。
術(shù)語(yǔ)“組合物”、“物質(zhì)”、和“(作用)劑”和在本文中可以互換使用，指包含規(guī)定量的規(guī)定成分的產(chǎn)品，以及通過所述規(guī)定量的規(guī)定成分的組合直接或間接地得到的任何產(chǎn)品。這些術(shù)語(yǔ)當(dāng)與“藥劑”關(guān)聯(lián)使用時(shí)，意在涵蓋包括活性成分以及任何組成擔(dān)載體的惰性成分的產(chǎn)品，以及通過所述任何兩種或更多種成分的組合、復(fù)合或聚集，或通過一種或多種組分的解離，或通過一種或多種成分的其他類型的反應(yīng)或相互作用而直接或間接地得到的任何產(chǎn)品。相應(yīng)地，在本發(fā)明的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”指任何通過混合本發(fā)明的化合物與藥學(xué)或生理學(xué)上可接受的擔(dān)載體而制成的產(chǎn)品。本文中所用的短語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體”或“生理學(xué)上可接受的擔(dān)載體”意思是藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的材料、組合物、物質(zhì)或媒介，包括但不限于擔(dān)載或運(yùn)輸主題的支架多聚藥效團(tuán)從一個(gè)器官或身體部分到另一個(gè)器官或身體部分所涉及的液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包埋材料。術(shù)語(yǔ)“活性成分”在本文中意指作用劑或組合物中具有生物學(xué)活性或生理學(xué)活性的物質(zhì)。尤其是，在藥劑或藥物組合物中，“活性成分”是指顯示客觀的藥理學(xué)效果的物質(zhì)。例如，在用于治療或預(yù)防癌癥的藥劑或藥物組合物的場(chǎng)合，作用劑或組合物中的活性成分可直接或間接地導(dǎo)致對(duì)于癌細(xì)胞和/或組織的至少一種生物學(xué)或生理學(xué)作用。優(yōu)選地，這 樣的作用可包括減少或抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、破壞或殺死癌細(xì)胞和/或癌組織，等等。典型地，活性成分的間接效果包括誘導(dǎo)可識(shí)別或殺死癌細(xì)胞的CTL。在配制之前，“活性成分”又稱“原料藥”(bulk)、“藥物物質(zhì)” (drug substance)或“技術(shù)產(chǎn)品” (technical product)。本發(fā)明的藥劑或藥物組合物特別可以用作疫苗。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，短語(yǔ)“疫苗”(又稱“免疫原性組合物)是指在接種到動(dòng)物體內(nèi)后具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫功能的物質(zhì)。除非另有定義，術(shù)語(yǔ)“癌癥”指過表達(dá)TMEM22基因的癌癥，過表達(dá)TMEM22的癌癥的實(shí)例包括但不限于髓細(xì)胞性白血病(AML)、膀胱癌、膽管細(xì)胞癌(CCC)、淋巴瘤、食道癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌(RCC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)。除非另有定義，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞”、“細(xì)胞毒性T細(xì)胞”和“CTL”在本文中可互換使用，而且除非另有明確說明，指能夠識(shí)別非自身細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞、病毒感染 的細(xì)胞)并誘導(dǎo)此類細(xì)胞死亡的T淋巴細(xì)胞亞群。除非另有定義，本文中使用的術(shù)語(yǔ)“HLA-A24”代表性地指如HLA_A*2402等亞型。除非另有定義，本文中使用的術(shù)語(yǔ)“HLA-A2”代表性地指如HLA_A*0201或HLA-A*0206 等亞型。除非另有定義，如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“試劑盒”是指試劑及其他材料的組合?？紤]術(shù)語(yǔ)“試劑盒”可包括微陣列、芯片、標(biāo)記物、等等。術(shù)語(yǔ)“試劑盒”不意圖限于某種特定的試劑和/或材料組合。如本文中使用的，在受試者或者患者的語(yǔ)境中，短語(yǔ)“HLA-A2陽(yáng)性”是指受試者或患者純合地或者雜合地?fù)碛蠬LA-A2抗原基因,且HLA-A2抗原在受試者或患者的細(xì)胞中作為HLA抗原表達(dá)。如本文中使用的，在受試者或者患者的語(yǔ)境中，短語(yǔ)“HLA-A24陽(yáng)性”是指受試者或患者純合地或者雜合地?fù)碛蠬LA-A24抗原基因，且HLA-A24抗原在受試者或患者的細(xì)胞中作為HLA抗原表達(dá)。以本發(fā)明的材料和方法在“治療”癌癥的語(yǔ)境中有用為限，如果治療導(dǎo)致臨床上的收益，例如受試者體內(nèi)TMEM22基因表達(dá)的減少、或者癌癥的尺寸、普遍性(prevalence)或轉(zhuǎn)移潛力的降低，則認(rèn)為治療是“有效的”。當(dāng)預(yù)防性地進(jìn)行治療時(shí)，“有效的”意思是其阻礙或阻止癌癥的形成，或者阻止或減輕癌癥的臨床癥狀?！坝行浴苯Y(jié)合用于診斷或治療特定腫瘤類型的任何已知方法來確定。以本發(fā)明的材料和方法可用于“預(yù)防”和“防范”的語(yǔ)境為限，此類術(shù)語(yǔ)在本文中可互換使用，指降低緣于疾病的死亡率或發(fā)病率負(fù)擔(dān)的任何活動(dòng)。預(yù)防和防范可發(fā)生于“一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)預(yù)防水平”。一級(jí)預(yù)防和防范避免疾病的發(fā)生，而二級(jí)和三級(jí)預(yù)防和防范水平涵蓋旨在預(yù)防和防范疾病的進(jìn)展與癥狀的出現(xiàn)、以及通過恢復(fù)功能和減輕疾病相關(guān)并發(fā)癥來降低已建立的疾病的負(fù)面影響的活動(dòng)?；蛘撸A(yù)防和防范可包括旨在減輕特定病癥的嚴(yán)重性(例如降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移等)的多種多樣的預(yù)防性療法。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，治療和/或預(yù)防癌癥和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)包括任何下述步驟，諸如手術(shù)去除癌細(xì)胞、抑制癌性細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤衰退或消退、誘導(dǎo)癌癥減退和阻抑癌癥發(fā)生、及降低或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或預(yù)防可降低患癌個(gè)體死亡率及改善其預(yù)后，降低其血液中腫瘤標(biāo)志物的水平，及減輕其伴隨癌癥的可檢測(cè)癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構(gòu)成有效治療和/或預(yù)防，包括10%、20%、30%或更多降低，或?qū)崿F(xiàn)病情穩(wěn)定。 在本發(fā)明的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“抗體”指可以與指定的蛋白或其肽具有特異性反應(yīng)性的免疫球蛋白及其片段?？贵w可以包括人抗體、靈長(zhǎng)源化(primatized)抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人源化抗體、與其它蛋白或放射性標(biāo)記物融合的抗體、和抗體片段。另外，在本文中，抗體以最廣義使用，具體涵蓋完整單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現(xiàn)期望的生物學(xué)活性?！翱贵w”指示所有類別(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。II.肽為了證明源自TMEM22的肽發(fā)揮被CTL所識(shí)別的抗原的功能，對(duì)源自TMEM22 (SEQ ID NO: 92)的肽進(jìn)行了分析以確定它們是否為HLA-A24或A2限制性的抗原表位，HLA-A24或A2是經(jīng)常遇到的HLA等位基因(Date Y et al. , Tissue Antigens47:93-101，1996;Kondo A et al. , J Immunol 155:4307-12，1995;Kubo RT et al. , JImmunol 152:3913-24， 1994)?；谒鼈儗?duì)HLA-A24的結(jié)合親和力，鑒定了源自TMEM22的HLA-A24結(jié)合肽的候選者。下述肽被認(rèn)為是候選肽TMEM22-A24-9-390(SEQ ID NO:I),TMEM22-A24-9-274(SEQ ID NO:2)，TMEM22-A24-9-372(SEQ ID NO:3),TMEM22-A24-9-331(SEQ ID NO:4),TMEM22-A24-9-385(SEQ ID NO:5),TMEM22-A24-9-204(SEQ ID NO:6),TMEM22-A24-9-368(SEQ ID NO:7),TMEM22-A24-9-37(SEQ ID NO:9),TMEM22-A24-9-297(SEQ ID NO:10)TMEM22-A24-9-137(SEQ ID NO:11)，TMEM22-A24-9-98(SEQ ID NO:12)，
TMEM22-A24-9-197(SEQ ID NO:13)，TMEM22-A24-9-283(SEQ ID NO:14)，TMEM22-A24-9-142(SEQ ID NO:15)，TMEM22-A24-9-375(SEQ ID NO:16)，TMEM22-A24-10-137(SEQ ID NO:18)，TMEM22-A24-10-140(SEQ ID NO:19)，TMEM22-A24-10-153(SEQ ID NO :20),TMEM22-A24-10-170(SEQ ID NO:21)， TMEM22-A24-10-204(SEQ ID NO :22),TMEM22-A24-10-257(SEQ ID NO :23),TMEM22-A24-10-319(SEQ ID NO :24),TMEM22-A24-10-355(SEQ ID NO :25),TMEM22-A24-10-372(SEQ ID NO :26),TMEM22-A24-10-402(SEQ ID NO :27),TMEM22-A24-10-282(SEQ ID NO :28),TMEM22-A24-10-297(SEQ ID NO :29),TMEM22-A24-10-104(SEQ ID NO :30),和TMEM22-A24-10-177(SEQ ID N0:31)。此外，用加載了這些肽的樹突細(xì)胞(DC)體外刺激T細(xì)胞后，使用下述肽成功地建立了 CTL TMEM22-A24-9-390(SEQ ID NO:I),TMEM22-A24-9-274(SEQ ID NO:2)，TMEM22-A24-9-372(SEQ ID NO:3)，TMEM22-A24-9-331(SEQ ID NO:4)，TMEM22-A24-9-385(SEQ ID NO:5)，TMEM22-A24-9-204(SEQ ID NO:6)，TMEM22-A24-9-297(SEQ ID NO:10)，TMEM22-A24-9-375(SEQ ID NO:16)，TMEM22-A24-10-137(SEQ ID NO:18)，TMEM22-A24-10-204(SEQ ID NO:22)，TMEM22-A24-10-282(SEQ ID NO :28),和TMEM22-A24-10-177(SEQ ID N0:31)?；谒鼈儗?duì)HLA-A2的結(jié)合親和力，鑒定了源自TMEM22的HLA-A2結(jié)合肽的候選者。下述肽被認(rèn)為是候選肽TMEM22-A2-9-196(SEQ ID NO:32)，TMEM22-A2-9-262(SEQ ID NO :34),TMEM22-A2-9-338(SEQ ID NO :35),TMEM22-A2-9-213(SEQ ID NO :36),TMEM22-A2-9-379(SEQ ID NO :37),b L
*(9Z0N ai Q3S)69C-0T-CV-CCWaWX[2910]
‘(scon ai Qas)soc-oi-cv-ccwawx[1910]
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‘(scon ai Qas)LZZ-01-ZY-zzmm[69io]
*(czon ai Qas)S9c-0i-cv-ccwawx[89 io]
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‘(辦on ai Qas) 66-6-ZY-zzmm[82 m]
‘(作on ai Qas)L9￡-6-ZY-zzmm[lz\.o\
‘(0歹on ai Qas) occ-6-cv-ccwawx[92 m]
‘(6s:on ai Qas) ^9c-6-cv-ccwawx[92 m]
< /r^r> . ^kT ^TTP rnr ryryTijmiTT
TMEM22-A2-10-229 (SEQ ID NO :77),TMEM22-A2-10-148(SEQ ID NO :78),TMEM22-A2-10-133(SEQ ID NO :79),TMEM22-A2-10-359(SEQ ID NO :80),TMEM22-A2-10-380(SEQ ID NO:81)，TMEM22-A2-10-224(SEQ ID NO :82),TMEM22-A2-10-356(SEQ ID NO :83),TMEM22-A2-10-379(SEQ ID NO :84),
TMEM22-A2-10-291(SEQ ID NO :85),TMEM22-A2-10-301(SEQ ID NO :86),TMEM22-A2-10-378(SEQ ID NO :87),TMEM22-A2-10-302(SEQ ID NO :88),TMEM22-A2-10-287(SEQ ID NO :89)和TMEM22-A2-10-130(SEQ ID N0:90)。此外，用沖激了這些肽的樹突細(xì)胞(DC)體外刺激T細(xì)胞后，使用下述肽成功地建立了 CTL TMEM22-A2-9-338 (SEQ ID NO:35)，TMEM22-A2-9-381(SEQ ID NO:38)，TMEM22-A2-9-367(SEQ ID NO:41)，TMEM22-A2-9-218(SEQ ID NO:48)，TMEM22-A2-10-217(SEQ ID N0:61),TMEM22-A2-10-304(SEQ ID NO :62),TMEM22-A2-10-167(SEQ ID NO :65),TMEM22-A2-10-363(SEQ ID NO :67),TMEM22-A2-10-103(SEQ ID NO :70),TMEM22-A2-10-195(SEQ ID NO :74),TMEM22-A2-10-229(SEQ ID NO :77)和TMEM22-A2-10-356(SEQ ID NO:83)。這些建立的CTL針對(duì)經(jīng)相應(yīng)肽沖激的靶細(xì)胞顯示強(qiáng)且特異性的CTL活性。本文中的這些結(jié)果證明TMEM22是被CTL識(shí)別的抗原，且這些肽是TMEM22的受HLA-A24或HLA-A2限制的表位肽。由于TMEM22基因在大多數(shù)癌細(xì)胞和癌癥組織(包括但不限于例如AML、膀胱癌、CCC、食道癌、淋巴瘤、前列腺癌、RCC和SCLC的細(xì)胞和組織)中過表達(dá)，而在大多數(shù)正常器官中不表達(dá)，它是良好的免疫治療靶標(biāo)。因此，本發(fā)明提供對(duì)應(yīng)于TMEM22的被CTL識(shí)別的表位的九肽(由九個(gè)氨基酸殘基組成的肽)和十肽(由十個(gè)氨基酸殘基組成的肽)。本發(fā)明的九肽和十肽的特別優(yōu)選的例子包括那些具有選自1，2，3，4，5，6，10，12，16，18，19，22，28，31，35，38，41，48，61，62，65，67，70，74，77 和 83 的氨基酸序列的肽。一般而言，目前可以通過互聯(lián)網(wǎng)訪問的軟件程序,如Parker KC et al. , J Immunol1994Jan 1，152 (I):163-75,Buus et al. (Tissue Antigens.，62:378-84，2003),和Nielsenet al. (Protein Sci. , 12:1007-17, 2003, Bioinformatics, 20 (9) : 1388-97, 2004)等中描述的那些，可以用來在計(jì)算機(jī)上計(jì)算不同肽與HLA抗原之間的結(jié)合親和力。與HLA抗原的結(jié)合親和力可以按照例如 ParkerKC et al. , J TmmunoI 1994Jan 1，152 (I) : 163-75 和Kuzushima K et al. , Blood 2001，98 (6) : 1872-81中描述的那樣進(jìn)行測(cè)定。用于測(cè)定結(jié)合親和力的方法在例如 Journal of Immunological Methods, 1995，185:181-190. ^PProteinScience, 2000，9:1838-1846中有描述。因而可以利用這樣的軟件程序來選擇具有高度的HLA抗原結(jié)合親和力的源自TMEM22的片段。因此，本發(fā)明涵蓋由通過這些已知程序被確定為可與HLA抗原結(jié)合的TMEM22片段構(gòu)成的肽。本發(fā)明的肽可以是由TMEM22全長(zhǎng)構(gòu)成的肽。此外，本發(fā)明肽在其側(cè)翼可以具有額外的氨基酸殘基，只要所述肽保持其CTL誘導(dǎo)能力即可。本發(fā)明肽的側(cè)翼的氨基酸殘基可以由任何種類的氨基酸構(gòu)成，只要其不損害原來的肽的CTL誘導(dǎo)能力。因此，本發(fā)明涵蓋這樣的肽，其包含源自TMEM22的肽且具有對(duì)HLA抗原的結(jié)合親和力。這樣的肽典型地少于約40個(gè)氨基酸，經(jīng)常少于約20個(gè)氨基酸，通 常少于約15個(gè)氨基酸。一般而言，蛋白質(zhì)中一個(gè)、兩個(gè)、或更多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能，或者在有些情況下甚至?xí)鰪?qiáng)原蛋白質(zhì)的期望功能。事實(shí)上，已知有經(jīng)過修飾的肽(即由與原始參照序列相比其中修飾(即替換、缺失、添加和/或插入)一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基而成的氨基酸序列構(gòu)成的肽)保留原始肽的生物學(xué)活性(Mark et al.