專利名稱：八月紅梨果實石細胞含量的分子標記的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供了八月紅梨果實石細胞含量的分子標記，屬于分子遺傳育種領域，可用于 梨果實石細胞含量性狀的早期分子輔助選擇，以提高育種效率。背景技術：
梨(/^r皿L.)原產(chǎn)我國，是我國第三大果樹樹種。梨因其果實營養(yǎng)價值高，香甜多汁， 而深受消費者喜愛。石細胞是影響梨果品質(zhì)的重要因素之一，其作為梨果實中所特有的組 成成分，不僅影響到鮮食品質(zhì)，而且影響到加工品質(zhì)。因此，降低梨果實石細胞的含量，對改 善梨果品質(zhì)至關重要。培育果實石細胞含量少的品種已經(jīng)成為梨育種的重要目標之一。由于梨為多年生木本果樹作物，與果實品質(zhì)相關的性狀大都是由多基因控制、易 受環(huán)境影響的數(shù)量性狀，在分離后代表現(xiàn)為廣泛的表型變異，其基因型與表現(xiàn)型間的對應 關系難以確定。而以往的傳統(tǒng)育種是基于經(jīng)典數(shù)量遺傳學理論，把控制某一性狀的多個基 因作為整體進行研究和選擇，在現(xiàn)有基礎上改良目標性狀難度越來較大。近年來，隨著分子 標記技術的迅速發(fā)展、高密度的分子遺傳圖譜的出現(xiàn)，以及數(shù)量性狀作圖方法的不斷完善， 使得數(shù)量性狀基因座(Quantitative trait loci, QTL)定位變成了現(xiàn)實，也為提高目標數(shù) 量性狀優(yōu)良基因型選擇的可能性、準確性及預見性奠定了基礎。利用分子標記定位數(shù)量性 狀QTL，其實質(zhì)就是分析分子標記與目標性狀QTL之間的連鎖關系，即利用已知座位的分子 標記來定位未知座位的QTL，通過計算分子標記與QTL之間的交換率，來確定QTL的具體位 置。基于獲得的標記基因型分離與數(shù)量性狀的量之間的關系，可直接把握數(shù)量性狀基因，并 開發(fā)可應用于分子標記輔助選擇(Molecular-assisted selection，MAS)育種的技術，這已 在許多重要農(nóng)作物上取得了成功應用。目前有關梨數(shù)量性狀的QTL定位研究仍屬起步階段，已有的研究主要是針對一些 病害或生長性狀，對重要品質(zhì)性狀梨石細胞的QTL定位及分子標記的研究尚沒有開展。因 此，開展梨果實石細胞主效基因的QTL定位，篩選緊密連鎖的分子標記，建立雜交后代早期 輔助選擇技術體系，對于提高梨果石細胞品質(zhì)改良效率，縮短育種進程，節(jié)約生產(chǎn)成本顯得 尤為重要。
發(fā)明內(nèi)容
技術問題
本發(fā)明的目的是定位梨果實石細胞主效QTL，并提供與QTL位點緊密連鎖的分子標記， 通過檢測這些分子標記可以預測梨果實石細胞含量，為實現(xiàn)對該性狀的早期鑒定和篩選提 供分子輔助選擇技術支持。技術方案
一種梨果實石細胞含量主效QTL連鎖的分子標記，是通過下列步驟獲得
a)利用梨品種‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交獲得F1后代單株；
b)采用SRAP 引物 me3 5' - TGAGTCCAAACCGGAAT -3，和 em7 5' - GACTGCGTACGAATTATG -3'以梨基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分 離，對‘八月紅’和‘碭山酥梨’及其雜交后代基因組DNA進行分析，統(tǒng)計分析在親本間具有多態(tài)性的位點在后代群體中的遺傳類型，將得到的多態(tài)性標記位點導入J0inmap3. 0作圖 軟件，構建‘八月紅’梨的遺傳連鎖圖譜；
