一種梨果實(shí)橫徑主效qtl位點(diǎn)的snp標(biāo)記方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種與梨果實(shí)橫徑主效QTL位點(diǎn)的SNP標(biāo)記方法及其應(yīng)用，屬于植物分子育種領(lǐng)域。梨果實(shí)橫徑主效QTL位點(diǎn)的SNP標(biāo)記為Pyb11_398（LOD值=4.66），位于梨基因組序列scaffold355.0的第17705個(gè)堿基處。利用Pyb11_398開發(fā)基于高分辨率溶解曲線鑒定梨果實(shí)橫徑的特異標(biāo)記，該特異引物可對(duì)果實(shí)橫徑進(jìn)行良好分型，即檢測QTL位點(diǎn)Pyb11_398上的多態(tài)性表達(dá)果實(shí)橫徑大小的差異。本發(fā)明提供的梨果實(shí)橫徑主效QTL的SNP標(biāo)記可用于梨果實(shí)橫徑性狀的分子標(biāo)記輔助選擇育種，對(duì)于加快梨品種的遺傳改良進(jìn)程，提高育種選擇效率具有重要的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。
【專利說明】一種梨果實(shí)橫徑主效QTL位點(diǎn)的SNP標(biāo)記方法及其應(yīng)用
[0001]一、【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于分子遺傳育種領(lǐng)域，提供了梨果實(shí)橫徑主效QTL位點(diǎn)的SNP標(biāo)記方法及其應(yīng)用，可用于梨果實(shí)橫徑性狀的早期分子輔助選擇，以提高育種效率。
[0002]二、【背景技術(shù)】
梨(PyrusL.)原產(chǎn)我國，是我國第三大果樹樹種，因其果實(shí)營養(yǎng)價(jià)值高，香甜多汁，而深受消費(fèi)者喜愛。果實(shí)大小是梨果綜合品質(zhì)的重要因素之一，橫徑作為衡量果實(shí)大小的重要指標(biāo)，直接影響果實(shí)的大小，從而影響梨果實(shí)的產(chǎn)量，對(duì)于梨的生產(chǎn)應(yīng)用具有重要的影響。因此，增大梨果實(shí)橫徑、增加果實(shí)大小對(duì)改善梨果品質(zhì)和產(chǎn)量至關(guān)重要，是梨育種的重要目標(biāo)之一。
[0003]由于梨為多年生木本果樹作物，與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的性狀大都是由多基因控制、易受環(huán)境影響的數(shù)量性狀，在分離后代表現(xiàn)為廣泛的表型變異，其基因型與表現(xiàn)型間的對(duì)應(yīng)關(guān)系難以確定。而以往的傳統(tǒng)育種是基于經(jīng)典數(shù)量遺傳學(xué)理論，把控制某一性狀的多個(gè)基因作為整體進(jìn)行研究和選擇，在現(xiàn)有基礎(chǔ)上改良目標(biāo)性狀難度越來較大。近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的迅速發(fā)展、高密度的分子遺傳圖譜的出現(xiàn)，以及數(shù)量性狀作圖方法的不斷完善，使得數(shù)量性狀基因座QTL定位變成了現(xiàn)實(shí)，也為提高目標(biāo)數(shù)量性狀優(yōu)良基因型選擇的可能性、準(zhǔn)確性及預(yù)見性奠定了基礎(chǔ)。利用分子標(biāo)記定位數(shù)量性狀QTL，其實(shí)質(zhì)就是分析分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀QTL之間的連鎖關(guān)系，即利用已知座位的分子標(biāo)記來定位未知座位的QTL，通過計(jì)算分子標(biāo)記與QTL之間的交換率，來確定QTL的具體位置?；讷@得的標(biāo)記基因型分離與數(shù)量性狀的量之間的關(guān)系，可直接把握數(shù)量性狀基因，并開發(fā)可應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇(Molecular-assisted selection, MAS)育種的技術(shù),這已在許多重要農(nóng)作物上取得了成功應(yīng)用。