，Proc Natl Acad SciUSA 1984, 81:5662-6;Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982，10:6487-500;Dalbadie-McFarland et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可既具有CTL誘導(dǎo)能力，又具有選自1,2, 3,4, 5,6, 10，12，16，18，19，22，28，31，35，38，41，48，61，62，65，67，70，74，77和83的氨基酸序列中添加、插入、和/或替換一個(gè)、兩個(gè)或甚至更多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可，改變氨基酸序列中的單個(gè)氨基酸或少數(shù)百分比氨基酸的個(gè)別添加或替換往往會(huì)導(dǎo)致原始氨基酸側(cè)鏈的特性得以保留。因此，它們常規(guī)上稱作“保守取代”或“保守修飾”，其中對(duì)蛋白質(zhì)的改變導(dǎo)致具有與原始蛋白質(zhì)類似的性質(zhì)和功能的修飾蛋白質(zhì)。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域公知的。期望保留的氨基酸側(cè)鏈特征的例子包括例如疏水性氨基酸(A, I, L, M, F，P,ff,Y. V)、親水性氨基酸(R, D, N，C，E, Q, G，H，K，S，T)、和具有下面的共同官能團(tuán)或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A, V，L, I, P);含羥基側(cè)鏈(S，T，Y);含硫原子側(cè)鏈(C, M);含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D，N，E，Q);含堿側(cè)鏈(R，K，H);和含芳香族側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。另外，下面的八組各自含有本領(lǐng)域公認(rèn)互為保守取代的氨基酸I)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸⑴，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C),甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteins 1984)。此類保守修飾肽也被視為本發(fā)明的肽。然而，本發(fā)明的肽不限于此，可包括非保守修飾，只要該肽保留原始肽的CTL誘導(dǎo)能力。另外，經(jīng)過修飾的肽不應(yīng)排除TMEM22的多態(tài)變體、種間同源物、和等位基因中的可誘導(dǎo)CTL的肽。可以對(duì)本發(fā)明的肽插入、替換或添加氨基酸殘基，或者，可以從本發(fā)明的肽缺失氨基酸殘基，以實(shí)現(xiàn)更高的結(jié)合親和力。為了保持所需的CTL誘導(dǎo)能力，可以修飾(添加、缺失或替換)少數(shù)(例如，I個(gè)、2個(gè)或數(shù)個(gè))或小百分比的氨基酸。這里，術(shù)語(yǔ)“數(shù)個(gè)”意指5個(gè)以下的氨基酸，如4個(gè)或3個(gè)以下。要被修飾的氨基酸的百分比優(yōu)選為20%以下，更優(yōu)選15%以下，進(jìn)一步更優(yōu)選10%以下，或1-5%。
當(dāng)在免疫療法的語(yǔ)境中使用時(shí)，本發(fā)明的肽應(yīng)呈遞在細(xì)胞或外來體的表面上，優(yōu)選作為與HLA抗原的復(fù)合物。除了天然被展示的肽之外，由于已經(jīng)知道通過結(jié)合HLA抗原而被展不的妝的序列規(guī)律(J Tmmunol 1994, 152:3913; Immunogenetics 1995, 41:178; JImmunol 1994，155:4307)，可將基于此類規(guī)律的修飾引入本發(fā)明的免疫原性肽。例如，可能優(yōu)選的是將自N端起的第二個(gè)氨基酸替換為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸，和/或?qū)端氨基酸替換為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸，以增加HLA-A24結(jié)合。因此，具有I, 2，3，4，5，6，10，12，16，18，19，22，28和31的氨基酸序列，其中所述SEQ ID No的氨基酸序列的自N端起的第二個(gè)氨基酸被替換為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸，和/或其中所述SEQ ID No的氨基酸序列的C端被替換為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸的肽涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)?；蛘?，在顯示高HLA-A2結(jié)合親和力的肽中，可能優(yōu)選的是將自N端起的第二個(gè)氨基酸替換為亮氨酸或甲硫氨酸，或?qū)端氨基酸替換為纈氨酸或亮氨酸。因此，具有SEQ IDNOs: 35，38，41，48，61，62，65，67，70，74，77 和 83 的氨基酸序列，其中所述 SEQ ID No 的氨基酸序列的自N端起的第二個(gè)氨基酸被替換為亮氨酸或甲硫氨酸，和/或其中所述SEQ IDNo的氨基酸序列的C端被替換為纈氨酸或亮氨酸的肽涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。不僅可以在肽的末端氨基酸處引入替換，而且可以在肽的潛在TCR識(shí)別位置處引入替換。數(shù)項(xiàng)研究已證明了肽中的氨基酸替換可等同于或好于原來，例如CAPl、p53(264_272)、Her-2/neu(369-377)或 gplOO(209_217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T.K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Febl; 168 (3) : 1338-47. , S. 0. Dionne et al. CancerImmunol immunother. (2003)52:199-206及 S. 0. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy(2004)53, 307-314)。本發(fā)明還考慮向所描述的肽的N和/或C端添加一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸。此類具有高HLA抗原結(jié)合親和力且保留CTL誘導(dǎo)能力的修飾肽也包含在本發(fā)明之內(nèi)。然而，當(dāng)肽序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分相同時(shí)，可能誘導(dǎo)副作用，諸如自身免疫性病癥和/或針對(duì)特定物質(zhì)的變應(yīng)性癥狀。因此，優(yōu)選的是，首先利用可用的數(shù)據(jù)庫(kù)實(shí)施同源性搜索，以避免肽的序列與另一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列匹配的情況。當(dāng)根據(jù)同源性搜索清楚了即使與目標(biāo)肽相比僅相差I(lǐng)個(gè)或2個(gè)氨基酸的肽亦不存在時(shí)，可以修飾目標(biāo)肽以提高其與HLA抗原的結(jié)合親和力，和/或提高其CTL誘導(dǎo)能力，而沒有任何發(fā)生此類副作用的危險(xiǎn)。雖然如上所述的對(duì)HLA抗原具有高結(jié)合親和力的肽預(yù)期是高度有效的，但還是對(duì)根據(jù)高結(jié)合親和力的存在為指標(biāo)選出的候選肽檢查了 CTL誘導(dǎo)能力的存在。這里，短語(yǔ)“CTL誘導(dǎo)能力”指肽被呈遞到抗原呈遞細(xì)胞上時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)的能力。另外，“CTL誘導(dǎo)能力”包括肽誘導(dǎo)CTL活化、CTL增殖、促進(jìn)CTL溶解靶細(xì)胞、和提高CTL IFN-y生成的能力。CTL誘導(dǎo)能力的確認(rèn)如下來實(shí)現(xiàn)，誘導(dǎo)攜帶人MHC抗原的APC (例如B-淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、和樹突細(xì)胞(DC))，或者更具體地說，源自人外周血單核白細(xì)胞的DC，并且在用肽刺激后，與CD8-陽(yáng)性細(xì)胞混合，然后測(cè)量由CTL針對(duì)靶細(xì)胞生成和釋放的IFN-y。作為反應(yīng)系統(tǒng)，可使用已經(jīng)制成的表達(dá)人HLA抗原的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如BenMohamed L,Krishnan R, Longmate J, Auge C，Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum TmmunoI2000Aug, 61(8):764-79Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL responseby a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1transgenic mice: dependence on HLAclass II restricted T (H)response中描述的那些)。例如,可以用51Cr等放射性標(biāo)記革巴細(xì)胞，并且可以自靶細(xì)胞釋放的放射性計(jì)算細(xì)胞毒性活性?；蛘?，CTL誘導(dǎo)能力可以如下評(píng) 估測(cè)量在攜帶固定化肽的抗原呈遞細(xì)胞(APC)存在下由CTL生成和釋放的IFN- y，并使用抗IFN-Y單克隆抗體顯現(xiàn)培養(yǎng)基上的抑制區(qū)。作為如上所述檢查肽的CTL誘導(dǎo)能力的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)選自具有1，2，3，4，5，6，10，12，16，18，19，22，28，3135，38，41，48，61，62，65，67，70，74，77 和 83 所示的氨基酸序列的肽的
九肽或十肽不但具有對(duì)HLA抗原的高親和力，還具有特別高的CTL誘導(dǎo)能力。因此，例舉這些肽為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。另外，同源性分析的結(jié)果顯示了該肽與自任何其它已知人基因產(chǎn)物衍生的肽沒有顯著的同源性。這降低了用于免疫療法時(shí)發(fā)生未知的或不想要的免疫應(yīng)答的可能性。因此，也是根據(jù)這個(gè)方面，這些肽可用于在癌癥患者中引發(fā)針對(duì)TMEM22的免疫力。因此，本發(fā)明的肽，優(yōu)選由 SEQ ID NOs: I, 2, 3,4, 5,6, 10，12，16，18，19，22，28，31，35，38，41，48，61，62，65，67，70，74，77和83的氨基酸序列的肽組成。除上文所述修飾之外，還可將本發(fā)明的肽連接至其它肽，只要所得的連接肽保留所需的CTL誘導(dǎo)能力。合適的“其他肽”的例子包括從其他TAA衍生的能誘導(dǎo)CTL的肽。肽間的接頭是本領(lǐng)域公知的，例如AAY(P. M. Daftarian et al. , J Trans Med2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller et al. , J Immunol. 2000，165 : 7308-7315)或 K(S.0ta et a I. , Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et a I. , JImmunol. 2002, 168:5709-5715)。例如，非TMEM22腫瘤相關(guān)抗原肽也可以基本上同時(shí)地用來增加藉由HLA I類和/或HLAII類的免疫應(yīng)答。公認(rèn)癌細(xì)胞能表達(dá)多于一種腫瘤相關(guān)基因。因此，確定特定的受試者是否表達(dá)其他腫瘤相關(guān)基因，并進(jìn)一步將源自這樣的基因的表達(dá)產(chǎn)物的HLAI類和/或HLAII類結(jié)合肽包含在根據(jù)本發(fā)明的TMEM22組合物或疫苗中，是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)實(shí)驗(yàn)的范圍之內(nèi)的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)知曉I類HLAI和II類HLA結(jié)合肽的例子(例如參見Coulie, Stem Cells 13:393-403，1995)，而且可以以與本文公開類似的方式用于本發(fā)明。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能依照分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程來制備包括一種或多種TMEM22肽和一種或多種非TMEM22肽的多肽，或編碼此類多肽的核酸。上述連接的肽在本文中被稱為“多表位”(polytope) ”，即兩個(gè)或更多個(gè)潛在免疫原性或免疫應(yīng)答刺激性肽構(gòu)成的組，這些肽可以以各種排列方式(例如串聯(lián)、交疊)連接在一起。該多表位(或編碼該多表位的核酸)可以以標(biāo)準(zhǔn)免疫方案來施用，例如施用于動(dòng)物，以測(cè)試該多表位刺激、增強(qiáng)和/或引起免疫應(yīng)答的有效性。肽可直接地或經(jīng)使用側(cè)翼序列連接在一起以形成多表位，而且多表位作為疫苗的用途是本領(lǐng)域公知的(參見例如Thomson et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA92(13):5845-5849, 1995;Gilbert et al. , Nature Biotechnol. 15 (12):1280-1284, 1997;Thomson et al.,J Immunol. 157 (2):822-826，1996;Tarn et al.,J Exp.Med. 171(1) :299-306, 1990)。可制備含有不同數(shù)目和組合的表位的多表位并測(cè)試它們被CTL識(shí)別的情況及提高免疫應(yīng)答的功效。
此外，可將上述的肽連接至其它物質(zhì)，只要它們保留原始肽的CTL誘導(dǎo)能力。合適的物質(zhì)包括肽、脂質(zhì)、糖和糖鏈、乙?；?、天然的和合成的聚合物等。肽還可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、和/或磷酸化；前提是該修飾不破壞原始肽的生物學(xué)活性。這些修飾可賦予額外的功能(例如靶向功能和投遞功能)和/或使肽穩(wěn)定。例如，為了提高多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，本領(lǐng)域已知引入D-氨基酸、氨基酸模擬物或非天然氨基酸；此構(gòu)思也可適用于本發(fā)明多肽?？梢砸远喾N方式測(cè)定多肽的穩(wěn)定性。例如，可使用肽酶和各種生物學(xué)介質(zhì)(諸如人血漿和血清)來測(cè)試穩(wěn)定性(參見例如Verhoef etal. , Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11:291-302)。此外，如上文所述，在上述替換、缺失或添加了一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基的修飾肽中，可以篩選或選擇與原始肽相比活性相同或更高者。因此，本發(fā)明還提供由于篩選或選擇與原始肽相比活性相同或更高的修飾肽的方法。例如，所述方法可包括下述步驟a:對(duì)本發(fā)明的肽替換、刪除或添加至少一個(gè)氨基酸殘基，b:測(cè)定肽的活性，和c :選擇具有與原始肽相比相同或更高活性的肽。本文中，要測(cè)定的活性可包括MHC結(jié)合活性，APC或CTL誘導(dǎo)能力，和細(xì)胞毒活性。當(dāng)本發(fā)明的肽包含半胱氨酸殘基時(shí)，肽傾向于通過半胱氨酸殘基的SH基團(tuán)之間的二硫鍵形成二聚體。因此，本發(fā)明的肽的二聚體也包括在本發(fā)明的肽之內(nèi)。本文中，本發(fā)明的肽也可以稱為“TMEM22肽”或“TMEM22多肽”。III. TMEM22 肽的制備 本發(fā)明的肽可使用公知技術(shù)來制備。例如，肽可以通過合成、使用重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成來制備。本發(fā)明的肽可個(gè)別地合成，或合成為由兩個(gè)或更多個(gè)肽構(gòu)成的較長(zhǎng)多肽。然后可以分離，即純化或分離所述肽，使其基本上不含其它天然存在的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)及其片段或任何其它化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明的肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化等，前提是該修飾不破壞原始肽的生物學(xué)活性。其他示例性的修飾包括摻入D-氨基酸或其他可用的氨基酸模擬物，以便例如增加肽的血清半壽期?？梢愿鶕?jù)選定的氨基酸序列，借助化學(xué)合成來獲得本發(fā)明的肽。可適用于合成的常規(guī)肽合成法的例子包括但不限于(i)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976 ；(iii) Peptide Synthesis (日文)，Maruzen Co. , 1975 ；