c)對‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交后代的F1群體單株的果實石細胞含量進行測定，利用 MapQTL5. 0作圖軟件的區(qū)間作圖法，將F1群體每個單株的果實石細胞含量與‘八月紅’梨遺 傳連鎖圖譜中的分子標記進行連鎖和QTL分析，以LOD值彡2. 5為標準，大于2. 5說明存在 一個QTL位點，檢測到在母本‘八月紅’的第7連鎖群上檢測到石細胞含量的QTL位點Pccl， 其LOD值為5. 79，是主效QTL，距離最近的一個分子標記為me;3em7-150h，大小為150bp，距 Pccl的距離為lcM，該標記可以作為梨果實石細胞含量的標記。所述QTL位點Pccl位于 ‘八月紅’梨第7連鎖群上，其解釋36. 1%的石細胞含量特征。所述分子標記在梨分子育種中的應用，其特征在于用梨基因組DNA，采用SRAP引 物 me3:5，_ TGAGTCCAAACCGGAAT -3，和 em7 :5，- GACTGCGTACGAATTATG -3，進行 PCR 擴 增，擴增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如果獲得一個分子標記大小為 150bp，則表明梨果實石細胞含量的主效QTL位點存在，該QTL位點Pccl位于‘八月紅’梨 第7連鎖群上，其解釋36. 1%的石細胞含量特征。有益效果
(1)本發(fā)明首次對決定‘八月紅’梨果實石細胞含量的數(shù)量性狀位點進行了 QTL定位， 這為實現(xiàn)基于分子育種的多基因控制性狀改良奠定了重要的基礎和必要的前提。(2)本發(fā)明中確定了 ‘八月紅’果實石細胞含量的QTL位點，對該數(shù)量性狀決定的 貢獻率較高，位點的貢獻率為36. 1%。因此，基于此位點篩選連鎖分子標記對目標性狀判斷 的準確性大大提高。(3)目前普遍認為可應用于分子輔助選擇的連鎖標記與目標性狀的距離需 ^ 5cM，本發(fā)明中與主效QTL連鎖的標記距離為lcM，與目標位點表現(xiàn)為緊密連鎖，這對于提 高分子標記輔助選擇的準確性和效率具有重要意義。因此，以上標記具有良好的應用價值， 可加快對梨果實石細胞性狀改良的進度
四

圖1為‘八月紅’石細胞含量QTL位點Pccl在Β 17上的位置。BYH代表的是‘八月紅’連鎖群，BYH后的數(shù)字代表連鎖群數(shù)。連鎖群上左側的數(shù)字是標記之間的遺傳距離，單位為cM，右側則表示的是分子標 記的名稱。共有4種分子標記，“E-M-”為AFLP標記，E和M分別指限制性內(nèi)切酶I和 Mse I酶切，其后的數(shù)字是該標記多態(tài)性條帶的編號；其它為SRAP、SSR標記和一個自交不 親和S位點。連鎖群右側的實心長方形指示QTL作圖區(qū)間Peel。右邊的曲線圖為QTL的LOD 分布圖，虛線為2. 5閾值。圖2為SRAP引物組合me;3em7在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖。箭頭所指的 條帶即 me3em7-150h，M 為 pBR322 DNA/ Msp I ladder。五具體實施方式
實施例1
a)利用我國的兩個梨品種‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交組合，獲得其97株&群體。b)用 SSR (Simple sequence repeat)、 SRAP (Sequence related amplified
4polymorphism)禾口 AFLP (Amplified fragment length polymorphism)三禾中分子標記方法 分析兩個親本及其F1群體，統(tǒng)計分析在親本間具有多態(tài)性的位點在后代群體中的遺傳類 型。最終獲得了 23個SSRs、S基因位點、2 個SRAPs和482個AFLPs等共732個多態(tài)性 標記位點，然后利用Jionmap3. 0作圖軟件對其進行連鎖分析，構建了一張共包含240個多 態(tài)性標記的‘八月紅’梨的遺傳連鎖圖譜。利用SSR、SRAP、AFLP分子標記方法，對‘八月紅’和‘碭山酥梨’及后代進行分析， 并統(tǒng)計分析在親本間具有多態(tài)性的位點在后代群體中的遺傳類型。