[0004]目前對(duì)梨重要品質(zhì)性狀橫徑的QTL定位及檢測QTL位點(diǎn)多態(tài)性表達(dá)果實(shí)橫徑大小差異的SNP分子標(biāo)記開發(fā)應(yīng) 用的研究尚沒有開展。因此，開展梨果實(shí)橫徑性狀主效QTL的定位，基于相應(yīng)序列信息開發(fā)SNP分子標(biāo)記，并建立雜交后代早期輔助選擇技術(shù)體系，對(duì)于提高梨果實(shí)大小和產(chǎn)量等重要性狀的遺傳改良效率，節(jié)約生產(chǎn)成本具有重要意義。
[0005]三、
【發(fā)明內(nèi)容】
技術(shù)要求
本發(fā)明的目的是定位梨果實(shí)橫徑長度的主效QTL，根據(jù)貢獻(xiàn)位點(diǎn)Pybll_398序列信息開發(fā)基于高分辨率溶解曲線鑒定梨果實(shí)橫徑的SNP特異標(biāo)記，檢測QTL位點(diǎn)Pybll_398上的多態(tài)性表達(dá)果實(shí)橫徑大小的差異。通過該分子標(biāo)記可以預(yù)測梨果實(shí)橫徑長度的大小，為實(shí)現(xiàn)橫徑性狀的早期鑒定和篩選提供分子輔助選擇技術(shù)支持。
[0006]技術(shù)方案
一種與梨果實(shí)橫徑主效QTL位點(diǎn)緊密連鎖的SNP標(biāo)記引物，其特征在于:
正向引物 TD-F 5，-GATCCCTCTTGCAGTTCCCAA-3，
反向引物 TD-R 5，-GACCGCAATTGGCAGAACAAA-3 ’
該引物用來檢測梨基因組序列scaffold355.0 (登錄號(hào)為AJSU00000000)的第17705個(gè)堿基處是否存在一個(gè)與梨果實(shí)橫徑相關(guān)的QTL位點(diǎn)Pybll_398，同時(shí)檢測QTL位點(diǎn)Pybl 1_398上的多態(tài)性表達(dá)果實(shí)橫徑大小的差異，該SNP標(biāo)記位于第11連鎖群的108.87 cM處，其解釋了遺傳變異的19.15%，LOD值為4.66。
[0007]所述引物用于檢測梨果實(shí)橫徑主效QTL位點(diǎn)的SNP標(biāo)記方法，其特征在于:
HRM 反應(yīng)體系按照 LightCycler? 480 High Resolution Melting Master 試劑盒中的說明書進(jìn)行，HRM分析是在LightCycler? 480 II熒光定量PCR儀(Roche)上進(jìn)行；
10μ L反應(yīng)體系:含有2 ng.μ 梨基因組DNA模板，I X Master Mix, 2.0 mmol
?I71 MgCl2,0.2 mmol.I71權(quán)利要求1所述的引物；
擴(kuò)增程序采用降落式PCR (touchdown PCR):95 °C預(yù)變性10 min，然后95 V變性10s、60~55 °C(每循環(huán)下降0.5 °C)退火15 s、72 V延伸12 s的程序進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列大小在287 bp,則表明存在一個(gè)與梨果實(shí)橫徑相關(guān)的QTL位點(diǎn)Pybll_398 ；PCR循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解，其程序?yàn)?95 °C I min, 40 V I min, 65 V I s，再從65 V連續(xù)升溫至95 °C，每升高0.04°C，收集熒光I次，最后降溫至40 V ;
最后，在LightCycIer? 480 II的Gene Scanning軟件中1.5 version自動(dòng)生成擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線，分別以已知梨果實(shí)橫徑相關(guān)的QTL位點(diǎn)Pybll_398上表達(dá)的果實(shí)橫徑大的品種和表達(dá)的果實(shí)橫徑小的品種為對(duì)照，檢測QTL位點(diǎn)Pybll_398上的多態(tài)性表達(dá)果實(shí)橫徑大小的差異。如果未知品種得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線與對(duì)照的顏色相同、線型相似，則表示在梨果實(shí)橫徑主效QTL位點(diǎn)Pybll_398上的多態(tài)性表達(dá)的果實(shí)橫徑大小和對(duì)照相似。
[0008]所述的已知與梨果實(shí)橫徑相關(guān)的QTL位點(diǎn)Pybll_398上表達(dá)的果實(shí)橫徑大的品種為‘碭山酥梨’，表達(dá)的果實(shí)橫徑小的品種為‘八月紅’。