(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis (日文)，MaruzenCo.，1985 ；(v) Development of Pharmaceuticals (second volume)(日文)，Vol. 14 (peptidesynthesis), Hirokawa, 1991 ；(vi)W099/67288 ;和(vii)Barany G. & Merrifield R. B.，Peptides Vol. 2，"Solid Phase PeptideSynthesis"，Academic Press, New York, 1980，100-118?；蛘?，可應(yīng)用任何已知的遺傳工程肽生產(chǎn)方法來獲得本發(fā)明的肽(例如Morrison J, J Bacteriology 1977，132:349-51;Clark-Curtiss&Curtiss，Methods inEnzymology (eds. Wu et al.) 1983，101:347-62)。例如，首先，制備包含處于可表達(dá)形式(例如處于相當(dāng)于啟動(dòng)子序列的調(diào)節(jié)序列下游)的編碼目標(biāo)肽的多核苷酸的合適載體，并轉(zhuǎn)化入合適的宿主細(xì)胞。然后培養(yǎng)宿主細(xì)胞以生成感興趣的肽。也可以釆用體外翻譯系統(tǒng)在體外生產(chǎn)肽。IV.多核苷酸本發(fā)明還提供編碼任何上述本發(fā)明肽的多核苷酸。這些包括源自天然存在型TMEM22 基因(GenBank Accession No. NM_025246, NM_001097599, NM_001097600 (例如，SEQID NO:91))的多核苷酸以及具有它們的經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短語(yǔ)“經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列”指編碼相同或本質(zhì)上相同的氨基酸序列的序列。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，對(duì)于任何給定蛋白質(zhì)都有極其多種功能上相同的核酸來編碼它。例如，密碼子GCA、GCC、GCG、和G⑶都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子規(guī)定為丙氨酸的任何位置處，該密碼子可改變成任何相應(yīng)所述密碼子，而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異是“沉默變異”，是保守修飾變異的一種。本文中編碼肽的每一種核酸序列也描述該核酸的每一種可能的沉默變異。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，核酸中的每一個(gè)密碼子(AUG和TGG除外，AUG在正常情況下是甲硫氨酸的唯一密碼子，而TGG在正常情況下是色氨酸的唯一密碼子)都可以被修飾以產(chǎn)生功能上相同的分子。因而，每一種所公開的序列隱含涵蓋了編碼肽的核酸的每一種沉默變異。本發(fā)明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物構(gòu)成。DNA由堿基諸如天然存在的A、T、C、和G合適地構(gòu)成，而T在RNA中被U替換。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到非天然存在的堿基也包括在多核苷酸中。本發(fā)明的多核苷酸可編碼多個(gè)本發(fā)明肽，其中它們之間有或無居間氨基酸序列存在。例如，居間氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻譯的肽的切割位點(diǎn)(例如酶識(shí)別序列)。另外，多核苷酸除編碼本發(fā)明肽的編碼序列以外還可包括任何額外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表達(dá)肽所需要的調(diào)節(jié)序列的重組多核苷酸，或者可以是具有標(biāo)志基因等等的表達(dá)載體(質(zhì)粒)。一般而言，此類重組多核苷酸可通過常規(guī)重組技術(shù)操作多核苷酸來制備，例如通過使用聚合酶和內(nèi)切核酸酶。重組和化學(xué)合成技術(shù)都可用來生成本發(fā)明的多核苷酸。例如，可以通過插入在轉(zhuǎn)染入感受態(tài)細(xì)胞后能表達(dá)的適宜載體來生成多核苷酸。或者，可借助PCR技術(shù)或通過在合適宿主中的表達(dá)來擴(kuò)增多核苷酸(參見例如Sambrook et al. , Molecular Cloning:ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)?；蛘?，可使用固相技術(shù)來合成多核苷酸，如 Beaucage SL&Iyer RP, Tetrahedron 1992，48:2223-311; Mattheset al. , EMBO J 1984，3:801-5 中記載的。V.夕卜來體(exosomes)本發(fā)明進(jìn)一步提供了稱作外來體的細(xì)胞內(nèi)囊泡，這些外來體在它們的表面上呈遞本發(fā)明肽與HLA抗原之間形成的復(fù)合體。外來體可以通過，例如在日本專利申請(qǐng)公表公報(bào)平11-510507和W099/03499中詳細(xì)描述的方法來制備，并可以用從作為治療和/或預(yù)防對(duì)象的患者獲得的APC制備。本發(fā)明的外來體可以作為疫苗以與本發(fā)明的肽相似的方式進(jìn)行接種。復(fù)合體中包含的HLA抗原的類型必須與需要治療和/或預(yù)防的受試者的類型匹配。例如，在日本人群中，HLA-A24或HLA-A2 (尤其是HLA_A*2402、HLA_A*0201和HLA-A*0206)是主要的，因而適合用于日本人患者的治療。使用在日本人和白種人中高度表達(dá)的A24型或A2型對(duì)于獲得有效的結(jié)果是有利的，而且還可以使用HLA-A*2402、 HLA-A*0201和HLA-A*0206等亞型。典型地，在臨床上，預(yù)先考察需要治療的患者的HLA抗原類型，這樣就能夠合適地選擇對(duì)這種抗原具有高水平的結(jié)合親和力、或者具有藉由抗原呈遞的CTL誘導(dǎo)能力的肽。此外，為了獲得具有高結(jié)合親和力和CTL誘導(dǎo)能力二者的肽，可以在天然存在的TMEM22部分肽的氨基酸序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行I個(gè)、2個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的替換和/或添加。當(dāng)本發(fā)明的外來體使用A24型HLA抗原時(shí)，具有SEQ ID NO: I, 2，3，4，5，6，10，12，16，18，19，22，28和31中任一序列的肽是有用的?；蛘?，當(dāng)本發(fā)明的外來體使用A2型HLA抗原時(shí)，具有選自SEQ ID NO: 5, 38,41,48，61，62，65，67，70，74，77和83的序列的肽是有用的。VI.抗原旱.遞細(xì)胞(APC)本發(fā)明還提供在其表面上呈遞在HLA抗原與本發(fā)明肽之間形成的復(fù)合物的分離的APC。所述APC可源自作為治療和/或預(yù)防對(duì)象的患者，而且可作為疫苗單獨(dú)地或與其它藥物(包括本發(fā)明的肽、外來體、或CTL)組合來施用。APC不限于特定種類的細(xì)胞，包括樹突細(xì)胞(DC) ,Langerhans細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、和活化的T細(xì)胞，已知這些細(xì)胞可在它們的細(xì)胞表面上呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，以供淋巴細(xì)胞識(shí)別。由于DC是APC中具有最強(qiáng)CTL誘導(dǎo)作用的代表性APC，DC可以用作本發(fā)明的APC。例如，可通過自外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)DC，然后在體外、離體或在體內(nèi)用本發(fā)明的肽接觸(刺激)它們來獲得APC。當(dāng)對(duì)受試者施用本發(fā)明的肽時(shí)，在受試者的身體中誘導(dǎo)出呈遞本發(fā)明肽的APC。短語(yǔ)“誘導(dǎo)APC”包括用本發(fā)明的肽或編碼本發(fā)明肽的核苷酸接觸(刺激)細(xì)胞，以在細(xì)胞的表面上呈遞在HLA抗原與本發(fā)明肽之間形成的復(fù)合物。因此，可以通過對(duì)受試者使用本發(fā)明的肽，然后從受試者收集APC本發(fā)明的APC，來獲得本發(fā)明的APC。或者，可以通過使從受試者收集的APC與本發(fā)明的肽接觸來獲得本發(fā)明的APC。本發(fā)明的APC可以單獨(dú)或者與其他藥物，包括本發(fā)明的肽、外來體或CTL組合施用給受試者，以在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答。例如，離體施用可包括下述步驟a 自第一受試者收集APC ；b 使肽接觸步驟a的APC ；并
c :對(duì)第二受試者步驟b的APC。第一受試者和第二受試者可以是同一個(gè)體，或者可以是不同個(gè)體?；蛘?，根據(jù)本發(fā)明，提供了本發(fā)明的肽用于治療誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的藥物組合物的用途。此外，本發(fā)明還提供用于制備誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的藥物組合物的方法或工藝。此外，本發(fā)明還提供用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的本發(fā)明的肽。步驟b獲得的APC可以作為疫苗施用來治療和/或預(yù)防癌癥，癌癥的例子包括但不限于AML、膀胱癌、CCC、食道癌、淋巴瘤、前列腺癌、RCC和SCLC。本發(fā)明還提供用于制備誘導(dǎo)APC的藥物組合物的方法或工藝，其中所述方法包括將本發(fā)明的肽與藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體混合或配制的步驟。依照本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的APC具有高水平的CTL誘導(dǎo)能力。在術(shù)語(yǔ)“高水平的CTL誘導(dǎo)能力”中，高水平是相對(duì)于未與肽接觸或與不能誘導(dǎo)CTL的肽接觸的APC的該水平而言的。這樣的具有高水平CTL誘導(dǎo)能力的APC除了用上文描述的方法外，還包括在體外將含有編碼本發(fā)明肽的多核苷酸的基因轉(zhuǎn)移至APC的步驟的方法來制備。所導(dǎo)入的基 因可以是DNA或RNA的形式。用于進(jìn)行導(dǎo)入的方法的例子包括但不具體限于本領(lǐng)域中常規(guī)實(shí)施的各種方法，諸如可使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔、和磷酸鈣法。更具體的說，可以如CancerRes 1996，56:5672-7; J Immunol 1998，161:5607-13; J Exp Medl996, 184:465-72;國(guó)際公開文本No. 2000-509281的已
公開日文翻譯中所述來實(shí)施。通過將基因轉(zhuǎn)移入APC，基因在細(xì)胞中經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯、等等，然后得到的蛋白質(zhì)被MHC I類或II類加工，并經(jīng)由呈遞途徑呈遞給本發(fā)明的肽。VII.細(xì)朐毒件T細(xì)朐(細(xì)朐毒件T淋巴細(xì)朐CTL)誘導(dǎo)出的針對(duì)任何本發(fā)明肽的CTL可在體內(nèi)加強(qiáng)靶向癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答，并且因此可以以與肽本身相似的方式用作疫苗。因此，本發(fā)明還提供由任何本發(fā)明肽特異性誘導(dǎo)或活化的、分離的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。此類細(xì)胞毒性T細(xì)胞可通過下述步驟來獲得(I)對(duì)受試者施用本發(fā)明的肽，并從該受試者收集CTL;或(2)在體外用本發(fā)明的肽接觸(刺激)源自受試者的APC，以及CD8-陽(yáng)性細(xì)胞或外周血單核白細(xì)胞，然后分離CTL ;或(3)在體外使CD8-陽(yáng)性細(xì)胞或外周血單核白細(xì)胞接觸在其表面上呈遞HLA抗原與肽之間形成的復(fù)合物的APC或外來體，然后分離CTL ;或(4)向CTL中導(dǎo)入包括編碼能結(jié)合本發(fā)明的肽的T細(xì)胞受體(TCR)亞單位的多核苷酸的基因。上述APC或外來體可通過上文記載的方法來制備，而且(4)之方法的詳情記載于下文“VIII. T細(xì)胞受體(TCR) ”部分。本發(fā)明的CTL可以從要進(jìn)行治療和/或預(yù)防的患者獲取，而且可以將它們單獨(dú)施用，或者與其它藥物(包括本發(fā)明的肽或外來體)組合施用以產(chǎn)生調(diào)節(jié)效果。所得到的CTL特異性針對(duì)呈遞本發(fā)明的肽(例如與用于誘導(dǎo)的肽相同的肽)的靶細(xì)胞起作用。靶細(xì)胞可以是內(nèi)源表達(dá)TMEM22的細(xì)胞，例如癌細(xì)胞，或者或被TMEM22基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；而且因本發(fā)明肽的刺激而在細(xì)胞表面上呈遞本發(fā)明肽的細(xì)胞也可充當(dāng)活化CTL攻擊的靶標(biāo)。VIII. T 細(xì)胞受體(TCR)本發(fā)明還提供包含編碼能夠形成T細(xì)胞受體(TCR)的亞單位的多肽的核酸的組合物，及使用該組合物的方法。這些TCR亞基能夠形成TCR，后者賦予T細(xì)胞以針對(duì)表達(dá)TMEM22的腫瘤細(xì)胞的特異性。通過使用本領(lǐng)域已知的方法，可鑒定出在用本發(fā)明的一種或多種肽誘導(dǎo)的CTL中表達(dá)的TCRa和0鏈的核酸序列(W02007/032255及Morganet al. , J Immunol, 171, 3288 (2003)) 0例如，優(yōu)選用PCR方法分析TCR。用于分析的PCR引物可以是,例如，作為5’側(cè)引物的5’ -R引物(5' -gtctaccaggcattcgcttcat-3’)(SEQ ID NO:93)，以及作為3’側(cè)引物的對(duì)TCRa鏈C區(qū)特異的3_TRa_C引物(5，-tcagctggaccacagccgcagcgt-3，)(SEQ ID N0:94),對(duì) TCR3 鏈 Cl 區(qū)特異的 3_TRb_Cl引物(5，-tcagaaatcctttctcttgac-3，) (SEQ ID NO:95),或?qū)?TCR 3 鏈 C2 區(qū)特異的3_TRbeta_C2 引物(5' -ctagcctctggaatcctttctctt-3’)(SEQ ID NO:96),但不限于此。衍生的TCR能夠以高親合力結(jié)合展示TMEM22肽的靶細(xì)胞，并任選地在體內(nèi)和體外介導(dǎo)針對(duì)呈遞TMEM22肽的靶細(xì)胞的高效殺傷?？梢詫⒕幋aTCR亞單位的核酸摻入合適的載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。這些載體是本領(lǐng)域公知的?？梢詫⑺龊怂峄蛘甙鼈兊妮d體有用地轉(zhuǎn)入T細(xì)胞，例如來自患者的T細(xì)胞中。有利的是，本發(fā)明提供一種即配即用型組合物，其容許快速修飾患者自己的T細(xì)胞(或其他哺乳動(dòng)物的T細(xì)胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌細(xì)胞殺傷特性的修飾型T細(xì)胞。
特異性的TCR是這樣的受體，它能夠特異性地識(shí)別本發(fā)明的肽與HLA分子的復(fù)合物，當(dāng)TCR處于T細(xì)胞的表面上時(shí)給予T細(xì)胞針對(duì)靶細(xì)胞的特異性。上述復(fù)合物的特異性識(shí)別可以通過任何已知方法來確認(rèn)，優(yōu)選的方法包括，例如，利用HLA分子和本發(fā)明的肽的四聚體分析、以及ELISP0T測(cè)定。通過實(shí)施ELISP0T測(cè)定，可以確認(rèn)在細(xì)胞表面上表達(dá)TCR的T細(xì)胞借助TCR識(shí)別細(xì)胞，且信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)被傳遞。也可以通過已知方法來確認(rèn)上述復(fù)合物當(dāng)存在于T細(xì)胞表面時(shí)能夠給予T細(xì)胞以細(xì)胞毒活性。優(yōu)選的方法包括，例如，測(cè)定針對(duì)HLA陽(yáng)性靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，例如鉻釋放測(cè)定。此外，本發(fā)明提供通過用編碼在HLA-A24的背景下結(jié)合TMEM22肽(例如SEQ ID N0:1,2, 3,4, 5,6, 10,12，16，18，19，22，28 和 31)以及在 HLA-A2 的背景下結(jié)合 SEQ ID NO: 35，38，41，48，61，62，65，67，70，74，77和83的肽的TCR亞單位多肽的核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)而制備的CTL0經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)的CTL在體內(nèi)能夠歸巢(homing)到癌細(xì)胞，并且可以利用公知的培養(yǎng)方法體外擴(kuò)增(例如 Kawakami et al. , J Immunol.，142，3452-3461 (1989))。可以利用本發(fā)明的T細(xì)胞來形成免疫原性組合物,所述組合物可以用來在需要治療或保護(hù)的患者中治療或預(yù)防癌癥(W02006/031221)。IX.藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物由于TMEM22表達(dá)在數(shù)種癌癥(包括AML、膀胱癌、CCC、食道癌、淋巴瘤、前列腺癌、RCC^PSCLC)中與正常組織相比上調(diào)，本發(fā)明的肽或編碼所述肽的多核苷酸可用于治療和/或預(yù)防癌癥或腫瘤，和/或預(yù)防它們的手術(shù)后復(fù)發(fā)。因此，本發(fā)明提供用于治療和/或預(yù)防癌癥或腫瘤，和/或預(yù)防它們的手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物，其包括一種或多種本發(fā)明肽或編碼所述肽的多核苷酸作為活性成分?；蛘?，可以在任何上述外來體或細(xì)胞諸如APC的表面上表達(dá)本發(fā)明的肽，以用作藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物。另外，上述靶向任何本發(fā)明的肽的CTL也可用作本發(fā)明藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物的活性成分。本發(fā)明的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物可用作疫苗。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，短語(yǔ)“疫苗”(也稱作“免疫原性組合物”)指具有在接種入動(dòng)物后誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的功能的物質(zhì)。本發(fā)明的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物可用于在受試者或患者(包括人和任何其它哺乳動(dòng)物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒、和黑猩猩，特別是商業(yè)上重要的動(dòng)物或馴養(yǎng)的動(dòng)物)中治療和/或預(yù)防癌癥，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供活性成分在制備用于治療癌癥或腫瘤的藥物組合物或藥劑中的用途，所述活性成分選自下組(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達(dá)形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC或外來體，和(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。 或者，本發(fā)明進(jìn)一步提供用于治療癌癥或腫瘤的選自下組的活性成分(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達(dá)形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(C)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC或外來體，和(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。