專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)豬肉品質(zhì)性狀的方法及專(zhuān)用引物對(duì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)豬肉品質(zhì)性狀的方法及專(zhuān)用弓丨物對(duì)。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)期以來(lái)，世界豬育種工作主要集中在生長(zhǎng)速度、飼料利用率、瘦肉率的選育提高 上，但在其取得顯著進(jìn)展的同時(shí)，也導(dǎo)致豬肉品質(zhì)有所下降。隨著人們物質(zhì)生活水平的提 高，人們對(duì)豬肉的需求已經(jīng)不再僅僅追求數(shù)量，而對(duì)豬肉品質(zhì)的要求也越來(lái)越高。因此，目 前對(duì)于豬育種工作的重點(diǎn)已逐步轉(zhuǎn)向豬肉品質(zhì)性狀的改善。大理石紋、嫩度和多汁性直接影響豬肉外觀，這些表觀性狀直接影響消費(fèi)者對(duì)豬 肉的購(gòu)買(mǎi)欲。豬肉中的脂肪含量特別是肌內(nèi)脂肪含量直接影響口感。研究表明肌內(nèi)脂肪 (IMF)與豬肉的大理石紋、風(fēng)味、嫩度和多汁性直接相關(guān)，是豬肉品質(zhì)性狀中最具有經(jīng)濟(jì)價(jià) 值的性狀，因此育種價(jià)值很高。豬H-FABP基因定位于6號(hào)染色體Sw316和S0003之間，心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白 (H-FABP)基因位于這一區(qū)間，其核苷酸序列如GenBank Accession Number HM591296所示； 該基因的第二外顯子的核苷酸序列如GenBank Accession Number HM591296的自5'末端 起第5493-5665位核苷酸所示。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種輔助鑒別豬的豬肉品質(zhì)性狀的方法。本發(fā)明所提供的輔助鑒別豬的豬肉品質(zhì)性狀的方法，為如下1)或2)所示1)包括如下步驟檢測(cè)待測(cè)豬的基因組中SEQ ID NO=I所示DNA片段的自5'末 端起第289位核苷酸是T還是C，若為T(mén)，則將所述待測(cè)豬記作基因型TT ；若為C，則將所述 待測(cè)豬記作基因型CC ；基因型TT的待測(cè)豬的豬肉品質(zhì)候選高于基因型CC的待測(cè)豬；2)包括如下步驟檢測(cè)待測(cè)豬的基因組中H-FABP基因的第二外顯子的自5'末端 起第79位核苷酸是T還是C，若為T(mén)，則將所述待測(cè)豬記作基因型TT ；若為C，則將所述待測(cè) 豬記作基因型CC ；基因型TT的待測(cè)豬的豬肉品質(zhì)候選高于基因型CC的待測(cè)豬。上述方法中，所述檢測(cè)待測(cè)豬的基因組中SEQ ID N0:1所示DNA片段的自5'末端 起第289位核苷酸是T還是C的方法包括如下步驟用如下引物對(duì)對(duì)所述待測(cè)豬進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；根據(jù)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)待測(cè)豬的基因組中SEQ IDNO 1所示 DNA片段的自5'末端起第289位核苷酸是T還是C;所述引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 所示。上述方法中，根據(jù)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)待測(cè)豬的基因組中SEQ ID NO :1所示DNA 片段的自5'末端起第289位核苷酸是T還是C的方法可采用任何現(xiàn)有方法，如測(cè)序分析、 PCR-SSCP、PCR-RFLP 法等。上述方法中，所述豬肉品質(zhì)性狀為肌內(nèi)脂肪含量和/或大理石紋評(píng)分。上述方法中，所述豬可是任何品種的豬，具體可以是由大白豬和民豬雜交得到的豬。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于輔助鑒別豬的豬肉品質(zhì)性狀的引物對(duì)。本發(fā)明所提供的用于輔助鑒別豬的豬肉品質(zhì)性狀的引物對(duì)，其核苷酸序列如 SEQID NO :2 和 SEQ ID NO 3 所示。上述豬肉品質(zhì)性狀為肌內(nèi)脂肪含量和/或大理石紋評(píng)分。上述豬可是任何品種的豬，具體可以是由大白豬和民豬雜交得到的豬。上述任一所述方法在豬的育種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述引物對(duì)在豬的育種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育豬的方法。