SSR標記的實驗操作程序參考 ^mamoto T.等(Euphytica，2002，1 1四_137)的 方法；SRAP標記的實驗操作程序參考Li等(Theor Appl Genet, 2001,103 :455-461)的方 法；AFLP標記分別使用I和ifes I兩種內(nèi)切酶，具體實驗操作程序參考Vos等(Nucleic Acids Res, 1995，23 :4407-4414)的方法。SSR和SRAP標記用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠強 堿銀染法檢測，AFLP標記用6%變性聚丙烯酰胺凝膠銀染檢測。將SSR、SRAP、AFLP電泳圖譜上清晰出現(xiàn)的多態(tài)性條帶記為“ 1 ”，無帶記為“0”，不 清楚的帶或缺失記為“_”，根據(jù)已知分子量的Marker (IOObp DNA Ladder)計算各多態(tài)性條 帶的分子量。將分離條帶按親本來源歸類，確定其來源及遺傳類型。利用χ 2測驗分析各 標記分離是否符合3:1或1:1的孟德爾分離比例，偏分離的在標記末尾用“*”標注。c)用Joinmap3. 0分析軟件構建‘八月紅’梨的分子遺傳連鎖圖譜。將第b)步驟中得到的多態(tài)性標記位點按Joinmap3. 0分析軟件中適于cp群體構 圖的格式導入J0inmap3. 0，排除缺失數(shù)據(jù)過多的位點和顯著偏分離的位點，以L0D=4. 0 7.0，重組率=0.4，選擇Kosambi作圖函數(shù)構建遺傳連鎖圖(Van Ooi jen，2001 )。d)對該F1群體單株的果實石細胞含量進行了測定，測定方法采用冷凍法(聶繼云， 2006)。將石細胞含量的表型值和‘八月紅’連鎖圖譜的相關文件導入MapQTL5.0作圖軟件， 選擇區(qū)間作圖法，以LOD值>2. 5為標準，對梨的石細胞含量在‘八月紅’的連鎖圖譜上進 行QTL分析和定位。結果表明，在‘八月紅’的第7連鎖群上檢測到石細胞含量的QTL位點Pccl (圖 1)，L0D值為5. 79，與最近的SRAP分子標記me;3em7-150h的連鎖距離為lcM，對該性狀的貢 獻率為36. 1%。該QTL位點為主效QTL，其最近標記的距離也遠小于可應用于分子輔助選擇 的連鎖標記與目標性狀的所要求的最大距離。其中SRAP分子標記方法為，以梨DNA為模板，采用SRAP引物 me3 5’- TGAGTCCAAACCGGAAT -3’
em75' - GACTGCGTACGAATTATG -3'
擴增條件=SRAP分析的PCR擴增體系為總體積20ul 其中包含0. 2mmol · L-I dNTP， 0. 3ymol ‘ L-I 上下游引物，2. Ommol · L-I MgC12，1 個單位的 rTaq 酶，DNA 模板 50ng， IXBuffer。PCR 反應程序為94 °C 3min ;35 個循環(huán)94 °C 40s，55 °C 50s , 72 °C Imin ； 72 °C IOmin, 10 °C IOmin ；
擴增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，能擴增出19條多態(tài)性條帶，其中 150bp大小的一條就是目標條帶me;3em7-150h，則標明QTL位點Pccl (圖1)存在，與SRAP 分子標記me;3em7-150h的連鎖距離為lcM，對該性狀的貢獻率為36. 1%。。實施例2利用篩選到的與‘八月紅’果實石細胞含量主效QTL相連鎖的分子標記對‘八月紅’與 ‘碭山酥梨’的97株&雜交后代進行初步檢測，以檢測該方法在梨果實石細胞含量分子標 記輔助選擇中的實用價值。用該97株后代的基因組DNA及SRAP引物me3和em7進行PCR 反應，電泳后根據(jù)me;3em7-150h條帶的有無來確定是否存在相應的標記，如果存在標記，說 明該植株的果實石細胞含量高，不存在則說明低，同時用實際測得的果實石細胞含量結果 與分子標記檢測結果進行驗證。 結果顯示，在‘八月紅，和‘碭山酥梨，的97株F1雜交后代中，共有63株的DNA 擴增結果出現(xiàn)me;3em7-150h條帶，這63株當中有55株的果實石細胞含量大于4 mg /g，所 有這63株的果實石細胞含量平均值為6. 8 mg /g;共有34株后代的DNA擴增結果不出現(xiàn) me;3em7-150h條帶，其中16株的石細胞含量小于4 mg/g，所有這34株的果實石細胞含量的 平均值為5. 2mg/go用me3em7-150h預測石細胞含量有較好的預測效果。