或者，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備用于治療癌癥或腫瘤的藥物組合物或藥劑的方法或工藝，其中該方法或工藝包括配制藥學(xué)或生理學(xué)上可接受的擔(dān)載體與選自下組的活性成分作為活性成分的步驟(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達(dá)形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC或外來體，和(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供一種制備用于治療癌癥或腫瘤的藥物組合物或藥劑的方法或工藝，其中該方法或工藝包括混合活性成分與藥學(xué)或生理學(xué)可接受的擔(dān)載體的步驟，其中所述活性成分選自下組(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達(dá)形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(C)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC或外來體，和(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。或者，本發(fā)明的藥物組合物或藥劑可用于防范癌癥或腫瘤和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)。本發(fā)明的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物可用作疫苗。如上所述，在本發(fā)明的語(yǔ)境中，短語(yǔ)“疫苗”(也稱作“免疫原性組合物”)指具有在接種入動(dòng)物后誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的功能的物質(zhì)。本發(fā)明的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物可用于在受試者或患者(包括人和任何其它哺乳動(dòng)物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒、和黑猩猩，特別是商業(yè)上重要的動(dòng)物或馴養(yǎng)的動(dòng)物)中治療和/或預(yù)防癌癥或腫瘤，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)。依照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有選自SEQ ID NOs: I, 2，3，4，5，6，10，12，16，18，19，22，28和31中的氨基酸序列的肽是能誘導(dǎo)強(qiáng)且特異性的免疫應(yīng)答的HLA-A24限制性表位肽或候選者，且SEQ ID NOs: 35，38，41，48，61，62，65，67，70，74，77和83已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)是能誘導(dǎo)強(qiáng)且特異性的免疫應(yīng)答的HLA-A2限制型表位肽或候選者。因此，包括任何這些具有SEQ IDNOs: I, 2，3，4，5，6，10，12，16，18，19，22，28，31 和 35，38，41，48，61，62，65，67，70，74，77，83的氨基酸序列的肽的本發(fā)明藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物特別適合于對(duì)其HLA抗原分別為HLA-A24和HLA-A2的受試者施用。對(duì)于包含編碼這些肽中的任一個(gè)的多核苷酸(即本發(fā)明的多核苷酸)的藥劑、藥物物質(zhì)和藥物組合物也是如此。要用本發(fā)明的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物治療的癌癥或腫瘤不受限制，包括其中涉及(例如過表達(dá))TMEM22的所有種類的癌癥或腫瘤，包括例如AML、膀胱癌、CCC、食道癌、淋巴瘤、前列腺癌、RCC和SCLC。本發(fā)明的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物除上述活性成分之外還可 含有其它具有誘導(dǎo)針對(duì)癌性細(xì)胞的CTL的能力的肽、編碼所述其它肽的其它多核苷酸、呈遞所述其它肽的其它細(xì)胞，等等。在本文中，其它具有誘導(dǎo)針對(duì)癌性細(xì)胞的CTL的能力的肽以癌癥特異性抗原(例如已鑒定的TAA)為例，但是不限于此。如果需要，本發(fā)明的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物可任選包括其它治療性物質(zhì)作為活性成分，只要該物質(zhì)不抑制活性成分(例如任何本發(fā)明肽)的抗腫瘤效果。例如，配制劑可包括抗炎劑或組合物、鎮(zhèn)痛劑、化療劑、諸如此類。除了在藥物自身中包括其它治療性物質(zhì)之外，本發(fā)明的藥物還可以與一種或多種其它藥理學(xué)作用劑順序或同時(shí)施用。藥物和藥理學(xué)作用劑的量取決于例如所使用的藥理學(xué)作用劑的類型、所治療的疾病、及施用的時(shí)序安排和路徑。應(yīng)當(dāng)理解，除在本文中具體提及的組分之外，本發(fā)明的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物可包括與所討論的配制劑類型相關(guān)的本領(lǐng)域常規(guī)的其它制劑或組合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物可包括在制品和試劑盒中，該制品和試劑盒含有可用于治療要治療的疾病(例如癌癥)的病理狀況的材料。制品可包括任何本發(fā)明藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物的容器及標(biāo)簽。合適的容器包括瓶、管形瓶、和試管。容器可以用多種材料制成，諸如玻璃或塑料。容器上的標(biāo)簽應(yīng)指明該藥劑用于治療或預(yù)防疾病的一種或多種狀況。標(biāo)簽還可指明關(guān)于施用的指導(dǎo)等等。除上文描述的容器之外，包括本發(fā)明藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物的試劑盒還可任選進(jìn)一步包括第二容器，其中裝有藥學(xué)可接受的稀釋劑。它可進(jìn)一步包括從商業(yè)和用戶立場(chǎng)看期望的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和載有使用說明的包裝插頁(yè)。如果期望的話，藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物可在藥包或分配器裝置中提供，該藥包或分配器裝置可裝有一個(gè)或多個(gè)含有活性成分的單位劑型。例如，藥包可包括金屬或塑料箔，諸如泡罩包。藥包或分配器裝置可附有施用說明書。(I)含有肽作為活性成分的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物本發(fā)明的肽可以作為藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物直接施用，或者如果必要，通過常規(guī)配制方法來配制。在后一種情況中，除本發(fā)明的肽之外，還可以視情況包括通常用于藥物的擔(dān)載體、賦形劑、等等，沒有特別限制。此類擔(dān)載體的例子有滅菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)液、等等。另外，藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物可在必要時(shí)含有穩(wěn)定劑、懸浮液、防腐劑、表面活性劑等等。本發(fā)明的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物可用于抗癌目的。本發(fā)明的肽可制備成由兩種或更多種本發(fā)明肽構(gòu)成的組合以在體內(nèi)誘導(dǎo)CTL。肽組合可采取雞尾酒的形式，或者可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)彼此綴合。例如，可以將各個(gè)肽化學(xué)連接或表達(dá)成為單一融合多肽序列。組合中的各個(gè)肽可以是相同的或不同的。通過施用本發(fā)明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后誘導(dǎo)出與所展示的肽與HLA抗原之間形成的復(fù)合物特異性起反應(yīng)的CTL?；蛘?，可以通過從受試者分離APC (例如DC)，并用本發(fā)明的肽刺激它們，來獲得在其細(xì)胞表面上展示任何本發(fā)明的肽的APC，將這些APC重新施用給受試者而在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)出CTL,結(jié)果,可提高針對(duì)癌細(xì)胞的攻擊性。包括本發(fā)明的肽作為活性成分、用于治療和/或預(yù)防癌癥或腫瘤的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物還可包括已知可有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的佐劑。或者，所述藥劑、藥物物質(zhì)或 藥物組合物可以與其它活性成分一起施用，或者通過配制成顆粒來施用。佐劑指在與具有免疫學(xué)活性的蛋白質(zhì)一起(或順序)施用時(shí)增強(qiáng)針對(duì)該蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的化合物。本文中涵蓋的佐劑包括文獻(xiàn)中記載的那些(Clin Microbiol Rev 1994，7:277-89)。合適佐劑的例子包括但不限于磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素等等，但不限于此。另外，可方便地使用脂質(zhì)體配制劑、其中肽結(jié)合至幾微米直徑的珠子的顆粒配制齊U、和其中脂質(zhì)結(jié)合至肽的配制劑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽還可以作為可藥用鹽的形式施用。所述鹽的優(yōu)選實(shí)例包括與堿金屬的鹽、與金屬的鹽、與有機(jī)堿的鹽、與有機(jī)酸的鹽、和與無機(jī)酸的鹽。本文中所用的“可藥用鹽”是指保留所述化合物的生物學(xué)有效性和性質(zhì)，通過與無機(jī)酸或堿(如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、對(duì)甲苯磺酸、水楊酸等)反應(yīng)所得到的鹽。優(yōu)選的鹽包括與堿金屬的鹽、與金屬的鹽、與有機(jī)堿的鹽、與有機(jī)酸的鹽、和與無機(jī)酸的鹽。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物可進(jìn)一步包括引發(fā)(prime) CTL的成分。已經(jīng)確認(rèn)脂質(zhì)是能夠在體內(nèi)引發(fā)針對(duì)病毒抗原的CTL的作用劑或組合物。例如，可將棕櫚酸殘基連接至賴氨酸殘基的e-和a-氨基，然后連接至本發(fā)明的肽。然后脂化肽可以在膠束或顆粒中直接施用，摻入脂質(zhì)體，或在佐劑中乳化。作為脂質(zhì)引發(fā)CTL應(yīng)答的另一個(gè)例子，大腸桿菌(E. coli)脂蛋白，諸如三棕櫚?；?S-甘油基半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(P3CSS),當(dāng)與適宜的肽共價(jià)連接時(shí),可用來引發(fā)CTL(參見例如Deres etal. , Nature 1989,342:561-4)。施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，及系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點(diǎn)附近。施用可以通過單次施用來實(shí)施，或者通過多次施用來強(qiáng)化。本發(fā)明肽的劑量可以依據(jù)要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當(dāng)加以調(diào)整，通常是0. OOlmg至IOOOmg,例如0. OOlmg至IOOOmg,例如0. Img至IOmg,而且可以每少數(shù)天施用一次至每少數(shù)月施用一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能恰當(dāng)選擇合適的劑量。(2)含有多核苷酸作為活性成分的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物本發(fā)明的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物也可含有處于可表達(dá)形式的編碼本文中公開的肽的核酸。在本文中，短語(yǔ)“處于可表達(dá)形式的”意味著多核苷酸在導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)會(huì)在體內(nèi)表達(dá)成誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的多肽。在一個(gè)例示性的實(shí)施方案中，感興趣的多核苷酸的核酸序列包括多核苷酸表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)元件。多核苷酸可具有為實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定插入靶細(xì)胞的基因組所需的配置(關(guān)于同源重組盒載體的描述參見例如Thomas KR&Capecchi MR, Cell1987,51:503-12)。參見例如 Wolff et al. , Science 1990，247:1465-8;美國(guó)專利 No. 5，580，859; 5, 589，466; 5, 804，566; 5, 739，118;5, 736，524; 5, 679，647;及 W098/04720?；贒NA的投遞技術(shù)的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介導(dǎo)的)投遞、陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合物、和顆粒介導(dǎo)的(“基因槍”)或壓力介導(dǎo)的投遞(參見例如美國(guó)專利No. 5，922，687)。本發(fā)明的肽還可用病毒或細(xì)菌載體來表達(dá)。表達(dá)載體的例子包括減毒病毒宿主，諸如牛痘或禽痘。這種辦法涉及使用例如牛痘病毒作為載體來表達(dá)編碼肽的核苷酸序列。在導(dǎo)入宿主后，重組牛痘病毒表達(dá)表達(dá)免疫原性肽，并由此引發(fā)免疫應(yīng)答?？捎糜诿庖呓臃N方案的牛痘載體和方法記載于例如美國(guó)專利No. 4，722，848。另一種載體是卡介苗(BCG，Bacille Calmette Guerin) qBCG載體記載于Stover et al. , Nature 1991，351:456-60。有很多種可用于治療性施用或免疫接種的其它載體是容易想到的，例如腺病毒和腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、去毒炭疽毒素載體、諸如此類。參見例如 Shata et al. , Mol Med Today 2000，6:66-71; Shedlock et al. , J LeukocBiol 2000,68:793-806;Hipp et al. , In Vivo 2000,14:571-85。
將多核苷酸投遞入受試者可以是直接的，其中使受試者直接暴露于攜帶多核苷酸的載體，或者是間接的，其中首先在體外用感興趣的多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將細(xì)胞移植入受試者。這兩種辦法分別稱作體內(nèi)和離體基因療法。關(guān)于基因療法的方法的一般綜述參見Goldspiel et al.，ClinicalPharmacy1993， 12:488-505;Wu and ffu,Biotherapy 1991，3:87-95;Tolstoshev,AnnRevPharmacol Toxicol 1993,33:573-96;MulIigan, Science 1993, 260:926-32;Morgan&Anderson, Ann Rev Biochem 1993,62:191-217;Trends inBiotechnology1993，11 (5):155-215。 在 eds. Ausubel et al. , Current Protocols in MolecularBiology, John ffiley&Sons, NY, 1993;及 Krieger,Gene Transfer and Expression, ALaboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990中描述的重組DNA技術(shù)領(lǐng)域的公知方法也可用于本發(fā)明。施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，而且可使用系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點(diǎn)附近。施用可以通過單次施用來實(shí)施，或者通過多次施用來強(qiáng)化。合適的擔(dān)載體或經(jīng)編碼本發(fā)明肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的多核苷酸的劑量可以依據(jù)要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當(dāng)加以調(diào)整,通常是0. OOlmg至lOOOmg，例如0. OOlmg至IOOOmg,例如0. Img至IOmg,而且可以每數(shù)天施用一次至每數(shù)月施用一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能恰當(dāng)選擇合適的劑量。X.使用肽、外來體、APC和CTL的方法本發(fā)明的肽和編碼此類肽的多核苷酸可用于誘導(dǎo)APC和CTL。本發(fā)明的外來體和APC也可用于誘導(dǎo)CTL。以及用于誘導(dǎo)針對(duì)癌癥或腫瘤的免疫應(yīng)答。肽、多核苷酸、外來體和APC可以與任何其它化合物組合使用，只要該其他的化合物不抑制CTL誘導(dǎo)能力。因此，任何前文所述的本發(fā)明的藥劑、藥物物質(zhì)或藥物組合物均可用于誘導(dǎo)CTL，而且除它們之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于誘導(dǎo)APC，如下文討論的。(I)誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞(APC)的方法本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽或多核苷酸來誘導(dǎo)具有高CTL誘導(dǎo)能力的APC的方法。