本發(fā)明所提供的培育豬的方法，為如下1)或2)所示1)包括如下步驟檢測(cè)待測(cè)豬的基因組中SEQ ID NO=I所示DNA片段的自5'末 端起第289位核苷酸是T還是C，若為T(mén)，則將所述待測(cè)豬記作基因型TT ；選取基因型TT的 待測(cè)豬進(jìn)行育種；2)包括如下步驟檢測(cè)待測(cè)豬的基因組中H-FABP基因的第二外顯子的自5'末端 起第79位核苷酸是T還是C，若為T(mén)，則將所述待測(cè)豬記作基因型TT ；選取基因型TT的待 測(cè)豬進(jìn)行育種。上述培育豬的方法中，所述檢測(cè)待測(cè)豬的基因組中SEQ ID NO=I所示DNA片段的 自5'末端起第289位核苷酸是T還是C的方法包括如下步驟用如下引物對(duì)對(duì)所述待測(cè)豬 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；根據(jù)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)待測(cè)豬的基因組中SEQ ID NO 1所示DNA片段的自5'末端起第289位核苷酸是T還是C ；所述引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。上述培育豬的方法中，根據(jù)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)待測(cè)豬的基因組中SEQ ID NO 1所示DNA片段的自5'末端起第289位核苷酸是T還是C的方法可采用任何現(xiàn)有方法，如 測(cè)序分析、PCR-SSCP, PCR-RFLP 法等。本發(fā)明方法只需進(jìn)行PCR反應(yīng)，測(cè)序即可判別個(gè)體的基因型，基因型判型非常準(zhǔn) 確，檢測(cè)費(fèi)用不高。本發(fā)明方法，在豬的初產(chǎn)階段，便可快速準(zhǔn)確的鑒別出豬的基因型，從而 判斷待測(cè)豬的豬肉品質(zhì)的好壞，將其用于豬的育種中，可對(duì)待選豬進(jìn)行早期篩選，有效地緩 解實(shí)際生產(chǎn)中的選優(yōu)良種豬時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，降低育種花費(fèi)，有效提高實(shí)際生產(chǎn)中的豬肌內(nèi) 脂肪含量和大理石紋，從而獲得更高品質(zhì)豬肉。本發(fā)明的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用不高、準(zhǔn) 確度高，并可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的直接檢測(cè)。本發(fā)明將在豬的育種工作中發(fā)揮巨大作用。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。下述實(shí)施例中使用的豬為大民雜交豬，由大白豬和民豬雜交而成，大民雜交豬購(gòu) 自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平實(shí)驗(yàn)豬場(chǎng)。實(shí)施例1、豬肉品質(zhì)性狀的鑒別一、基因多態(tài)性位點(diǎn)的確定
1、PCR 擴(kuò)增引物對(duì)如下U (上游引物)5，-TGCCTGCTCCTTAAGCTTCT-3，(序列表的序列 1);D (下游引物)5，-GGGAGGGAGGAAAACAAGAG-3，(序列表的序列 2)。分別以3頭大民雜交豬的基因組DNA為模板，使用引物U和D進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為基因組DNA 200ng，10XPCR擴(kuò)增緩沖液5μ 1，dNTPs 10mM，上、下游 引物各50ng，Taq DNA聚合酶0. 75U, Mg2+ 2. 5mmol/L，用ddH20補(bǔ)充反應(yīng)體系至50 μ 1。PCR反應(yīng)條件為95°C變性5min ；然后95°C變性20s，58°C退火30s，72°C延伸30s， 共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)后于-20°C保存。以3頭大民豬的基因組DNA為模板 進(jìn)行擴(kuò)增的產(chǎn)物分別命名為產(chǎn)物1、產(chǎn)物2、產(chǎn)物3。2、克隆測(cè)序及序列分析分別將3種PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)回收純 化，回收的DNA片段連接載體pGEM-T(Pr0mega公司)后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感 受態(tài)細(xì)胞(明日百傲(北京)科技有限公司)，根據(jù)載體上的羧卞青霉素抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性 克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒載體上的T7和SP6啟動(dòng)子序列為引物 對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQID NO :1所示，序列長(zhǎng) 度為566bp。