專利名稱：酶法轉化生產l-半胱氨酸的微生物固體酶制劑的制備及應用的制作方法
酶法轉化生產L-半胱氨酸的微生物固體酶制劑的制備及
應用
技術領域：
本發(fā)明利用微生物固體酶制劑酶法轉化生產氨基酸，屬于生物技術領域。涉及微 生物細胞的滲透處理以及冷凍或噴霧干燥，及其在轉化生產L-半胱氨酸中的應用。
背景技術：
L-半胱氨酸是一種重要的含硫氨基酸，廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化妝品以及飼料等 行業(yè)。目前我國L-半胱氨酸的生產以毛發(fā)水解為主，產量低、能耗高，水解過程中產生大量 廢氣及廢酸，污染環(huán)境。而利用酶法制備L-半胱氨酸具有反應條件溫和、專一性強、效率 高、副產物少、對環(huán)境友好等優(yōu)點，對節(jié)能減排、發(fā)展低碳經濟具有重要意義，長期以來相關 技術被國外公司壟斷。2003年，劉忠等人(微生物學通報，2003，30 (6) :16 21)分離篩選出一株具 有轉化 DL-2-氨基-Δ2 噻唑啉-4 羧酸(DL-2-Amino-A2thiazoline-4-Carboxylic Acid, DL-ATC)生成L-半胱氨酸能力的假單胞菌TS-1138菌株，經鑒定為惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida)(天津大學學報，2007，40 (4) :421 426)。金永杰等人(微生物學通報，2004，31 (6) :68_72)對假單胞菌TS-1138菌株轉化 DL-ATC的相關酶系進行了分離純化和酶學性質研究，純化了 L-ATC水解酶和L-SCC水解酶， 兩種酶的相對分子質量分別為37. 5kD和42. 8kD，酶促反應的最適溫度均為35°C，最適反應 PH分別為7. 0和8. 0，Km值分別為0. 67毫摩爾/升和0. 15毫摩爾/升，最大反應速度分 別為0. 39X 10_3毫摩爾/升·分鐘和0. 42X 10_3毫摩爾/升·分鐘。余養(yǎng)盛等人(Biosci.Biotechnol. Biochem.，2006，70 (9) 2262 2267)對惡臭假 單胞菌TS-1138菌株轉化DL-ATC的相關基因進行了研究，構建了 TS-1138菌株的基因組隨 機文庫，克隆到兩個新的基因(tsB，tsC)，并在大腸桿菌中進行了表達，對表達產物進行功 能鑒定的結果表明，tsB基因編碼L-ATC水解酶，tsC基因編碼L-SCC酰胺水解酶，從而在分 子水平上證明了 DL-ATC的轉化途徑。余養(yǎng)盛等人進一步發(fā)現(Frontiersof Biology in China, 2007, 2 (4) 391-396)，假單胞菌TS-1138菌株細胞內同時還存在L-半胱氨酸脫巰基酶，該酶可將L-半 胱氨酸分解為丙酮酸、H2S和NH3,從而影響L-半胱氨酸的積累。通過向酶促反應液中添加 羥胺或氨基脲可以部分抑制L-半胱氨酸脫巰基酶的活性，避免產物的分解。余養(yǎng)盛和劉春琴等人分別對TS-1138菌株細胞轉化DL-ATC合成L-半胱氨酸的 轉化條件進行了報道(生物技術通訊，2006，17 (6) :911-913;微生物學通報，2008，35(1) 45-49)，其最適酶促反應條件為反應溫度42°C，反應體系pH 8. 0，反應時間2. 5小時，底物 濃度6克/升，細胞懸液濃度250克/升，反應體系中羥胺濃度1摩爾/升。在最適酶促反 應條件下，由DL-ATC轉化為L-半胱氨酸的摩爾轉化率為96. 8%。此外，中國專利(申請?zhí)?00710056754. 9)報道了一種微生物轉化生產胱氨酸的 方法。該發(fā)明以惡臭假單胞菌TS-1138細胞為酶源的情況下，以羥胺為抑制劑，酶法轉化底
3物ATC得到L-半胱氨酸水溶液，并通過進一步氧化方式將所述的半胱氨酸轉化成胱氨酸的 方法。該方法直接利用菌體細胞為酶源催化底物，轉化效率在90%以上。在上述轉化反應研究中，均使用TS-1138菌株的培養(yǎng)細胞為酶源，酶源細胞用量 大(250克/升)，產物生成量相對少，并且酶源細胞需現用現制，因穩(wěn)定性差而無法長期保 存，導致使用不便，影響了該技術的產業(yè)化。