本發(fā)明的方法包括在體外、離體或體內(nèi)使APC與本發(fā)明的肽接觸的步驟。例如，離體將APC與肽接觸的方法可包括下述步驟a :從受試者收集APC ;和b 使步驟a的APC與肽接觸。APC不限于特定種類的細(xì)胞，而且包括DC、Langerhans細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、和活化的T細(xì)胞，已知它們?cè)谒鼈兊募?xì)胞表面上呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，從而被淋巴細(xì)胞識(shí)另IJ。優(yōu)選地，由于DC是APC中具有最強(qiáng)CTL誘導(dǎo)能力的，可使用DC。任何本發(fā)明肽可以以它們自身或與其它肽一起使用?；蛘撸梢詫⒈景l(fā)明的肽施用給受試者以使肽在體內(nèi)接觸APC。結(jié)果，可以在 受試者的身體中誘導(dǎo)出具有高CTL誘導(dǎo)能力的APC。因此，本發(fā)明也考慮將本發(fā)明的肽施用于受試者以在體內(nèi)誘導(dǎo)APC的方法。還可以將處于可表達(dá)形式的編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸施用于受試者，使得本發(fā)明的肽在體內(nèi)表達(dá)并與APC接觸，從而在受試者的身體中誘導(dǎo)出具有高CTL誘導(dǎo)能力的APC。因此，本發(fā)明還考慮將本發(fā)明的多核苷酸施用于受試者以在體內(nèi)誘導(dǎo)APC的方法。短語(yǔ)“可表達(dá)的形式”描述于上文“IX.藥劑、藥物物質(zhì)⑵含有多核苷酸作為活性組分的藥劑、藥物物質(zhì)”部分。此外，本發(fā)明包括將本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)入APC以誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的APC。例如，該方法可包括下述步驟a 自受試者收集APC ；并b :導(dǎo)入編碼本發(fā)明肽的多核苷酸。步驟b可如上文“VI.抗原呈遞細(xì)胞”部分中所述來實(shí)施。或者，本發(fā)明提供了一種用于制備特異性誘導(dǎo)針對(duì)TMEM22的CTL活性的抗原呈遞細(xì)胞(APC)的方法，其中所述方法可包括下述步驟之一(a)在體外、離體或體內(nèi)使APC與本發(fā)明的肽接觸；和(b)將編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸導(dǎo)入APC中。(2)誘導(dǎo)CTL的方法本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的肽、多核苷酸、或外來體或APC來誘導(dǎo)CTL的方法。本發(fā)明還提供了使用編碼能形成T細(xì)胞受體(TCR)亞單位的多肽的多核苷酸來誘導(dǎo)CTL的方法，所述TCR亞單位識(shí)別本發(fā)明的肽與HLA抗原的復(fù)合物。優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)CTL的方法包括選自下組的至少一個(gè)步驟(a)使CD8-陽(yáng)性T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞和/或外來體接觸，所述抗原呈遞細(xì)胞和外來體在其表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明的肽之間形成的復(fù)合物；和(b)向⑶8-陽(yáng)性T細(xì)胞中導(dǎo)入編碼能夠形成TCR亞單位的多肽的多核苷酸，所述TCR亞單位可識(shí)別HLA抗原與本發(fā)明的肽之間形成的復(fù)合物。當(dāng)本發(fā)明的肽、多核苷酸、APC或外來體被施用給受試者后，受試者的身體中誘導(dǎo)出CTL，而且靶向癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度增強(qiáng)。因此，本發(fā)明還設(shè)想這樣的方法，其包括將本發(fā)明的肽、多核苷酸、APC或外來體施用于受試者以誘導(dǎo)APC的步驟。或者，也可通過離體使用它們來誘導(dǎo)CTL。在此場(chǎng)合，在誘導(dǎo)CTL后，活化的CTL將被返還受試者。例如，本發(fā)明的誘導(dǎo)CTL的方法可包括下述步驟a:自受試者收集APC;b :用肽接觸步驟a)的APC ;并
c :將步驟b的APC與CD8-陽(yáng)性細(xì)胞共培養(yǎng)。上文步驟c中要與⑶8-陽(yáng)性細(xì)胞共培養(yǎng)的APC也可通過將包括本發(fā)明多核苷酸的基因轉(zhuǎn)移入APC來制備，如上文“VI.抗原呈遞細(xì)胞”部分所述，但是本發(fā)明不限于此，而且涵蓋任何在其表面上有效呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的APC。作為此類APC的替代，也可使用在其表面上呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的外來體。即，本發(fā)明還設(shè)想這樣的方法，其中將在其表面上呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的外來體與CD8-陽(yáng)性細(xì)胞共培養(yǎng)。此類外來體可通過上文“V.外來體”部分中描述的方法來制備。另外，可通過將包括編碼能與本發(fā)明的肽結(jié)合的TCR亞單位的多核苷酸的基因?qū)⑶8-陽(yáng)性細(xì)胞來誘導(dǎo)CTL。此類轉(zhuǎn)導(dǎo)可如上文“VIII. T細(xì)胞受體(TCR) ”部分中所述來實(shí)施。
另外，本發(fā)明提供了一種制造用于誘導(dǎo)CTL的藥劑、藥用物質(zhì)或藥物組合物的方法或工藝，其中該方法包括混合或配制本發(fā)明的肽與藥學(xué)可接受的擔(dān)載體的步驟。(3)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法此外，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)針對(duì)涉及TMEM22的疾病的免疫應(yīng)答的方法。合適的疾病包括癌癥，其例子包括但不限于AML、膀胱癌、CCC、食道癌、淋巴瘤、前列腺癌、RCC和SCLC。本發(fā)明的方法包括施用含有任何本發(fā)明肽或編碼它們的多核苷酸的作用劑或組合物的步驟。本發(fā)明的方法還涵蓋施用呈遞任何本發(fā)明肽的外來體或APC。關(guān)于詳情參見“IX.藥劑、藥用物質(zhì)或藥物組合物”項(xiàng)，特別是描述本發(fā)明的藥劑、藥用物質(zhì)或藥物組合物作為疫苗的用途的部分。另外，可用于本發(fā)明誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法的外來體和APC詳細(xì)描述于上文“V.外來體”、“VI.抗原呈遞細(xì)胞(APC) ”、和“X.使用肽、外來體、APC^PCTdA(I)和(2)部分。本發(fā)明還提供了一種制造用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥劑、藥用物質(zhì)或藥物組合物的方法或工藝，其中該方法包括混合或配制本發(fā)明的肽與藥學(xué)可接受的擔(dān)載體的步驟。或者,本發(fā)明的方法可包括施用疫苗或藥物組合物的步驟,所述疫苗或藥物組合物包括(a)本發(fā)明的肽；(b)處于可表達(dá)的形式的編碼如本文公開的此類肽的核酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC或外來體；或(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，過表達(dá)TMEM22的癌癥可用這些活性組分來治療。所述癌癥的例子包括但不限于AML、膀胱癌、CCC、食道癌、淋巴瘤、前列腺癌、RCC和SCLC。因而，在施用包括活性組分的疫苗或藥物組合物之前，優(yōu)選確認(rèn)要治療的癌細(xì)胞或組織中的TMEM22表達(dá)水平與同一器官的正常細(xì)胞相比是否增強(qiáng)了。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療(過)表達(dá)TMEM22的癌癥的方法，該方法可包括下述步驟i)測(cè)定自具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中的TMEM22表達(dá)水平；ii)將TMEM22表達(dá)水平與正常對(duì)照比較；并iii)對(duì)具有與正常對(duì)照相比過表達(dá)TMEM22的癌癥的受試者施用至少一種選自上文所述(a)至(d)的成分?；蛘?，本發(fā)明還提供包括至少一種選自上文所述(a)至(d)的成分的疫苗或藥物組合物，其用于對(duì)具有過表達(dá)TMEM22的癌癥的受試者施用。換言之，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于鑒定要用本發(fā)明TMEM22多肽來治療的受試者的方法，所述方法包括測(cè)定源自受試者的癌細(xì)胞或組織中的TMEM22表達(dá)水平的步驟，其中該水平與該基因的正常對(duì)照水平相比的升高指示該受試者具有可用本發(fā)明TMEM22多肽來治療的癌癥。本發(fā)明的治療癌癥的方法在下面更加詳細(xì)的加以敘述。任何源自受試者的細(xì)胞或組織均可用于測(cè)定TMEM22表達(dá)水平，只要其包括目標(biāo)的TMEM22轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。合適樣品的例子包括但不僅限于身體組織與體液，例如血液、痰與尿液。優(yōu)選地，源自受試者的細(xì)胞或組織樣品含有這樣的細(xì)胞群體，該群體包括上皮細(xì)胞，更優(yōu)選癌性上皮細(xì)胞或源自懷疑為癌性的組織的上皮細(xì)胞。進(jìn)一步，如果必要，可從所得的身體組織與體液中純化所述細(xì)胞，然后將其用為源自受試者的樣品。

在本發(fā)明的語(yǔ)境下，從已知非癌性的生物樣品確定的對(duì)照水平稱作“正常對(duì)照水平”。另一方面，如果對(duì)照水平從癌性生物樣品確定，則稱作“癌對(duì)照水平”。樣品表達(dá)水平與對(duì)照水平間的差異可以相對(duì)已知表達(dá)水平不會(huì)隨著細(xì)胞的癌或非癌狀態(tài)改變的對(duì)照核酸(例如管家基因)的表達(dá)水平加以標(biāo)準(zhǔn)化。示例的對(duì)照基因包括，但不僅限于，￠-肌動(dòng)蛋白、甘油醛-3磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl。需用本方法治療的受試者優(yōu)選為哺乳動(dòng)物。例示性的哺乳動(dòng)物包括但不僅限于例如人類、非人靈長(zhǎng)類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、和牛。根據(jù)本發(fā)明，測(cè)定在自受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中TMEM22的表達(dá)水平。表達(dá)水平可在轉(zhuǎn)錄(核酸)產(chǎn)物水平確定，使用本領(lǐng)域已知方法。舉例而言，TMEM22的mRNA可通過雜交方法(例如，Northern雜交)使用探針定量。檢測(cè)可在芯片或陣列上實(shí)施。對(duì)檢測(cè)TMEM22的表達(dá)水平而言，優(yōu)選使用陣列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用TMEM22的序列信息制備上述探針。舉例而言，TMEM22的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標(biāo)記物來標(biāo)記，例如染料、熒光物質(zhì)和同位素，且所述基因的表達(dá)水平可以作為所雜交的標(biāo)記物的強(qiáng)度檢測(cè)。此外，TMEM22的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物還可通過基于擴(kuò)增的檢測(cè)方法(例如，RT-PCR)使用引物定量。此類引物也可基于所述基因的可得序列信息制備。 具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件或低嚴(yán)格條件下與TMEM22的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語(yǔ)“嚴(yán)格(雜交)條件”是指這樣的條件，在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是依賴于序列的，而且在不同的環(huán)境下會(huì)不同。較長(zhǎng)序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下觀察至IJ。一般地，嚴(yán)格條件的溫度選擇比特定序列在限定的離子強(qiáng)度和PH下的熱熔點(diǎn)(Tm)低大約5° C。Tm是(在限定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)平衡狀態(tài)下有50%的與其靶序列互補(bǔ)的探針與靶序列雜交的溫度。因?yàn)榘行蛄幸话氵^量存在，因此在Tm，平衡時(shí)50%的探針被占據(jù)。典型地，嚴(yán)格條件會(huì)是這樣的其中鹽濃度小于大約I. OM鈉離子，典型地大約0.01-1. OM鈉離子(或其它鹽)，pH7. 0-8. 3，溫度對(duì)于較短的探針或引物(例如10-50個(gè)核苷酸)是至少大約30° C，用于較長(zhǎng)的探針或引物是至少大約60° C。嚴(yán)格條件也可以通過添加去穩(wěn)定物質(zhì)，例如甲酰胺，來實(shí)現(xiàn)。
探針或引物可具有特定的大小。大小的范圍可為至少10個(gè)核苷酸，至少12個(gè)核苷酸，至少15個(gè)核苷酸，至少20個(gè)核苷酸，至少25個(gè)核苷酸，至少30個(gè)核苷酸，且探針和引物的大小范圍可為5-10個(gè)核苷酸，10-15個(gè)核苷酸，15-20個(gè)核苷酸，20-25個(gè)核苷酸，和25-30個(gè)核苷酸?；蛘?，可以檢測(cè)翻譯產(chǎn)物以進(jìn)行本發(fā)明的診斷。例如，可以確定TMEM22蛋白(SEQID NO:92)的量。測(cè)定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測(cè)定法，此類方法使用特異識(shí)別所述蛋白的抗體?？贵w可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于檢測(cè)，只要該片段或經(jīng)修飾抗體保留對(duì)TMEM22蛋白的結(jié)合能力即可。制備這些類型的用于檢測(cè)蛋白的抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價(jià)物。作為另一種基于TMEM22的翻譯產(chǎn)物檢測(cè)TMEM22基因的表達(dá)水平的方法，可利用針對(duì)TMEM22蛋白的抗體通過免疫組織化學(xué)分析觀察其染色的強(qiáng)度。意即，在這種測(cè)量中，強(qiáng)染色表明所述蛋白質(zhì)存在/水平增加，且同時(shí)表明TMEM22基因的高表達(dá)水平。 對(duì)于癌細(xì)胞中的靶基因(例如TMEM22基因)，如果其較之靶基因的對(duì)照水平(例如正常細(xì)胞中的水平)增加了例如10%，25%或50%的話，或增加到超過I. I倍，超過I. 5倍，超過2. 0倍，超過5. 0倍，超過10倍或者更多，則可以認(rèn)為其在癌細(xì)胞中的表達(dá)水平增加了。對(duì)照水平可以與癌細(xì)胞同時(shí)確定，使用先前從疾病狀態(tài)(患癌或未患癌)已知的受試者收集和保存的樣品。另外，自具有要治療的癌癥的器官的非癌性區(qū)獲得的正常細(xì)胞可用作正常對(duì)照。或者，對(duì)照水平可以借助統(tǒng)計(jì)方法，根據(jù)通過分析先前測(cè)定的來自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的TMEM22基因表達(dá)水平獲得的結(jié)果加以確定。進(jìn)一步，對(duì)照水平可以是來自先前測(cè)試過的細(xì)胞的表達(dá)模式數(shù)據(jù)庫(kù)。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，可以將生物樣品中TMEM22基因的表達(dá)水平與從多個(gè)參考樣品確定的多個(gè)對(duì)照水平比較。優(yōu)選地使用從來自與源自受試者的樣品的組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對(duì)照水平。而且，優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中TMEM22基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)值。標(biāo)準(zhǔn)值可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。例如，平均值+/-2S. D.或平均值+/-3S. D.的范圍可以用作標(biāo)準(zhǔn)值。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，從已知非癌性的生物樣品確定的對(duì)照水平稱作“正常對(duì)照水平”。另一方面，如果對(duì)照水平從癌性生物樣品確定，則會(huì)稱作“癌性對(duì)照水平”。當(dāng)TMEM22基因的表達(dá)水平相比正常表達(dá)水平有所提高，或與癌性對(duì)照水平相似/等同，則受試者可診斷為具有要治療的癌癥。本發(fā)明還提供了一種(i)診斷受試者是否具有要治療的癌癥，和/或(ii)選擇受試者進(jìn)行癌癥治療的方法，該方法包括下述步驟a)測(cè)定TMEM22在自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中的表達(dá)水平；b)將TMEM22的表達(dá)水平與正常對(duì)照水平比較；c)若TMEM22的表達(dá)水平與正常對(duì)照水平相比升高的話，將受試者診斷為具有要治療的癌癥；并d)若在步驟c)中受試者被診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇受試者進(jìn)行癌癥治療?；蛘?，此類方法包括下述步驟a)測(cè)定TMEM22在自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中的表達(dá)水平；b)將TMEM22的表達(dá)水平與癌性對(duì)照水平比較；c)若TMEM22的表達(dá)水平與癌性對(duì)照水平相似或等同的話，將受試者診斷為具有要治療的癌癥；并d)若在步驟c)中受試者被診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇受試者進(jìn)行癌癥治療。