[0009]所述引物和方法可以用在梨分子輔助育種中檢測梨果實(shí)橫徑主效QTL位點(diǎn)是否存在，同時(shí)檢測QTL位點(diǎn)Pybll_398上的多態(tài)性表達(dá)果實(shí)橫徑大小的差異。
[0010]有益效果
(I)本發(fā)明首次對(duì)梨果實(shí)橫徑數(shù)量性狀位點(diǎn)進(jìn)行了 QTL定位，且定位的QTL位點(diǎn)對(duì)該數(shù)量性狀的貢獻(xiàn)率較高，位點(diǎn)的貢獻(xiàn)率為19.15%。這為實(shí)現(xiàn)基于分子輔助育種的多基因控制性狀遺傳改良奠定了重要的基礎(chǔ)和必要的前提。
[0011](2)目前普遍認(rèn)為可應(yīng)用于分子輔助選擇的連鎖標(biāo)記與目標(biāo)性狀的距離需(5cM,本發(fā)明中果實(shí)橫徑主效QTL定位直接定位到SNP標(biāo)記上，且LOD值為4.66，連鎖性和可靠性高，這對(duì)于提高分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確性和效率具有重要意義。
[0012](3)本發(fā)明根據(jù)定位的梨果實(shí)橫徑性狀主效QTL位點(diǎn)連鎖標(biāo)記Pybll_398開發(fā)檢測QTL位點(diǎn)Pybll_398上的多態(tài)性表達(dá)果實(shí)橫徑大小差異的SNP標(biāo)記引物，用于預(yù)測果實(shí)橫徑大小，為梨果實(shí)橫徑大小的預(yù)先選擇提供了可靠的分子標(biāo)記來源。
[0013](4)利用開發(fā)的SNP標(biāo)記引物，對(duì)‘八月紅’和‘碭山酥梨’ 70株雜交群體進(jìn)行基因型檢測，可將雜交群體分為兩組，與果實(shí)實(shí)際測量的橫徑大和小相符。群體試驗(yàn)表明，開發(fā)的SNP標(biāo)記特異引物可以檢測QTL位點(diǎn)Pybll_398上的多態(tài)性表達(dá)果實(shí)橫徑大小的差異，對(duì)后代橫徑進(jìn)行良好分型(圖2)，因此，具有良好的應(yīng)用價(jià)值，可實(shí)現(xiàn)對(duì)梨果實(shí)橫徑性狀的預(yù)先選擇和輔助育種。
[0014]四、【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為與梨果實(shí)橫徑長度主效QTL區(qū)間及SNP標(biāo)記位點(diǎn)Pybll_398在第11連鎖群上的位置。LGll代表的是‘八月紅’和‘碭山酥梨’合并遺傳連鎖圖譜的第11連鎖群。SNP標(biāo)記名稱起始為‘Pyb’的代表來自‘八月紅’的SNP標(biāo)記，起始名稱為‘Pyd’的代表來自‘碭山酥梨’的SNP標(biāo)記。
[0015]連鎖群上左側(cè)的數(shù)字是標(biāo)記之間的遺傳距離，單位為CM。連鎖群右側(cè)的實(shí)心長方形指示QTL作圖區(qū)間。右邊的曲線圖為QTL的LOD分布圖，灰色線為3.0閾值。果實(shí)橫徑QTL位點(diǎn)對(duì)應(yīng)連鎖群上的Pybll_398標(biāo)記，其位于11連鎖群108.87 cM處，LOD值為4.66。
[0016]圖2為根據(jù)Pybll_398開發(fā)的HRM特異標(biāo)記引物，在‘八月紅’和‘碭山酥梨’70株雜交群體中檢測的溶解曲線，可良好分型。熔解曲線:線型I一紅色曲線，28株個(gè)體，為橫徑小，均值6.23cm ;線型2—綠色曲線，42株個(gè)體，為橫徑大，均值6.93cm。兩組差值為0.7cm,差異達(dá)到顯著水平(P小于0.05)。
[0017]五、【具體實(shí)施方式】 實(shí)施例1:
梨果實(shí)橫徑主效QTL位點(diǎn)及連鎖的分子標(biāo)記，是通過以下方法獲得的:a)利用‘八月紅’和‘碭山酥梨’(品種為公知公用，見文獻(xiàn):張瑞萍等，梨AFLP標(biāo)記遺傳圖譜構(gòu)建及果實(shí)相關(guān)性狀的QTL定位，園藝學(xué)報(bào)，2011，38 (10):1991 - 1998)雜交獲得其102個(gè)F1后代單株。
[0018]b)利用RADseq方法高通量測序，對(duì)‘八月紅’和‘碭山酥梨’及后代進(jìn)行分析，并統(tǒng)計(jì)分析多態(tài)性位點(diǎn)在后代群體中的遺傳類型，利用X 2測驗(yàn)分析各標(biāo)記分離是否符合3:1或1:1的孟德爾遺傳分離比例。