三種產(chǎn)物序列存在單個(gè)核苷酸序列差異，產(chǎn)物1 在SEQ ID NO=I中第289位 核苷酸是T ；產(chǎn)物2 在SEQ ID NO 1中第289位核苷酸有的是T，有的是C ；產(chǎn)物3 在SEQ ID NO 1中第289位核苷酸是C。將SEQ ID NO=I所示DNA片段的第289位核苷酸是T的 豬記作基因型TT的豬；將SEQ ID NO :1所示DNA片段的第289位核苷酸是T和C的豬記作 基因型TC的豬；將SEQ ID NO 1所示DNA片段的第289位核苷酸是C的豬記作基因型CC 的豬。SEQ ID NO 1 所示 DNA 片段包含 GenBank Accession Number HM591296 所示的基
因的第二外顯子。核苷酸序列差異位于H-FABP 基因(GenBank Accession Number HM591296)第二 外顯子的5'末端起第79位(將外顯子的5'末端記作第1位)。二、核苷酸多態(tài)位點(diǎn)與豬肉品質(zhì)性狀的相關(guān)性分析為確定核苷酸多態(tài)性與豬肉品質(zhì)性狀是否相關(guān)，以81頭大民雜交豬為實(shí)驗(yàn)材料， 進(jìn)行如下試驗(yàn)按照實(shí)驗(yàn)一中所述方法，測(cè)得每頭豬中SEQ ID NO 1片段的核苷酸多態(tài)性； 同時(shí)測(cè)定并記錄肌內(nèi)脂肪含量(IMF)、24小時(shí)pH值(pH24)、6-7肋背膘厚、大理石紋評(píng)分、 水份、嫩度肉品質(zhì)性狀，對(duì)核苷酸多態(tài)性與肉品質(zhì)性狀開(kāi)展關(guān)聯(lián)分析。對(duì)于單頭豬而言，肌內(nèi)脂肪含量(IMF)的檢測(cè)方法將豬屠宰后，取第11 12肋骨處背最長(zhǎng)肌切碎，65°C恒溫處理72小時(shí)制成風(fēng) 干樣。稱(chēng)風(fēng)干肉樣3-5g，用濾紙包扎后于103-105°C烘箱中烘2小時(shí)，移入索氏脂肪抽提 器的浸提管中，浸提管套在脂肪收集瓶中，稱(chēng)量浸提前脂肪收集瓶空瓶重量，之后向浸提中 加入無(wú)水乙醚，按儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行肌內(nèi)脂肪抽提，回收乙醚后，將浸提后脂肪收集瓶放入 103-105°C烘箱中烘10分鐘，干燥器內(nèi)冷卻30分鐘后，稱(chēng)重。按如下公式計(jì)算肌內(nèi)脂肪含 量
肌內(nèi)脂肪(％)=((浸提后脂肪收集瓶重_浸提前脂肪收集瓶重)/風(fēng)干樣 重)X100%o對(duì)于單頭豬而言，大理石紋評(píng)分的方法以豬肉大理石紋評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)卡(NPPC， 1999)為標(biāo)準(zhǔn)，取屠宰24小時(shí)后的豬左半胴體10-11肋背最長(zhǎng)肌，目測(cè)其橫切面大理石紋給 出評(píng)分。關(guān)聯(lián)分析的方法運(yùn)用SAS8. 2軟件中的單因素方差分析軟件包進(jìn)行基因型-性狀 關(guān)聯(lián)分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果一致。結(jié)果見(jiàn)表1。表IH-FABP基因第二外顯子突變位點(diǎn)基因型與肉品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)
基因型NIMF (%)pH246-7肋背膘厚 (mm)大理石紋評(píng)分水份(％)嫩度(Kg.W)TT TC CC16 42 233.76±0.59a 3.09±0.38 2.13±0.25b5.65±0.07 5.76±0.04 5.70±0.0635.80±2.07 36.91±1.24 36.04士 1.923.01±0.30a 2.75±0.16ab 2.18±0.21b72.90±0.57 73.23±0.34 73.57±0.244.64±0.17 4.82±0.14 4.67±0.20注同列上標(biāo)含有相同字母表示差異不顯著(P > 0. 05)，不同字母表示差異顯著 (P < 0. 05)。結(jié)果表明在肉品質(zhì)性狀中，TT基因型個(gè)體分別比CC基因型個(gè)體在肌內(nèi)脂肪含量 和大理石紋評(píng)分方面分別多1. 63%和0. 83 (P < 0. 05)。所以，在實(shí)際的豬育種中，為獲得更好肉品質(zhì)的豬，最好選擇TT基因型的豬進(jìn)行 育種。
權(quán)利要求
