專利名稱:碼絹金龜精巢染色體制作觀察方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,提供了一種碼絹金龜精巢染色體制作觀察方法。
背景技術(shù):
碼絹金龜Maladera sp.隸屬鞘翅目、絨金龜科、絹絨金龜屬,是取食為害煙草等作物的主要金龜子類害蟲,由于該蟲與其它絹絨金龜屬金龜子形態(tài)特征極相似,目前單純依靠形態(tài)鑒定法尚不能準(zhǔn)確鑒定,因此對碼絹金龜?shù)姆诸惾詢H停留在屬上,尚未定種。然而,形態(tài)鑒定法對于形態(tài)極為相似的同屬金龜子則無法準(zhǔn)確鑒定,在對于不具備分子生物學(xué)實驗條件者來說,分子生物學(xué)鑒定法也受到一定的制約,而對于利用核型分析法則尚無成功的染色體制作觀察方法,利用目前現(xiàn)有染色體的制作方法后無法清晰觀察到該蟲的染色體形態(tài)及記數(shù)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供了一種準(zhǔn)確、方便的碼絹金龜染色體的制作觀察方法。
本發(fā)明的步驟是1、取材和預(yù)處理將碼絹金龜成蟲固定在解剖蠟盤上,取出精巢,放入0.04~0.06%秋水仙素溶液中處理6~14h,秋水仙素0.1~0.3%的原液保存于冰箱中。
2、溶液配制Giemsa試劑1g,甘油50ml,甲醇50ml,先將Giemsa試劑1g放入研缽中,再加入5ml甘油研磨而使其溶化為勻漿狀,再加入甘油,混合后裝入瓶中搖勻后加入甲醇;3、玻片標(biāo)本的制備將精巢從秋水仙素浸液中取出,用蒸餾水沖洗,再在解剖鏡下分開每條精巢小管,剔除精巢小管周圍的蛋白質(zhì)等雜質(zhì),先在0.4%KCl溶液和蒸餾水兩種溶液中低滲處理30min,移入固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)內(nèi)經(jīng)30~60min后,移入70%酒精內(nèi),置于冰箱中,從固定液中取出精巢小管,在載片上放一條精巢小管,用吸水紙吸干,然后用蒸餾水洗3遍,吸干,滴上0.05%秋水仙液一滴,蓋上蓋玻片,輕輕敲擊使精巢小管破裂里面的減數(shù)分裂細胞流出來和染色液接觸,將載玻片直接放在平展的桌面上,取兩層干凈吸水紙蓋在上面,在蓋玻片位置上垂直施壓;4、染色用磷酸緩沖液(PH6.8)將Giemsa(PH6.7~7.0)原液稀釋10倍,染色10~20min;5、鏡檢將制得的玻片標(biāo)本在顯微鏡下觀察、計數(shù),碼絹金龜精巢染色體呈短桿狀;其中將碼絹金龜成蟲精巢放入0.04~0.06%秋水仙素溶液中處理10~14小時,在固定液中固定時間為46~60min,染色時間為15~20min。
按照此發(fā)明方法以碼絹金龜成蟲精巢為材料,經(jīng)過秋水仙素預(yù)處理,經(jīng)KCl溶液低滲處理、固定,用Giemsa染色后,制作觀察碼絹金龜染色體,細胞分裂中期相多,且清晰,因此染色體清晰可見,能準(zhǔn)確、直觀記數(shù)染色體的數(shù)量,可用于碼絹金龜染色體核型分析及種類鑒定。
具體實施例方式
實施例一取碼絹金龜成蟲精巢放入0.05%秋水仙素溶液中處理6小時。
秋水仙素溶液濃度為0.1%;Giemsa溶液的配制由Giemsa試劑1g,甘油50ml,甲醇50ml,先將Giemsa試劑1g放入研缽中,再加入5ml甘油研磨而使其溶化為勻漿狀,再加入甘油,混合后裝入瓶中搖勻后加入甲醇。
玻片標(biāo)本的制備將精巢從秋水仙素浸液中取出,沖洗后在解剖鏡下分成精巢小管,先在0.4%KCl溶液和蒸餾水兩種溶液中低滲處理30min,移入固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)內(nèi)經(jīng)30min后,取出精巢小管,在載玻片上放一條精巢小管,滴上0.05%秋水仙液一滴,蓋上干凈的蓋玻片,敲擊使精小管破裂里面的減數(shù)分裂細胞流出來和染色液接觸。
染色用磷酸緩沖液(PH6.8)將Giemsa(PH6.7~7.0)原液稀釋10倍,染色10min,在蓋玻片位置上垂直施壓。
鏡檢玻片標(biāo)本在顯微鏡下觀察、計數(shù)。
結(jié)果碼絹金龜精巢細胞染色體分裂中期細胞,n=9者占85%,染色體均呈短桿狀。
實施例二取碼絹金龜成蟲精巢,放入0.05%秋水仙素溶液中處理14小時。
秋水仙素溶液濃度為0.3%,Giemsa溶液的配制由Giemsa試劑1g,甘油50ml,甲醇50ml,先將Giemsa試劑1g放入研缽中,再加入5ml甘油研磨而使其溶化為勻漿狀,再加入甘油,混合后裝入瓶中搖勻后加入甲醇。
玻片標(biāo)本的制備將精巢從秋水仙素浸液中取出,沖洗后在解剖鏡下分成精巢小管,先在0.4%KCl溶液和蒸餾水兩種溶液中低滲處理30min,移入固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)內(nèi)經(jīng)60min后,取出精巢小管,在載玻片上放一條精巢小管,滴上0.05%秋水仙液一滴,蓋上干凈的蓋玻片,敲擊使精小管破裂里面的減數(shù)分裂細胞流出來和染色液接觸。