本發(fā)明還提供了用于確定患有能用本發(fā)明的TMEM22多肽來治療的癌癥的受試者的試劑盒，其亦可用于評(píng)價(jià)癌癥的預(yù)后和/或監(jiān)測(cè)癌癥免疫療法，尤其是癌癥免疫療法的功效。合適的癌癥的示例包括，但不限于AML、膀胱癌、CCC、食道癌、淋巴瘤、前列腺癌、RCC和SCLC。更特別地，所述試劑盒優(yōu)選包含至少一種在源自受試者的癌細(xì)胞中檢測(cè)TMEM22基因表達(dá)的試劑，所述試劑可選自下組(a)用于檢測(cè)TMEM22基因的mRNA的試劑； (b)用于檢測(cè)TMEM22蛋白的試劑；和(c)用于檢測(cè)TMEM22蛋白的生物學(xué)活性的試劑。適于檢測(cè)TMEM22基因mRNA的試劑包括特異性結(jié)合或識(shí)別TMEM22mRNA的核酸，諸如具有與TMEM22mRNA的一部分互補(bǔ)的序列的寡核苷酸。這類寡核苷酸的例子有對(duì)TMEM22mRNA特異性的引物與探針。這類寡核苷酸可基于本領(lǐng)域眾所周知的方法制備。如果需要，用于檢測(cè)TMEM22mRNA的試劑可固定化在固體基質(zhì)上。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測(cè)TMEM22mRNA的試劑。另一方面，適于檢測(cè)TMEM22蛋白的試劑包括針對(duì)TMEM22蛋白的抗體。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進(jìn)一步，任何所述抗體的片段或修飾(例如，嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用作所述試劑，只要所述片段或經(jīng)修飾抗體保留與TMEM22蛋白的結(jié)合能力。為檢測(cè)蛋白制備此類抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且可在本發(fā)明中使用任何方法制備上述抗體及其等價(jià)物。進(jìn)一步，所述抗體可用能產(chǎn)生信號(hào)的分子通過直接連接或間接標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記物與標(biāo)記抗體以及檢測(cè)抗體與其靶的結(jié)合的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且本發(fā)明可使用任何標(biāo)記物與方法。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種用于檢測(cè)TMEM22蛋白的試劑。所述試劑盒可包含多于一種前述的試劑。舉例而言，從沒有癌癥或患有癌癥的受試者獲取的組織樣品可用作有用的對(duì)照試劑。本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包括其它從商業(yè)或用戶角度而言期望的材料，包括緩沖液、稀釋液、濾器、針頭、注射器和帶有使用說明書(例如，書面的、磁帶、⑶-ROM等等)的裝箱單。這些試劑之類的可標(biāo)上標(biāo)簽包含在容器中。合適的容器包括瓶、管狀瓶(vials)和試管。所述容器可用多種材料制造，例如玻璃或塑料。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述試劑是針對(duì)TMEM22mRNA的探針時(shí)，所述試劑可固定化于固體基質(zhì)例如多孔條上，以形成至少一個(gè)檢測(cè)位置。所述多孔條的測(cè)量或檢測(cè)區(qū)域可包含多個(gè)位置，每個(gè)都包含核酸(探針)。測(cè)試條亦可包含陰性和/或陽(yáng)性對(duì)照的位置。或者，對(duì)照位置可位于與測(cè)試條不同的條上。任選地，不同的檢測(cè)位置可包含不同量的固定化核酸，即，在第一個(gè)檢測(cè)位置上量較大而在后面的位置上量較小。在加入測(cè)試樣品之后，顯示可檢測(cè)信號(hào)位置的數(shù)目提供了在樣品中存在的TMEM22mRNA量的定量指征。所述檢測(cè)位置可設(shè)置成具有任何合適可檢測(cè)的形狀，通常是橫跨測(cè)試條寬度的條狀或點(diǎn)狀。本發(fā)明所述試劑盒可進(jìn)一步包括陽(yáng)性對(duì)照樣品或TMEM22標(biāo)準(zhǔn)樣品。本發(fā)明的所述陽(yáng)性對(duì)照樣品可通過收集TMEM22陽(yáng)性樣品，隨后測(cè)定其TMEM22水平來制備。此外，可將純化的TMEM22蛋白或多核苷酸添加到不表達(dá)TMEM22的細(xì)胞中以形成所述陽(yáng)性樣品或TMEM22標(biāo)準(zhǔn)品。在本發(fā)明中，純化的TMEM22可以是重組蛋白。例如，陽(yáng)性對(duì)照樣品的TMEM22水平大于截留值。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種診斷試劑盒，其包括能 夠特異性識(shí)別本發(fā)明抗體的蛋白或其部分蛋白或其免疫原性片段。本發(fā)明的蛋白的部分肽的例子包括由本發(fā)明蛋白的氨基酸序列中的至少8個(gè)、優(yōu)選15個(gè)、和更優(yōu)選20個(gè)連續(xù)氨基酸構(gòu)成的多肽。癌癥可通過使用本發(fā)明的蛋白或肽(多肽)檢測(cè)樣品(例如血液、組織)中的抗體來診斷。上文描述了用于制備本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明用于診斷癌癥的方法可通過如上所述測(cè)定抗TMEM22抗體量和相應(yīng)對(duì)照樣品中的量之間的差異來進(jìn)行。若受試者的細(xì)胞或組織含有針對(duì)該基因的表達(dá)產(chǎn)物(TMEM22)的抗體和抗TMEM22抗體的數(shù)量測(cè)定為大于截留值(與正常對(duì)照中的水平相比)的話，則該受試者懷疑患有癌癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒可包括本發(fā)明的肽及與它結(jié)合的HLA分子。使用抗原性肽和HLA分子檢測(cè)抗原特異性CTL的合適方法早已確立(例如AltmanJD et al.，Science. 1996，274(5284) :94-6)。因此，本發(fā)明肽和HLA分子形成的復(fù)合物可用于檢測(cè)方法來檢測(cè)腫瘤抗原特異性CTL，由此能夠較早檢測(cè)癌癥的復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步，它可用于選擇適合包含本發(fā)明肽作為活性組分的藥物的受試者或評(píng)估該藥物的治療效果。特別地,依照已知方法(參見例如Altman JD et al. , Science. 1996, 274(5284):94-6)，可制備放射性標(biāo)記的HLA分子和本發(fā)明肽的寡聚物復(fù)合物，諸如四聚體?？墒褂迷搹?fù)合物來對(duì)源自懷疑患有癌癥的受試者的外周血淋巴細(xì)胞中的抗原-肽特異性CTL定量。本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用如本文所述的肽表位來評(píng)估受試者的免疫學(xué)應(yīng)答的方法或診斷試劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用本文所述的HLA限制肽可作為試劑來評(píng)估或預(yù)測(cè)受試者的免疫應(yīng)答。要評(píng)估的免疫應(yīng)答可以是通過在體外或在體內(nèi)使免疫原接觸有免疫能力的細(xì)胞來誘導(dǎo)的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于評(píng)估免疫應(yīng)答的有免疫能力的細(xì)胞可以選自外周血、外周血淋巴細(xì)胞(PBL)、和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。用于收集或分離此類有免疫能力的細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的。在一些實(shí)施方案中，任何可導(dǎo)致識(shí)別和結(jié)合肽表位的抗原特異性CTL的生成的物質(zhì)或組合物均可用作所述試劑。肽試劑無需用作免疫原。用于此類分析的測(cè)定系統(tǒng)包括相對(duì)較新的技術(shù)發(fā)展，諸如四聚體、胞內(nèi)淋巴因子染色和干擾素釋放測(cè)定法、或ELISP0T測(cè)定法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，要與肽試劑接觸的有免疫能力的細(xì)胞可以是抗原呈遞細(xì)胞，包括樹突細(xì)胞。例如，本發(fā)明的肽可用于四聚體染色測(cè)定法，評(píng)估外周血單個(gè)核細(xì)胞在暴露于腫瘤細(xì)胞抗原或免疫原后抗原特異性CTL的存在。HLA四聚體復(fù)合物可用于直接顯現(xiàn)抗原特異性CTL(參見例如Ogg et al. , Science 279:2103-2106，1998;和Altman et al, Science174:94-96, 1996)和測(cè)定抗原特異性CTL群體在外周血單個(gè)核細(xì)胞樣品中的頻率。使用本發(fā)明肽的四聚體試劑可如下所述來生成。與HLA分子結(jié)合的肽在相應(yīng)HLA重鏈和P 2_微球蛋白存在下重折疊以生成三分子復(fù)合物。在該復(fù)合物中，重鏈的羧基末端在先前工程化到蛋白質(zhì)中的位點(diǎn)處被生物素化。然后，將鏈霉親合素添加至復(fù)合物以形成由三分子復(fù)合物和鏈霉親合素組成的四聚體。借助熒光標(biāo)記的鏈霉親合素，四聚體能用于對(duì)抗原特異性細(xì)胞染色。然后可鑒定細(xì)胞，例如通過流式細(xì)胞術(shù)。此類分析可用于診斷或預(yù)后目的。通過該規(guī)程鑒定的細(xì)胞也可用于治療目的。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明肽的用于免疫回憶應(yīng)答的試劑(參見例如 Bertoni et al,J.Clin. Invest. 100:503-513,1997 和 Penna et al. , J Exp.Med. 174:1565-1570, 1991)。例如，可使用特定肽對(duì)來自具有要治療的 癌癥的個(gè)體的患者PBMC樣品分析抗原特異性CTL的存在。含有單個(gè)核細(xì)胞的血液樣品可如下評(píng)估培養(yǎng)PBMC，并用本發(fā)明的肽刺激該細(xì)胞。適宜培養(yǎng)時(shí)段后，可對(duì)擴(kuò)增的細(xì)胞群體進(jìn)行分析，例如分析CTL活性。肽還可作為試劑用于評(píng)估疫苗的功效。可使用例如上文所述方法來分析自疫苗接種免疫原的患者獲得的PBMC。測(cè)定患者的HLA型，并選擇識(shí)別患者中存在的等位基因特異性分子的肽表位試劑進(jìn)行分析。疫苗的免疫原性可通過PBMC樣品中表位特異性CTL的存在來指示。本發(fā)明的肽還可用于制備抗體，使用本領(lǐng)域公知技術(shù)(參見例如CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY;和 Antibodies A LaboratoryManual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),其可作為試劑用于診斷、檢測(cè)或監(jiān)測(cè)癌癥。此類抗體可包括識(shí)別HLA分子背景中的肽的抗體，即結(jié)合肽-MHC復(fù)合物的抗體。或者，本發(fā)明還提供了多種其他應(yīng)用，本文中描述了其中一些。例如，本發(fā)明提供了一種用于診斷或檢測(cè)以TMEM22免疫原性多肽表達(dá)為特征的病癥的方法。這些方法涉及測(cè)定TMEM22HLA結(jié)合肽、或TMEM22HLA結(jié)合肽與I類HLA分子形成的復(fù)合物在生物學(xué)樣品中的表達(dá)。肽或肽和I類HLA分子形成的復(fù)合物的表達(dá)可通過用針對(duì)肽或復(fù)合物的結(jié)合配偶測(cè)定來測(cè)定或檢測(cè)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，針對(duì)肽或復(fù)合物的結(jié)合配偶可以是識(shí)別和特異性結(jié)合肽的抗體。TMEM22在生物學(xué)樣品諸如腫瘤活檢中的表達(dá)也可使用TMEM22引物通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增方案來測(cè)試。本文中呈現(xiàn)了腫瘤表達(dá)的一個(gè)例子，而且用于TMEM22擴(kuò)增的例示性條件和弓I物的進(jìn)一步公開內(nèi)容可見于W02003/27322。優(yōu)選地，診斷方法涉及使自受試者分離的生物學(xué)樣品接觸對(duì)TMEM22HLA結(jié)合肽特異性的作用劑以檢測(cè)TMEM22HLA結(jié)合肽在生物學(xué)樣品中的存在。如本文中使用的，“接觸”意味著在適宜條件(例如濃度、溫度、時(shí)間、離子強(qiáng)度)下放置生物學(xué)樣品使其足夠接近所述作用劑，以容許作用劑和生物學(xué)樣品中存在的TMEM22HLA結(jié)合肽之間的特異性相互作用。一般地，作用劑接觸生物學(xué)樣品的條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的可促進(jìn)生物學(xué)樣品中分子與其關(guān)聯(lián)物(例如蛋白質(zhì)與其受體關(guān)聯(lián)物、抗體與其蛋白質(zhì)抗原關(guān)聯(lián)物、核酸與其互補(bǔ)序列關(guān)聯(lián)物)之間的特異性相互作用的條件。用于促進(jìn)分子與其關(guān)聯(lián)物之間的特異性相互作用的例示性條件記載于授權(quán)給Low等人的美國(guó)專利No. 5，108，921。
本發(fā)明的診斷方法可以在體內(nèi)和/或在體外實(shí)施。因而，生物學(xué)樣品在本發(fā)明中可位于體內(nèi)或體外。例如，生物學(xué)樣品可以是體內(nèi)組織，而且可使用對(duì)TMEM22免疫原性多肽特異性的作用劑來檢測(cè)此類分子在組織中的存在?；蛘?，可在體外收集或分離生物學(xué)樣品(例如血液樣品、腫瘤活檢、組織提取物)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品可以是含有細(xì)胞的樣品，更優(yōu)選自要診斷或治療的受試者收集的含有腫瘤細(xì)胞的樣品。或者，診斷可使用容許通過對(duì)熒光素標(biāo)記的HLA多聚體復(fù)合物染色而直接定量抗原特異性 T 細(xì)胞的方法來進(jìn)行(例如 Altman, J. D. et al. , 1996, Science274:94; Altman, J.D. et al. , 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10330)。還提供了對(duì)胞內(nèi)淋巴因子的染色和干擾素-Y釋放測(cè)定法或ELISP0T測(cè)定法。多聚體染色、胞內(nèi)淋巴因子染色和ELISP0T測(cè)定法都表現(xiàn)出比更常規(guī)的測(cè)定法靈敏至少10倍(Murali-Krishna，K. etal. , 1998, Immunity 8:177; Lalvani, A. et al. , 1997, J. Exp. Med. 186:859; Dunbar, P. R. etal. , 1998, Curr. Biol. 8:413) 也可使用五聚體(例如 US 2004-209295A)、Dextramers (例如 WO 02/072631)、和 Str印tamers (例如 Nature medicine 6.631-637(2002))。
例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于診斷或評(píng)價(jià)被施用了至少一種本發(fā)明的TMEM22肽的受試者的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括下述步驟(a)在適合誘導(dǎo)對(duì)免疫原特異性的CTL的條件下使免疫原與具有免疫能力的細(xì)胞接觸；(b)檢測(cè)或測(cè)定步驟(a)中誘導(dǎo)的CTL的誘導(dǎo)水平；和(c)將所述受試者的免疫應(yīng)答與所述CTL誘導(dǎo)水平相關(guān)聯(lián)。在本發(fā)明中，免疫原是下述中至少一種(a)選自SEQ ID NO: 1_16、18-32和34-90中的氨基酸序列的TMEM22肽，具有所述氨基酸序列的肽，和具有所述氨基酸序列中已經(jīng)過I個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換而修飾的氨基酸序列的肽。同時(shí)，適合誘導(dǎo)免疫原特異性CTL的條件是本領(lǐng)域公知的。例如，可以在體外在免疫原存在下培養(yǎng)具有免疫能力的細(xì)胞來誘導(dǎo)免疫原特異性CTL。為了誘導(dǎo)免疫原特異性CTL，可以將任何刺激因子添加至細(xì)胞培養(yǎng)物。例如，IL-2是用于CTL誘導(dǎo)的優(yōu)選的刺激因子。在一些實(shí)施方案中，對(duì)要用肽癌癥療法治療的受試者的免疫應(yīng)答的監(jiān)測(cè)或評(píng)價(jià)可以在治療之前、之中和/或之后進(jìn)行。一般而言，在癌癥治療規(guī)程中，反復(fù)地對(duì)要治療的受試者施用免疫原性肽。例如，可以每周施用免疫原性肽3-10周。相應(yīng)地，可以在整個(gè)癌癥治療程序中評(píng)價(jià)或監(jiān)測(cè)受試者的免疫應(yīng)答?；蛘?，評(píng)價(jià)或監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答的步驟可以在治療程序完成時(shí)進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，免疫原特異性CTL的誘導(dǎo)相對(duì)于對(duì)照增強(qiáng)，表明要評(píng)價(jià)或診斷的受試者對(duì)已施用的免疫原免疫應(yīng)答。用于評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答的合適的對(duì)照可包括，例如，具有免疫能力的細(xì)胞未接觸肽時(shí)的CTL誘導(dǎo)水平，或者與具有TMEM22肽之外的氨基酸序列(例如隨機(jī)氨基酸序列)的對(duì)照肽接觸時(shí)的CTL誘導(dǎo)水平。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以序列特異性的方式評(píng)價(jià)受試者的免疫應(yīng)答，方法是在施用給受試者的各種免疫原之間比較免疫應(yīng)答。具體地，即使當(dāng)數(shù)種TMEM22肽的混合物被施用給受試者時(shí)，免疫應(yīng)答也會(huì)依賴于肽而改變。在這種情況下，通過比較每種肽的免疫應(yīng)答，可以鑒定出受試者對(duì)其顯示更高應(yīng)答的肽。XI.抗體