[0019]c)用Joinmap4.0分析軟件構(gòu)建梨的SNP分子遺傳連鎖圖譜。將b)步驟中得到的符合遺傳分離的多態(tài)性標(biāo)`記位點(diǎn)按Joinmap4.0分析軟件中適于構(gòu)圖的格式導(dǎo)入Joinmap4.0，排除缺數(shù)據(jù)過多的位點(diǎn)和顯著偏分離的位點(diǎn)，卡方檢測的P值為0.05，選擇Kosambi作圖函數(shù)構(gòu)建遺傳連鎖圖。
[0020]d)對(duì)‘八月紅’和‘碭山酥梨’及其F1群體單株的果實(shí)橫徑長度進(jìn)行測定，采用游標(biāo)卡尺測量。
[0021]e)將果實(shí)橫徑長度的表型值和標(biāo)記信息的相關(guān)文件導(dǎo)入MapQTL5.0軟件,選擇多區(qū)間作圖法，以LOD值> 3為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)梨的橫徑長度進(jìn)行QTL分析和定位。結(jié)果表明，第
11連鎖群上檢測到橫徑性狀的主效QTL位點(diǎn)，對(duì)該性狀的貢獻(xiàn)率為19.15%，其對(duì)應(yīng)的SNP標(biāo)記為 Pybll_398 (圖1), LOD 值為 4.66。
[0022]f )利用SNP標(biāo)記位點(diǎn)Pybll_398開發(fā)HRM特異引物。
[0023]依據(jù)梨全基因組序列(http://peargenome.njau.edu.cn/)搜索到該SNP標(biāo)記的序列信息，選取其前后200bp的核苷酸序列，依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)I對(duì)SNP標(biāo)記引物(正向引物序列TD-F為5，-GATCCCTCTTGCAGTTCCCAA-3 ’，反向引物TD-R為5’ -GACCGCAATTGGCAGAACAAA-3’)，擴(kuò)增序列大小287 bp。利用設(shè)計(jì)的SNP標(biāo)記特異引物對(duì)‘八月紅’和‘碭山酥梨’的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物均擴(kuò)增正常，PCR產(chǎn)物符合預(yù)期大小。因此，該引物可作為梨果實(shí)橫徑性狀的檢測標(biāo)記。
[0024]g)利用HRM技術(shù)對(duì)梨果實(shí)橫徑進(jìn)行分型。
[0025]HRM 反應(yīng)體系按照 LightCycler? 480 High Resolution Melting Master 試劑盒中的說明書進(jìn)行，HRM分析是在LightCycler? 480 II熒光定量PCR儀(Roche)上進(jìn)行。[0026]10 μ L反應(yīng)體系中含有2 ng.μ L-1 DNA 模板，I X Master Mix, 2.0 mmol.L-1MgCl2,0.2 mmol.L-1弓丨物。擴(kuò)增程序采用降落式PCR (touchdown PCR):95 °C預(yù)變性10min，然后95 V變性10 s、60~55 V (每循環(huán)下降0.5 °C)退火15 s、72 V延伸12 s的程序進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。
[0027]PCR循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解，其程序?yàn)?95 V I min, 40 V I min, 65 V I s,再從65 V連續(xù)升溫至95 °C，每升高0.04°C，收集熒光I次，最后降溫至40 °C。最后，在LightCycIer? 480 II的Gene Scanning軟件中(1.5 version)自動(dòng)生成擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線。
[0028]利用g)步驟得到SNP標(biāo)記引物對(duì)‘八月紅’ X ‘碭山酥梨’的70個(gè)雜交后代群體HRM分析熔解曲線(圖2):
線型I一紅色曲線,28株個(gè)體線型相似，為橫徑小，均值為6.23cm ；
線型2—綠色曲線，42株個(gè)體線型相似，為橫徑大，均值為6.93cm。
[0029]統(tǒng)計(jì)分析表明，70個(gè)個(gè)體分型為兩種基因型，分離比例為28:42。根據(jù)基因分型結(jié)果將這70個(gè)個(gè)體的果實(shí)橫徑表型數(shù)據(jù)，進(jìn)行顯著性測驗(yàn)，測驗(yàn)結(jié)果顯示兩組基因型的個(gè)體果實(shí)橫徑差值為0.7cm，差異顯著(Ρ=0.005)。