染色用磷酸緩沖液(PH6.8)將Giemsa(PH6.7~7.0)原液稀釋10倍,染色20min,在蓋玻片位置上垂直施壓。
鏡檢玻片標(biāo)本在顯微鏡下觀察、計數(shù)。
結(jié)果碼絹金龜精巢細胞染色體分裂中期細胞,n=9者占85%,染色體均呈短桿狀。
實施例三取碼絹金龜成蟲精巢,放入0.05%秋水仙素溶液中處理10小時。
秋水仙素溶液濃度為0.2%,Giemsa溶液的配制由Giemsa試劑1g,甘油50ml,甲醇50ml,先將Giemsa試劑1g放入研缽中,再加入5ml甘油研磨而使其溶化為勻漿狀,再加入甘油,混合后裝入瓶中搖勻后加入甲醇。
玻片標(biāo)本的制備將精巢從秋水仙素浸液中取出,沖洗后在解剖鏡下分成精巢小管,先在0.4%KCl溶液和蒸餾水兩種溶液中低滲處理30min,移入固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)內(nèi)經(jīng)45min后,取出精巢小管,在載玻片上放一條精巢小管,滴上0.05%秋水仙液一滴,蓋上干凈的蓋玻片,敲擊使精小管破裂里面的減數(shù)分裂細胞流出來和染色液接觸。
染色用磷酸緩沖液(PH6.8)將Giemsa(PH6.7~7.0)原液稀釋10倍,染色15min,在蓋玻片位置上垂直施壓。
鏡檢玻片標(biāo)本在顯微鏡下觀察、計數(shù)。
結(jié)果;碼絹金龜精巢細胞染色體分裂中期細胞,n=9者占85%,染色體均呈短桿狀。
權(quán)利要求
1.一種碼絹金龜精巢染色體制作觀察方法,其步驟是(1)取材和預(yù)處理將碼絹金龜成蟲固定在解剖蠟盤上,取出精巢,放入0.04~0.06%秋水仙素溶液中處理6~14h,秋水仙素0.1~0.3%的原液保存于冰箱中;(2)溶液配制Giemsa試劑1g,甘油50ml,甲醇50ml,先將Giemsa試劑1g放入研缽中,再加入5ml甘油研磨而使其溶化為勻漿狀,再加入甘油,混合后裝入瓶中搖勻后加入甲醇;(3)玻片標(biāo)本的制備將精巢從秋水仙素浸液中取出,用蒸餾水沖洗,再在解剖鏡下分開每條精巢小管,剔除精巢小管周圍的蛋白質(zhì)等雜質(zhì),先在0.4%KCl溶液和蒸餾水兩種溶液中低滲處理30min,移入固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)內(nèi)經(jīng)30~60min后,移入70%酒精內(nèi),置于冰箱中,從固定液中取出精巢小管,在載片上放一條精巢小管,用吸水紙吸干,然后用蒸餾水洗3遍,吸干,滴上0.05%秋水仙液一滴,蓋上蓋玻片,輕輕敲擊使精巢小管破裂里面的減數(shù)分裂細胞流出來和染色液接觸,將載玻片直接放在平展的桌面上,取兩層干凈吸水紙蓋在上面,在蓋玻片位置上垂直施壓;(4)染色用磷酸緩沖液(PH 6.8)將Giemsa(PH 6.7~7.0)原液稀釋10倍,染色10~20min;(5)鏡檢將制得的玻片標(biāo)本在顯微鏡下觀察、計數(shù),碼絹金龜精巢染色體呈短桿狀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的碼絹金龜精巢染色體制作觀察方法,其特征是步驟(1)中的碼絹金龜成蟲精巢放入0.04~0.06%秋水仙素溶液中處理10~14小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的碼絹金龜精巢染色體制作觀察方法,其特征是步驟(3)中的在固定液中固定的時間為46~60min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的碼絹金龜精巢染色體制作觀察方法,其特征是步驟(4)中的染色時間為15~20min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種碼絹金龜精巢染色體制作觀察方法,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)方案是以碼絹金龜(Maladera sp.)成蟲精巢細胞為材料,將金龜子精巢用秋水仙素預(yù)處理6~14h,經(jīng)0.4%KCl溶液低滲30min,甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定30~60min,用Giemsa染色10~20min后,獲得的精巢細胞染色體形態(tài)清晰,分散性較好,采用顯微操作技術(shù),獲得了著色清晰的生殖細胞染色體,進行染色體數(shù)目的計數(shù)統(tǒng)計,得到了碼絹金龜染色體數(shù)目n=9。本發(fā)明的效果用途是能提供碼絹金龜精巢染色體的制作觀察方法,為碼絹金龜精巢染色體形態(tài)觀察和染色體數(shù)計數(shù)提供技術(shù)支撐。
文檔編號G01N1/30GK1828296SQ20051004872
公開日2006年9月6日 申請日期2005年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日
發(fā)明者陳斌, 李正躍, 桂富榮, 孫躍先, 嚴乃勝 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)