本發(fā)明進(jìn)一步提供了與本發(fā)明的肽結(jié)合的抗體。優(yōu)選的抗體特異性結(jié)合本發(fā)明的肽且不會(huì)結(jié)合(或會(huì)微弱結(jié)合)非本發(fā)明的肽?；蛘?，抗體能結(jié)合本發(fā)明的肽及其同源物。針對(duì)本發(fā)明肽的抗體可用于癌癥診斷和預(yù)后測(cè)定法、及成像方法學(xué)。類似地，此類抗體可用于其它癌癥的治療、針對(duì)、和/或預(yù)后，只要癌癥患者中也表達(dá)或過表達(dá)TMEM22。此外，胞內(nèi)表達(dá)的抗體(例如單鏈抗體)在治療上可用于治療涉及TMEM22表達(dá)的癌癥，這樣的癌癥的例子包括但不限于AML、膀胱癌、CCC、食道癌、淋巴瘤、前列腺癌、RCC和SCLC。本發(fā)明還提供了多種免疫學(xué)測(cè)定法，用于檢測(cè)和/或定量TMEM22蛋白(SEQ IDNO:92)或其片段，包括具有選自SEQ ID NO: 1_16，18-32和34-90的氨基酸序列的多肽。此類測(cè)定法可根據(jù)需要包括一種或多種能夠識(shí)別和結(jié)合TMEM22蛋白或其片段的抗TMEM22抗體。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，能與TMEM22多肽結(jié)合的抗TMEM22抗體優(yōu)選識(shí)別具有選自SEQ IDNO: 1-16，18-32和34-90的氨基酸序列的多肽?？贵w的結(jié)合特異性可用抑制測(cè)試來確認(rèn)。SP，當(dāng)要分析的抗體與全長(zhǎng)TMEM22多肽之間的結(jié)合在任何具有選自SEQ ID NO: 1-16，18-32和34-90的氨基酸序列的片段多肽存在下受到抑制時(shí)，證明此抗體特異性結(jié)合該片段。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，此類免疫學(xué)測(cè)定法以本領(lǐng)域公知的各種免疫學(xué)測(cè)定形式實(shí)施，包括但不 限于各種類型的放射免疫測(cè)定法、免疫層析技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、酶聯(lián)免疫熒光測(cè)定法(ELIFA)、等等。本發(fā)明的相關(guān)免疫學(xué)的但非抗體的測(cè)定法也包括T細(xì)胞免疫原性測(cè)定法(抑制性的或刺激性的)以及主要組織相容性復(fù)合物(MHC)結(jié)合測(cè)定法。另外，本發(fā)明還提供能夠檢測(cè)表達(dá)TMEM22的癌癥的免疫學(xué)成像方法，包括但不限于使用經(jīng)標(biāo)記的本發(fā)明抗體的放射閃爍成像方法。此類測(cè)定法在臨床上可用于表達(dá)TMEM22的癌癥的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)、和預(yù)后，此類癌癥的例子包括但不限于AML、膀胱癌、CCC、食道癌、淋巴瘤、前列腺癌、RCC和SCLC。本發(fā)明還提供了與本發(fā)明的肽結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體可以以任何形式使用，例如單克隆或多克隆抗體，而且包括通過用本發(fā)明的肽免疫動(dòng)物(諸如家兔)而獲得的抗血清、所有種類的多克隆和單克隆抗體、及通過遺傳重組生成的人抗體和人源化抗體。本發(fā)明的作為抗原用于獲得抗體的肽可來源于任何動(dòng)物物種，但優(yōu)選來源于哺乳動(dòng)物，諸如人、小鼠或大鼠，更優(yōu)選來源于人。來源于人的肽可以由本文所公開的核苷酸或氨基酸序列獲得。根據(jù)本發(fā)明，用作免疫抗原的肽可以是完整的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分肽。部分肽可以包含例如本發(fā)明肽的氨基(N)末端或羧基(C)末端片段。在本文中，抗體定義為能與TMEM22肽的全長(zhǎng)或片段起反應(yīng)的蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體識(shí)別具有選自SEQ ID NO: 1-16，18-32和34-90的氨基酸序列的TMEM22的片段肽。用于合成寡肽的方法是本領(lǐng)域公知的。合成后，可任選在作為免疫原使用之前純化肽。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，寡肽(例如9或10聚物)可與擔(dān)載體綴合或連接以增強(qiáng)免疫原性。匙孔威血藍(lán)蛋白(KLH)作為載體是公知的。用于綴合KLH和肽的方法也是本領(lǐng)域公知的。或者，可以將編碼本發(fā)明肽或其片段的基因插入已知的表達(dá)載體，然后用該載體轉(zhuǎn)化本文所述宿主細(xì)胞?？梢酝ㄟ^任何標(biāo)準(zhǔn)方法從宿主細(xì)胞外部或內(nèi)部回收所需肽或其片段，然后可將其用作抗原?；蛘撸磉_(dá)肽的完整細(xì)胞或其溶胞物或者化學(xué)合成的肽也可用作抗原。
可以用抗原免疫任何哺乳動(dòng)物，但優(yōu)選考慮與用于細(xì)胞融合的親本細(xì)胞的相容性。通常，可使用卩齒齒目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或靈長(zhǎng)目(Primate)的動(dòng)物。嚙齒科動(dòng)物包括例如小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠。兔形科動(dòng)物包括例如家兔。靈長(zhǎng)科動(dòng)物包括例如狹鼻猿(Catarrhini)(東半球猴(old world monkey))諸如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(rhesus monkey)、狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。用抗原免疫動(dòng)物的方法是本領(lǐng)域已知的。腹膜內(nèi)注射或皮下注射抗原是免疫哺乳動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)方法。更具體的說，可以在適量的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、生理鹽水等中稀釋和懸浮抗原。如果需要，可將抗原懸浮液與適量的標(biāo)準(zhǔn)佐劑諸如弗氏(Freund)完全佐劑混合，制成乳狀液，然后施用于哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的是，其后每4-21天施用數(shù)次與適量弗氏不完全佐劑混合的抗原。還可使用適宜的擔(dān)載體進(jìn)行免疫。如上所述進(jìn)行免疫后，可通過標(biāo)準(zhǔn)方法檢驗(yàn)血清中所需抗體的量的增加。可以如下制備針對(duì)本發(fā)明肽的多克隆抗體從經(jīng)過免疫的哺乳動(dòng)物(該哺乳動(dòng)物經(jīng)檢驗(yàn)其血清中所需抗體增加)收集血液,并通過任何常規(guī)方法從血液中分離血清。多克隆抗體可包括含有多克隆抗體的血清,并且可以從所述血清中分離的、含有該多克隆抗體的級(jí)分。可以使用例如偶聯(lián)有本發(fā)明肽的親和柱從僅識(shí)別本發(fā)明肽的級(jí)分中制備免疫球蛋白G或M，并進(jìn)一步使用蛋白A或蛋白G柱純化該級(jí)分。為了制備單克隆抗體，從經(jīng)過抗原免疫并如上所述檢查出血清中所需抗體水平升高的哺乳動(dòng)物收集免疫細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞融合。用于細(xì)胞融合的免疫細(xì)胞可優(yōu)選獲自脾。其它要與上述免疫細(xì)胞融合的優(yōu)選親本細(xì)胞包括例如哺乳動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞，更優(yōu)選具有為了用藥物選擇融合細(xì)胞而獲得的特性的骨髓瘤細(xì)胞?？筛鶕?jù)已知的方法，例如Milstein 等(Galfre 和 Milstein, Methods Enzymol73:3-46 (1981))的方法，將上述免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。對(duì)于由細(xì)胞融合得到的雜交瘤，可在標(biāo)準(zhǔn)選擇培養(yǎng)基諸如HAT培養(yǎng)基(含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)以進(jìn)行選擇。通常，細(xì)胞培養(yǎng)在HAT培養(yǎng)基中連續(xù)進(jìn)行數(shù)天至數(shù)周，培養(yǎng)的時(shí)間足以使除了所需雜交瘤之外的所有其它細(xì)胞(非融合的細(xì)胞)死亡。然后，可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)有限稀釋(standard limiting dilution)來篩選和克隆生成所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。
除了上述用抗原免疫非人動(dòng)物來制備雜交瘤的方法外，還可以在體外用肽、表達(dá)肽的細(xì)胞或其溶胞物免疫人淋巴細(xì)胞，諸如那些感染了 EB病毒的人淋巴細(xì)胞。然后，使經(jīng)過免疫的淋巴細(xì)胞與能夠無限分裂的源自人的骨髓瘤細(xì)胞諸如U266融合，以產(chǎn)生期望的生成能夠與所述肽結(jié)合的人抗體的雜交瘤(已公開但未審查的日本專利申請(qǐng)No. Sho63-17688)。隨后將所得雜交瘤移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。所得的單克隆抗體可通過例如硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或偶聯(lián)有本發(fā)明肽的親和柱進(jìn)行純化。本發(fā)明的抗體不僅可用于純化和檢測(cè)本發(fā)明的肽，還可以用作本發(fā)明肽的激動(dòng)劑和拮抗劑的候選物?；蛘撸梢酝ㄟ^癌基因使生成抗體的免疫細(xì)胞(諸如經(jīng)過免疫的淋巴細(xì)胞)永生化，并用于制備單克隆抗體。如此獲得的單克隆抗體也可以使用遺傳工程技術(shù)來重組制備(參見例如 Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies,由 MacMillanPublishers LTD在英國(guó)出版(1990))。例如，可以從生成抗體的免疫細(xì)胞諸如雜交瘤或經(jīng)免疫淋巴細(xì)胞克隆編碼抗體的DNA，將該DNA插入合適的載體，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞以制備重組抗體。本發(fā)明還提供如上所述制備的重組抗體。此外，本發(fā)明的抗體可以是抗體片段或經(jīng)過修飾的抗體，只要它結(jié)合一種或多種本發(fā)明的肽。例 如，抗體片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或?qū)碜訦鏈和L鏈的Fv片段通過合適的接頭連接而成的單鏈Fv(scFv) (Huston et al. , Proc Natl Acad SciUSA 85:5879-83(1988))。更具體的說，可以通過用酶諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體來生成抗體片段。或者，可以構(gòu)建編碼抗體片段的基因，將其插入表達(dá)載體，并在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)(參見例如Co et al. , J Immunol 152:2968-76 (1994) ;Betterand Horwitz, Methods Enzymol 178:476-96(1989);Pluckthun and Skerra, MethodsEnzymol 178:497-515(1989);Lamoyi, Methods Enzymol 121:652-63(1986);Rousseauxet al.,MethodsEnzymol 121:663-9(1986) ;Bird and Walker, Trends Biotechnol9:132-7(1991))。抗體可以通過與多種分子諸如聚乙二醇(PEG)綴合來修飾。本發(fā)明提供了經(jīng)過這樣修飾的抗體。可通過化學(xué)修飾抗體來獲得經(jīng)過修飾的抗體。這些修飾方法是本領(lǐng)域常規(guī)的?；蛘撸梢砸栽醋苑侨丝贵w的可變區(qū)與源自人抗體的恒定區(qū)之間的嵌合抗體或者包含源自非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、源自人抗體的框架區(qū)(FR)及恒定區(qū)的人源化抗體的形式來獲得本發(fā)明的抗體。此類抗體可依照已知技術(shù)來制備。人源化可通過用嚙齒類的⑶R或⑶R序列替換人抗體的相應(yīng)序列來進(jìn)行(參見例如Verhoeyen et al. , Science239:1534-1536(1988))。因而，此類人源化抗體是嵌合抗體，其中人可變域的一小部分已被來自非人物種的相應(yīng)序列所替換。也可以使用完全的人抗體，這樣的抗體除了人框架區(qū)和恒定區(qū)外還包含人可變區(qū)。此類抗體可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來制備。例如，體外方法包括使用展示在噬菌體上的人抗體片段的重組文庫(kù)(例如Hoogenboom&ffinter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991))。類似的，可通過將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如內(nèi)源免疫球蛋白基因部分或完全滅活的小鼠，來生成人抗體。該方法記載于例如美國(guó)專利Nos. 6，150，584 ;5，545，807 ；5，545，806 ;5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;5，661，016。可以將如上獲得的抗體純化至同質(zhì)。例如，可依照用于一般蛋白質(zhì)的分離和純化方法進(jìn)行抗體的分離和純化。例如，可以通過適當(dāng)選擇和組合使用柱層析諸如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦來分出和分離抗體(Antibodies:A Laboratory Manual. Ed Harlow 和 David Lane, Cold Spring HarborLaboratory (1988)),但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作親和柱。例示性的可使用的蛋白 A 柱包括例如 Hyper D、POROS 和 Sepharose F. F. (Pharmacia)。除親和層析外的例示性層析包括例如離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析、等等(Strategies for Protein Purification 和 Characterization:ALaboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. , Cold Spring HarborLaboratory Press (1996))?？梢酝ㄟ^液相層析來進(jìn)行層析規(guī)程,諸如HPLC和FPLC。
例如，可使用吸光度測(cè)量、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、酶免疫測(cè)定法(EIA)、放射免疫測(cè)定法(RIA)和/或免疫熒光來測(cè)量本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合活性。在ELISA中，將本發(fā)明的抗體固定化在板上，將本發(fā)明的肽施加到該板上，再施加含有所需抗體的樣品，諸如生成抗體的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液或純化的抗體。然后施加用酶(諸如堿性磷酸酶)標(biāo)記的、識(shí)別第一抗體的第二抗體，并將板溫育。接著，在洗滌后，向板中加入酶底物，諸如磷酸對(duì)硝基苯酯，并測(cè)量吸光度以評(píng)估樣品的抗原結(jié)合活性?？梢允褂秒牡钠?，諸如C-末端或N-末端片段作為抗原來評(píng)估抗體的結(jié)合活性?？梢允褂肂IAcore (Pharmacia)來評(píng)估本發(fā)明抗體的活性。上述方法允許通過將本發(fā)明的抗體暴露于假定含有本發(fā)明肽的樣品，并檢測(cè)或測(cè)量由抗體與肽形成的免疫復(fù)合物，來檢測(cè)或測(cè)量本發(fā)明的肽。因?yàn)橐勒毡景l(fā)明的肽檢測(cè)或測(cè)量方法可特異性的檢測(cè)或測(cè)量肽，所以該方法可用于使用肽的各種實(shí)驗(yàn)。XII.載體和宿豐細(xì)朐 本發(fā)明還提供了導(dǎo)入有編碼本發(fā)明肽的核苷酸的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明的載體可用于在宿主細(xì)胞中維持本發(fā)明的核苷酸、尤其是DNA，用于表達(dá)本發(fā)明的肽，或者用于施用本發(fā)明的核苷酸以用于基因療法。當(dāng)宿主細(xì)胞為大腸桿菌且在大腸桿菌(例如JM109、DH5 a、HBlOl或XLlBlue)中大量擴(kuò)增和生成載體時(shí)，載體應(yīng)具有能在大腸桿菌中擴(kuò)增的“(復(fù)制)起點(diǎn)”和用于選擇經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的標(biāo)志基因(例如通過藥物諸如氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素等進(jìn)行選擇的藥物抗性基因)。例如，可以使用M13系列載體、pUC系列載體、pBR322、pBluescript、pCR_Script等。另外，與上述載體一樣，pGEM_T、pDIRECT和pT7也可以用于亞克隆和提取cDNA。當(dāng)使用載體來生成本發(fā)明的蛋白質(zhì)時(shí)，表達(dá)載體是有用的。例如，要在大腸桿菌中表達(dá)的表達(dá)載體應(yīng)具備上述在大腸桿菌中擴(kuò)增的特征。當(dāng)使用大腸桿菌諸如JM109、DH5a、HBlOl或XLlBlue作為宿主細(xì)胞時(shí)，載體應(yīng)具有能在大腸桿菌中高效表達(dá)所需基因的啟動(dòng)子，例如IacZ啟動(dòng)子(Ward et al. , Nature 341:544-6(1989);FASEB J 6:2422-7 (1992))、araB 啟動(dòng)子(Better et al. , Science240:1041-3(1988))、17 啟動(dòng)子等。在這方面，可以使用例如 pGEX_5X_I (Pharmacia)、“QIAexpress系統(tǒng)” (Qiagen)、pEGFP和pET(在這種情況中，宿主優(yōu)選為表達(dá)T7RNA聚合酶的BL21)來替代上述載體。另外，載體還可以包含用于多肽分泌的信號(hào)序列。指導(dǎo)肽分泌至大腸桿菌周質(zhì)的例示性信號(hào)序列有pelB信號(hào)序列(Lei et al.，J Bacteriol169:4379(1987))。用于將載體導(dǎo)入靶宿主細(xì)胞的手段包括例如氯化鈣法和電穿孔法。除了大腸桿菌夕卜，還可以使用例如源自哺乳動(dòng)物的表達(dá)載體(例如pcDNA3 (Invitrogen)和 pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18 (17):5322 (1990))、pEF、PCDM8)、源自昆蟲細(xì)胞的表達(dá)載體(例如“Bac-to-BAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)”(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、源自植物的表達(dá)載體(例如pMHl、pMH2)、源自動(dòng)物病毒的表達(dá)載體(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、源自逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)載體(例如pZIpneo)、源自酵母的表達(dá)載體(例如“畢赤酵母表達(dá)試劑盒”(Invitrogen)、pNVll、SP-QOI)及源自枯草芽孢桿菌的表達(dá)載體(例如PPL608、pKTH50)來生成本發(fā)明的多肽。為了在動(dòng)物細(xì)胞諸如CHO、COS或NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)載體，載體應(yīng)具有在所述細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)所必需的啟動(dòng)子，例如SV40啟動(dòng)子(Mulligan et al. , Nature277:108(1979))、麗1^-1^1 啟動(dòng)子4卩10 啟動(dòng)子(Mizushima et al. , Nucleic Acids Res18:5322 (1990))、CMV啟動(dòng)子、等等，及優(yōu)選用于選擇轉(zhuǎn)化子的標(biāo)志基因(例如通過藥物(例如新霉素、G418)進(jìn)行選擇的藥物抗性基因)。具有這些特征的已知載體的例子包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV 和 pOP13。提供下面的實(shí)施例來例示本發(fā)明及幫助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來制備和使用本發(fā)明。實(shí)施例并非意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例材料和方法