[0030]因此，通過對(duì)果實(shí)橫徑性狀的表型測定結(jié)果與HRM分型結(jié)果的比較分析，證明該特異SNP標(biāo)記可檢測QTL位點(diǎn)Pybll_398上的多態(tài)性表達(dá)果實(shí)橫徑大小的差異，對(duì)梨果實(shí)橫徑良好分型 。
【權(quán)利要求】
1.一種與梨果實(shí)橫徑主效QTL位點(diǎn)的SNP標(biāo)記引物，其特征在于: 正向引物 TD-F 5，-GATCCCTCTTGCAGTTCCCAA-3， 反向引物 TD-R 5，-GACCGCAATTGGCAGAACAAA-3 ’ 該引物用來檢測登錄號(hào)為AJSUOOOOOOOO的梨基因組序列scaffold355.0的第17705個(gè)堿基處是否存在一個(gè)與梨果實(shí)橫徑相關(guān)的QTL位點(diǎn)Pybll_398，同時(shí)檢測QTL位點(diǎn)Pybll_398上的多態(tài)性表達(dá)果實(shí)橫徑大小的差異，該位點(diǎn)位于第11連鎖群的108.87 cM處，其解釋了遺傳變異的19.15%，對(duì)應(yīng)的SNP標(biāo)記為Pybll_398，LOD值為4.66。
2.權(quán)利要求1所述引物用于檢測梨果實(shí)橫徑主效QTL位點(diǎn)的SNP標(biāo)記方法，其特征在于: HRM 反應(yīng)體系按照 LightCycler? 480 High Resolution Melting Master 試劑盒中的說明書進(jìn)行，HRM分析是在LightCycler? 480 II熒光定量PCR儀上進(jìn)行； 10μ L反應(yīng)體系:含有2 ng.μl-1梨基因組DNA模板，I X Master Mix, 2.0 mmol?I71 MgCl2,0.2 mmol.I71權(quán)利要求1所述的引物； 擴(kuò)增程序采用降落式PCR:95 °C預(yù)變性10 min，然后95 V變性10 s、60~55 °C，每循環(huán)下降0.5°C，退火15 s、72°C延伸12 s的程序進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列大小在287 bp，則表明存在一個(gè)與梨果實(shí)橫徑相關(guān)的QTL位點(diǎn)Pybll_398 ； PCR循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解，其程序?yàn)?95 V I min, 40 V I min, 65 V I S，再從65 V連續(xù)升溫至95 °C，每升高0.04°C，收集熒光I次，最后降溫至40 V ; 最后，在 LightCycler? 480 II 的 Gene Scanning 軟件中 1.5 version 自動(dòng)生成擴(kuò)增產(chǎn)物的不同顏色和線型的熔解曲線，分別以已知梨果實(shí)橫徑相關(guān)的QTL位點(diǎn)Pybll_398上表達(dá)的果實(shí)橫徑大的品種和表達(dá)的果實(shí)橫徑小的品種為對(duì)照，檢測QTL位點(diǎn)Pybll_398上的多態(tài)性表達(dá)果實(shí)橫徑大小的差異，如果未知品種得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線與對(duì)照的顏色相同、線型相似，則表示在梨果實(shí)橫徑主效QTL位點(diǎn)Pybll_398上的多態(tài)性表達(dá)的果實(shí)橫徑大小和對(duì)照相似。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述的已知與梨果實(shí)橫徑相關(guān)的QTL位點(diǎn)Pybll_398上表達(dá)的果實(shí)橫徑大的品種為‘碭山酥梨’，表達(dá)的果實(shí)橫徑小的品種為‘八月紅’。
4.權(quán)利要求1所述引物在梨分子育種中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2或3所述方法在梨分子育種中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103773864SQ201410016651
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月14日
【發(fā)明者】張紹鈴, 吳俊 , 李夢, 齊開杰, 李雷廷, 李曉龍, 陳惠
申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)