一種輔助鑒別豬的豬肉品質(zhì)性狀的方法，為如下1)或2)所示1)包括如下步驟檢測(cè)待測(cè)豬的基因組中SEQ ID NO1所示DNA片段的自5′末端起第289位核苷酸是T還是C，若為T(mén)，則將所述待測(cè)豬記作基因型TT；若為C，則將所述待測(cè)豬記作基因型CC；基因型TT的待測(cè)豬的豬肉品質(zhì)候選高于基因型CC的待測(cè)豬；2)包括如下步驟檢測(cè)待測(cè)豬的基因組中H FABP基因的第二外顯子的自5′末端起第79位核苷酸是T還是C，若為T(mén)，則將所述待測(cè)豬記作基因型TT；若為C，則將所述待測(cè)豬記作基因型CC；基因型TT的待測(cè)豬的豬肉品質(zhì)候選高于基因型CC的待測(cè)豬。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述檢測(cè)待測(cè)豬的基因組中SEQIDNO=I 所示DNA片段的自5'末端起第289位核苷酸是T還是C的方法包括如下步驟用如下引 物對(duì)對(duì)所述待測(cè)豬進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；根據(jù)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)待測(cè)豬的 基因組中SEQ ID NO 1所示DNA片段的自5'末端起第289位核苷酸是T還是C ；所述引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID N0:3所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述豬肉品質(zhì)性狀為肌內(nèi)脂肪含量 和/或大理石紋評(píng)分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述豬是由大白豬和民豬雜交 得到的。
5.一種用于輔助鑒別豬的豬肉品質(zhì)性狀的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2和 SEQ ID NO 3 所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的引物對(duì)，其特征在于所述豬肉品質(zhì)性狀為肌內(nèi)脂肪含量和/ 或大理石紋評(píng)分。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的引物對(duì)，其特征在于所述豬是由大白豬和民豬雜交得 到的。
8.權(quán)利要求1-4中任一所述方法在豬的育種中的應(yīng)用；權(quán)利要求5-7中任一所述引物 對(duì)在豬的育種中的應(yīng)用。
9.一種培育豬的方法，為如下1)或2)所示1)包括如下步驟檢測(cè)待測(cè)豬的基因組中SEQID NO 1所示DNA片段的自5'末端起 第289位核苷酸是T還是C，若為T(mén)，則將所述待測(cè)豬記作基因型TT ；選取基因型TT的待測(cè) 豬進(jìn)行育種；2)包括如下步驟檢測(cè)待測(cè)豬的基因組中H-FABP基因的第二外顯子的自5'末端起第 79位核苷酸是T還是C，若為T(mén)，則將所述待測(cè)豬記作基因型TT ；選取基因型TT的待測(cè)豬進(jìn) 行育種。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述檢測(cè)待測(cè)豬的基因組中SEQIDNO 1所示DNA片段的自5'末端起第289位核苷酸是T還是C的方法包括如下步驟用如下引 物對(duì)對(duì)所述待測(cè)豬進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；根據(jù)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)待測(cè)豬的 基因組中SEQ ID NO 1所示DNA片段的自5'末端起第289位核苷酸是T還是C ；所述引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)豬肉品質(zhì)性狀的方法及專(zhuān)用引物對(duì)。該輔助鑒別豬的豬肉品質(zhì)性狀的方法，包括如下步驟檢測(cè)待測(cè)豬的基因組中SEQ ID NO1所示DNA片段的自5′末端起第289位核苷酸是T還是C，若為T(mén)，則將所述待測(cè)豬記作基因型TT；若為C，則將所述待測(cè)豬記作基因型CC；基因型TT的待測(cè)豬的豬肉品質(zhì)候選高于基因型CC的待測(cè)豬。本發(fā)明方法可快速準(zhǔn)確的鑒別出豬的基因型，從而判斷待測(cè)豬的豬肉品質(zhì)的好壞，將其用于豬的育種中，可加快育種進(jìn)程。因此，本發(fā)明方法在豬的育種中有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101935706SQ201010270230
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月2日
發(fā)明者張龍超, 王立剛, 王立賢, 顏華 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所