發(fā)明內容現有的微生物酶法轉化生產L-半胱氨酸的報道中使用的酶源均為TS-1138菌株 的靜息細胞(生物技術通訊，2006，17 (6) :911-913;微生物學通報，2008，35(1) :45_49;中 國專利200710056754. 9)，催化反應的酶源細胞用量大，產物生成量少，并且酶源細胞需現 用現制，因穩(wěn)定性差而無法長期保存，導致使用不便。本發(fā)明目的是為解決上述問題，提供 一種酶法轉化生產L-半胱氨酸的微生物固體酶制劑的制備及應用。具體是通過細胞透性 化處理提高TS-1138菌株細胞的催化活性，同時通過將透性化細胞進行冷凍干燥或噴霧干 燥，獲得可長期保存的酶制劑，為L-半胱氨酸酶法生產奠定了基礎。滲透處理細胞技術，是指在不破壞細胞完整結構的前提下，改變細胞壁和細胞膜 的通透性，從而使低分子量物質能夠自由進出細胞的技術。通過這種方法獲得的細胞通常 稱為透性化細胞。而對微生物細胞的干燥通常采用真空冷凍干燥和噴霧干燥技術。真空冷 凍干燥簡稱凍干，是冷凍技術與真空技術相結合的干燥脫水技術。凍干產品含水量低，不易 被氧化，有利于運輸、銷售和長期保存。噴霧干燥是一種應用廣泛、經濟、簡便的物料干燥方 法，噴霧干燥直接通過霧化的方式形成霧滴并在與熱氣體介質接觸的過程中蒸發(fā)溶劑，從 而產生干燥粉末，由于水分蒸發(fā)和受熱時間短，可通過控制操作條件和加入合適的保護劑， 最大限度地防止活性物質的變性，從而制備穩(wěn)定的粉粒狀產品。針對真空冷凍干燥或噴霧 干燥過程中酶容易失活的問題，選擇合適的保護劑和噴霧干燥的條件至關重要。本發(fā)明利用細胞滲透處理技術在不破壞惡臭假單胞菌TS-1138菌株細胞整體結 構的前提下，改變了細胞壁和細胞膜的通透性，提高了底物和產物的傳質效率。本發(fā)明提供的酶法轉化生產L-半胱氨酸的微生物固體酶制劑的制備方法是采 用惡臭假單胞菌TS-1138菌體細胞，以甲苯為滲透劑，滲透處理獲得透性化細胞，采用冷凍 干燥或噴霧干燥獲得透性化細胞干粉，即可用于酶法轉化生產L-半胱氨酸的微生物固體 酶制劑。其中，滲透劑甲苯的濃度范圍在0. 至5% (ν/ν)，最佳濃度為2%，滲透處理的 溫度范圍為15-35°C，最佳溫度為25°C，處理時間為15-90分鐘，最佳時間為30分鐘。在 最佳滲透條件下，所得透性化細胞的酶活可達229. 9U/克，約為對照(靜息細胞)的7倍。 TS-1138菌體細胞經透性化處理后，轉化DL-ATC生成L-半胱氨酸的最適反應溫度為35°C， 與L-ATC水解酶和L-SCC酰胺水解酶的最適反應溫度相同。透性化細胞的最適反應pH為 8. 0。在冷凍干燥獲得透性化細胞干粉的制備工藝中，本發(fā)明采用Plackett-Burman設 計法和響應面分析法獲得了一種優(yōu)化的復合凍干保護劑，復合凍干保護劑為谷氨酸鈉、甘 油和甘露醇的混合物，濃度范圍分別為谷氨酸鈉5-15克/升、甘油10-50毫升/升和甘 露醇10-50克/升，其中最佳濃度為谷氨酸鈉11. 21克/升、甘油32毫升/升和甘露醇35克/升。在最佳條件下，使透性化細胞凍干后的殘存酶活由12. 5%提高到66.7%。凍干透 性化細胞室溫貯存3個月，依舊保持90%以上的活性，而靜息細胞4°C貯存7天酶活損失在 50%以上。通過單因素實驗和響應面分析實驗，確認了最適細胞濃度、底物濃度、反應時間， 獲得了該三因素對凍干透性化細胞轉化反應的影響規(guī)律，建立了以轉化率為響應值的二次 響應面回歸模型，優(yōu)化了反應工藝凍干細胞濃度35克/升，底物濃度15克/升，反應時間 2. 5小時。在采用噴霧干燥獲得透性化細胞干粉的制備工藝中，本發(fā)明采用正交設計法對噴 霧工藝進行優(yōu)化，考察進口溫度、霧化速度、進料菌濃、保護劑含量對酶活力收率的影響。確 定了噴霧條件保護劑為谷氨酸鈉、阿拉伯膠或牛肉浸膏，濃度范圍為5-20克/升，進口溫 度為100-140°C，進料菌濃為100-200克/升，霧化速度0.2-0.6升/小時。其中最佳條件 為保護劑為10克/升的谷氨酸鈉、阿拉伯膠或牛肉浸膏，進口溫度120°C，進料菌濃為200 克/升，霧化速度0. 2升/小時，在最佳條件下可得到收率最高為68. 92%的透性化細胞酶 粉。制得的噴干粉酶活達614. 7U/克，在室溫密封保存3個月，依舊保持90%以上的活性。