細(xì)朐系HLA_A*2402陽(yáng)性B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系TISI購(gòu)自IHWG Cell and GeneBank (Seattle WA)，HLA_A*0201陽(yáng)性B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系T2 (HLA-A2)和非洲綠猴腎細(xì)胞系C0S7購(gòu)自ATCC。源自TMEM22的狀的候詵者詵擇使用結(jié)合預(yù)測(cè)軟件〃BIMAS〃 (www-bimas. cit. nih. gov/molbio/hla bind)(Parker et al. (J Immunol 1994，152 (I): 163-75)，Kuzushima et al. (Blood2001,98 (6):1872-81))和“NetMHC 3. 0”(www. cbs. dtu. dk/services/NetMHC/)(Buus etal. (Tissue Antigens.，62:378-84，2003)，Nielsen et al. (Protein Sci.，12:1007-17，2003，Bioinformatics, 20(9) : 1388-97，2004))預(yù)測(cè)了源自 TMEM22 的結(jié)合HLA_A*2402 分子的9聚體和10聚體肽。此夕卜，使用“NetMHC 3. 0”預(yù)測(cè)了源自TMEM22的結(jié)合HLA_A*0201分子的9聚體和10聚體肽。這些肽由Biosynthesis (Lewisville, Texas)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)固相合成法合成，并通過反相高效液相色譜(HPLC)純化。分別通過分析型HPLC和質(zhì)譜分析來確定肽的純度(>90%)和身份。將肽以20mg/ml溶解在二甲基亞砜(DMSO)中并保存于_80°C。體外CTL誘導(dǎo)使用單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞(DC)作為抗原呈遞細(xì)胞(APC)來誘導(dǎo)針對(duì)呈現(xiàn)在人白細(xì)胞抗原(HLA)上的肽的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。如他處所述(NakaharaS et al. , Cancer Res 2003Jul 15，63 (14) :4112-8)體外制備 DC。具體地說，對(duì)于用Ficoll-Plaque (Pharmacia)溶液從正常志愿者(HLA_A*2402 陽(yáng)性或 HLA_A*0201 陽(yáng)性)分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),通過粘附塑料組織培養(yǎng)盤(Becton Dickinson)加以分離，以將它們作為單核細(xì)胞級(jí)分加以富集。將富集了單核細(xì)胞的群體在含2%熱滅活的自體血清(AS)的AM-V培養(yǎng)基(Invitrogen)中，在1000U/ml的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(R&D System)和1000U/ml白介素(IL)_4(R&D System)的存在下培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，將經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的DC在AIM-V培養(yǎng)基中在3微克/ml ^ 2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一種合成肽于37° C沖激3小時(shí)。所生成的細(xì)胞表觀上在它們的細(xì)胞表面上表達(dá)DC相關(guān)分子，諸如⑶80、⑶83、⑶86和HLA II類(數(shù)據(jù)未顯示)。然后將這些經(jīng)肽沖激的DC用X輻照(20Gy)滅活，并以1:20比例與用⑶8陽(yáng)性分離試劑盒(Dynal)通過正選擇獲得的自體⑶8+T細(xì)胞混合。在48孔板(Corning)中設(shè)立這些培養(yǎng)物；每個(gè)孔在0. 5ml AIM-V/2%AS培養(yǎng)基中含有I. 5 x IO4個(gè)經(jīng)肽沖激的DC、3x IO5個(gè)CD8+T細(xì)胞和10ng/ml IL-7 (R&D System)。3天后，給這些培養(yǎng)物補(bǔ)充IL-2 (CHIRON)至終濃度20IU/ml。在第7天和第14天，將T細(xì)胞用經(jīng)肽沖激的自體DC進(jìn)一步刺激。每次通過與上文所述相同的方式來制備DC。在第21天在第三輪肽刺激后測(cè)試針對(duì)經(jīng)肽沖激的 TISI 細(xì)胞(T24)或 T2 細(xì)胞(A2)的 CTL(Tanaka H et al. , Br J Cancer2001Jan 5, 84(1):94-9;Umano Y et al. , Br J Cancer 200IApr 20,84(8):1052-7;UchidaN et al. , Clin Cancer Res 2004Dec 15，10(24):8577-86;Suda T et al. , Cancer Sci2006May, 97(5):411-9;Watanabe T et al. , Cancer Sci2005Aug, 96(8):498-506)。CTL擴(kuò)增規(guī)稈使用與Riddell 等人(Walter EA et al. , N Engl J Med 1995 Oct19, 333(16) :1038-44; Riddell SR et al.，Nat Med 1996Feb, 2 (2) : 216-23)記載的方法相似的方法在培養(yǎng)中擴(kuò)增CTL。將總共5x IO4個(gè)CTL在25ml AM_V/5%AS培養(yǎng)基中懸 浮，其中有在40ng/ml抗⑶3單克隆抗體(Pharmingen)存在下經(jīng)絲裂霉素C滅活的兩種人B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系。啟動(dòng)培養(yǎng)后一天，向培養(yǎng)物添加120IU/ml IL-2。在第5天、第8天和第11天給培養(yǎng)物補(bǔ)加新鮮的含有30IU/ml IL-2的AIM_V/5%AS培養(yǎng)基(TanakaH et al. , Br J Cancer 2001Jan 5，84 (I):94-9;Umano Y et al. , Br J Cancer 200IApr20,84(8):1052-7;Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004Dec 15,10(24):8577-86;SudaT et al. , Cancer Sci 2006May, 97 (5) :411-9;Watanabe T et al. , Cancer Sci2005Aug, 96(8) :498-506)。CTL克降的津立在96圓底微量滴定板(Nalge Nunc International)中進(jìn)行稀釋以獲得0.3、I和3個(gè)CTL/孔。在總共150微升/孔的含5%AS的AIM-V培養(yǎng)基中，將CTL與IxlO4個(gè)細(xì)胞/孔的兩種人B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系、30ng/ml的抗CD3抗體，和125U/ml的IL-2 —起培養(yǎng)。10天后向培養(yǎng)基中加入50微升/孔的IL-2以達(dá)到終濃度125U/ml的IL-2。在第14天測(cè)試CTL活性，并使用如上所述的相同方法擴(kuò)增CTL克隆(Uchida Net al. , Clin Cancer Res 2004Dec 15，10(24):8577-86;Suda T et al. , Cancer Sci2006May, 97(5):411-9;Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005Aug,96 (8):498-506)。特異件CTL活件為了檢查特異性CTL活性，實(shí)施了干擾素(IFN)-Y酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISP0T)測(cè)定法和IFN-Y酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)。具體而言，制備經(jīng)肽沖激的TISI (A24)或T2(A2) (lx IO4/孔)作為刺激細(xì)胞。使用48孔中培養(yǎng)的細(xì)胞作為應(yīng)答細(xì)胞。依照制造商的規(guī)程實(shí)施IFN- y ELISP0T測(cè)定法和IFN- y ELISA測(cè)定法。強(qiáng)迫表汰靶基因和/或HLA-A24/HLA-A02的細(xì)胞的津立通過PCR來擴(kuò)增編碼靶基因可讀框、HLA-A*2402或HLA_A*0201的cDNA。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入表達(dá)載體。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)依照制造商推薦的規(guī)程將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入C0S7 (靶基因和HLA-A24/A2陰性的細(xì)胞系)。自轉(zhuǎn)染起2天后，用Versene(Invitrogen)收獲經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并用作CTL活性測(cè)定法的靶細(xì)胞(5X IO4個(gè)細(xì)胞/孔)。結(jié)果I
癌癥中TMEM22表汰提iWt利用cDNA微陣列從不同癌癥中獲得了全局基因表達(dá)譜，顯示TMEM22(GenBankAccession No. NM_025246, NM_001097599, NM_001097600;例如 SEQ ID No:91)表達(dá)升高。TMEM22表達(dá)在6例AML中的I例、29例膀胱癌中的I例，I例CCC中的I例，41例食道癌中的6例，I例淋巴癌中的I例,6例前列腺癌中的4例，13例RCC中的9例，和21例SCLC中的13例中有效升高(表I)。表I :觀察到癌性組織中相比正常對(duì)應(yīng)組織TMEM22上調(diào)的病例的比例
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合HLA抗原并具有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)誘導(dǎo)能力的分離的肽，其中所述肽由SEQ ID NO:92或其免疫學(xué)活性片段組成。
2.權(quán)利要求I的分離的肽，其中所述HLA抗原是HLA-A24或HLA-A2。
3.權(quán)利要求I或2的分離的肽，其中所述肽包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO: 1-16、18-32、和 34-90。
4.權(quán)利要求1-3的分離的肽，其中所述肽由選自SEQID NO: 1-16、18-32和34-90的氨基酸序列組成，其中插入、替換、缺失或添加了 I個(gè)、2個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸。
5.權(quán)利要求4的分離的肽，其中，在HLA-A24的背景中，所述肽具有下述特征之一或者二者 (a)自N端起的第二個(gè)氨基酸選自苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；和 (b)C端氨基酸選自苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
6.權(quán)利要求4的分離的肽，其中，在HLA-A2的背景中，具有下述特征之一或二者 (a)自N端起的第二個(gè)氨基酸選自亮氨酸和甲硫氨酸；和 (b)C端氨基酸選自纈氨酸和亮氨酸。
7.權(quán)利要求1-6的分離的肽，其中所述肽是九肽或十肽。
8.—種分離的多核苷酸,其編碼權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的肽。
9.一種用于誘導(dǎo)CTL的作用劑，其中所述作用劑包含一種或多種權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的肽，或者一種或多種權(quán)利要求8的多核苷酸。
10.一種用于治療和/或預(yù)防癌癥和/或防止其手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥劑，其中所述藥劑包含一種或多種權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的肽，或者一種或多種權(quán)利要求8的多核苷酸。
11.權(quán)利要求10的藥劑，其中所述藥劑配制為對(duì)HLA抗原為HLA-A24或HLA-A2的受試者施用。
12.一種用于誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞(APC)的方法，其中所述方法包括下述步驟之一 (a)在體外、離體或在體內(nèi)使APC與權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的肽接觸；和 (b)將編碼權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的肽的多核苷酸導(dǎo)入APC。
13.通過任何包含至少一個(gè)下述的步驟的方法來誘導(dǎo)CTL的方法 (a)將CD8-陽(yáng)性T細(xì)胞與APC共培養(yǎng)，所述APC在其表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的肽的復(fù)合物； (b)將CD8-陽(yáng)性T細(xì)胞與外來體共培養(yǎng)，所述外來體在其表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的肽的復(fù)合物；和 (c)向T細(xì)胞中導(dǎo)入包含編碼結(jié)合權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的肽的T細(xì)胞受體(TCR)亞單位多肽的多核苷酸的基因。
14.一種分離的抗原呈遞細(xì)胞，該細(xì)胞在其表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的寡肽的復(fù)合物。
15.權(quán)利要求14的APC，其是通過權(quán)利要求12的方法誘導(dǎo)的。
16.一種分離的CTL，其靶向權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的肽。
17.權(quán)利要求16的CTL，其是通過權(quán)利要求13的方法誘導(dǎo)的。
18.一種誘導(dǎo)受試者中針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)受試者施用包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的肽、其免疫學(xué)活性片段、或編碼所述肽或所述片段的多核苷酸的作用劑。
19.一種載體,其包含編碼如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的肽的核苷酸序列。
20.一種宿主細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有權(quán)利要求19的表達(dá)載體。
21.權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)的分離的肽，其由選自下組的氨基酸序列組成SEQID NO:I, 2，3，4，5，6，10，12，16，18，19，22，28，31，35，38，41，48，61，62，65，67，70，74，77 和 83。
全文摘要
本申請(qǐng)中描述了包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的分離的肽或其片段，它們結(jié)合HLA抗原并具有細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)誘導(dǎo)能力，因此可用于癌癥免疫治療，更具體地說是癌癥疫苗的語(yǔ)境。本發(fā)明還提供包含對(duì)上述肽或片段的一個(gè)、兩個(gè)或者數(shù)個(gè)氨基酸插入、替代或添加，但仍保留所需的細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽。進(jìn)一步提供了編碼上述任何肽的核酸，以及包含任何上述肽或核酸的藥劑、物質(zhì)或者組合物。本發(fā)明的肽、核酸、藥劑、物質(zhì)和組合物在癌癥和腫瘤的治療中特別有用。
文檔編號(hào)C12N5/0781GK102770441SQ201080063829
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月14日
發(fā)明者中村佑輔, 吉村祥子, 大澤龍司, 渡邊朝久, 角田卓也 申請(qǐng)人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司