權利要求
1.一種‘八月紅’梨果實石細胞含量的分子標記，是通過下列步驟獲得a)利用梨品種‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交獲得F1后代單株；b)采用SRAP 引物 me3 5' - TGAGTCCAAACCGGAAT -3，和 em7 5' - GACTGCGTACGAATTATG -3'以梨基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分 離，對‘八月紅’和‘碭山酥梨’及其雜交后代基因組DNA進行分析，統(tǒng)計分析在親本間具有 多態(tài)性的位點在后代群體中的遺傳類型，將得到的多態(tài)性標記位點導入J0inmap3. 0作圖 軟件，構建‘八月紅’梨的遺傳連鎖圖譜；c)對‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交后代的F1群體單株的果實石細胞含量進行測定，利用 MapQTL5. 0作圖軟件的區(qū)間作圖法，將F1群體每個單株的果實石細胞含量與‘八月紅’梨遺 傳連鎖圖譜中的分子標記進行連鎖和QTL分析，以LOD值彡2. 5為標準，大于2. 5說明存在 一個QTL位點，檢測到在母本‘八月紅’的第7連鎖群上檢測到石細胞含量的QTL位點Pccl， 其LOD值為5. 79，是主效QTL，距離最近的一個分子標記為me;3em7-150h，大小為150bp，距 Pccl的距離為lcM，該標記可以作為梨果實石細胞含量的標記。
2.根據(jù)權利要求1所述的分子標記，其特征在于所述QTL位點Pccl位于‘八月紅’梨 第7連鎖群上，其解釋36. 1%的石細胞含量特征。
3.權利要求1或2所述分子標記在梨分子育種中的應用。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于用梨基因組DNA，采用SRAP引物me3 5' - TGAGTCCAAACCGGAAT -3，和 em7 :5，- GACTGCGTACGAATTATG -3，進行 PCR 擴增，擴增產(chǎn) 物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如果獲得一個分子標記大小為150bp，則表 明梨果實石細胞含量的主效QTL位點存在，該QTL位點Pccl位于‘八月紅’梨第7連鎖群 上，其解釋36. 1%的石細胞含量特征。
全文摘要
本發(fā)明提供了‘八月紅’梨果實石細胞含量的分子標記，屬于遺傳育種領域。利用SRAP、SSR、AFLP構建‘八月紅’的遺傳連鎖圖譜，結合對果實石細胞含量的表型鑒定，采用區(qū)間作圖法對此群體進行分析，在‘八月紅’的第7連鎖群上檢測到主效QTL的存在，可解釋36.1%的石細胞含量特征。距離主效QTL位點Pcc1距離最近的標記為me3em7-150h，其距離為1cM。所獲得的石細胞主效QTL分子標記對于加快梨品種的遺傳改良進程，提高育種選擇效率具有重要的理論和實踐指導意義。
文檔編號C12N15/10GK102071195SQ20101055105
公開日2011年5月25日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權日2010年11月19日
發(fā)明者吳俊 , 吳華清, 張瑞萍, 張紹鈴, 陶書田, 齊開杰 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學