本發(fā)明方法制備的固體酶制劑在酶法轉化生產L-半胱氨酸中的應用，以DL-2-氨 基-Δ2 噻唑啉-4 羧酸(DL-2-Amino-A2thiazoline-4-Carboxylic Acid, ATC)為底物，以 透性化細胞干粉即固體酶制劑為酶源，每小時內每克酶制劑可催化718至741. 7毫克的底 物ATC生成595. 1至614. 7克的L-半胱氨酸；凍干酶粉和噴干酶粉的反應溫度分別為35°C 或40°C，反應體系最佳pH8. 0，反應最佳時間2. 5小時，底物ATC的初始最佳濃度為4克/ 升，羥胺的最佳濃度1毫摩爾/升。與靜息細胞每小時內31. 4毫克的L-半胱氨酸的轉化效率相比，制得的噴干粉儲 存穩(wěn)定性高、轉化性能好，單位時間每小時內每克固體酶制劑可以轉化718至741. 7毫克的 DL-ATC，而制備1克固體酶制劑約需4克濕的靜息細胞，因此相當于每克濕靜息細胞制成固 體酶制劑后，在單位時間每小時內可以轉化179. 5至185. 4毫克的DL-ATC，生成148. 8至 153. 7毫克的L-半胱氨酸，效率大大提高，因此有很好的實際應用價值。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果本發(fā)明利用細胞滲透處理技術在不破壞惡臭假單胞菌 TS-1138菌株細胞整體結構的前提下，改變了細胞壁和細胞膜的通透性，提高了底物和產物 的傳質效率，所制備的透性化細胞的酶活最高為原始靜息細胞的7倍。同時，采用冷凍干燥 或噴霧干燥，將不易保存的透性化細胞制備成為穩(wěn)定性高、轉化活力好的固體酶制劑，與原 始的靜息細胞相比在最佳轉化工藝條件下，細胞的反應效率大約提高了 6倍，可用于高效 制備L-半胱氨酸，因此本發(fā)明在L-半胱氨酸的工業(yè)化生產領域具有良好的產業(yè)化價值。

圖1是甲苯用量對透性化細胞酶活力的影響。 圖2是滲透處理溫度和時間對透性化細胞酶活力的影響。圖3是溫度對酶活性的影響。圖4是溫度對酶穩(wěn)定性的影響。圖5是pH值對酶活性的影響。
具體實施方式本發(fā)明提供的酶法轉化生產L-半胱氨酸的微生物固體酶制劑的制備方法是采 用惡臭假單胞菌TS-1138菌體細胞，以甲苯為滲透劑，滲透處理獲得透性化細胞，采用冷凍 干燥或噴霧干燥獲得透性化細胞干粉，即酶法轉化生產L-半胱氨酸的微生物固體酶制劑。 其中，制備方法涉及的具體條件通過如下實施例確定，微生物固體酶制劑在L-半胱氨酸的 生產應用的具體操作可參考中國專利(申請?zhí)?200710056754. 9)實施例1 TSl 138菌體細胞的制備及酶活分析從平板上挑取一環(huán)TS-1138菌種接入液體種子培養(yǎng)基中(葡萄糖20克，ATC 3克， 玉米漿 5 克，尿素 3 克，NaCl 1. 5 克，MnSO4 · H2O 0. 1 克，K2HP043 克，MgSO4 · 7H20 0. 5 克， FeSO4WH2O 0.01克，定容至1升，pH 7. 5)，28°C、200轉培養(yǎng)16小時，然后以1 %的接種量轉 接于產酶培養(yǎng)基中(葡萄糖20克，ATC 4克，玉米漿1克，尿素3克，NaCl 1. 5克，MnSO4 ·Η20 0. 1 克，Κ2ΗΡ043 克，MgSO4 · 7Η20 0. 5 克，FeSO4 · 7Η20 0. 01 克，定容至 1 升，ρΗ7· 5)，28°C、 200轉培養(yǎng)16小時，所得發(fā)酵液于4°C下6，000轉離心10分鐘，收集菌體，用50毫摩爾/ 升的磷酸緩沖液(PH 8.0)懸浮洗滌后再離心，收集菌體作為靜息細胞備用。以50毫摩爾/升的磷酸緩沖液(pH 8. 0)配制一定濃度的細胞懸液，加入到以50 毫摩爾/升的磷酸緩沖液(PH 8.0)配制的2倍體積6克/升的DL-ATC溶液中，混勻后，于 35°C保溫10分鐘，然后采用酸式茚三酮法迅速測定生成的L-半胱氨酸含量。以L-半胱氨 酸為標準品繪制標準曲線。酶活力單位定義為在上述反應條件下，每小時轉化DL-ATC生成 1毫克L-半胱氨酸所需的酶源細胞的酶量為1個酶活力單位(U)。酶活以每克細胞所含的 酶活力單位(U/克)表示。實施例2滲透試劑的選擇將菌體細胞以50毫摩爾/升的磷酸緩沖液(pH 8.0)配成10%的菌懸液后分別加 入不同的滲透試劑(見表1)，30°C振蕩30分鐘，4°C下6，000轉離心10分鐘，收集菌體，再 以50毫摩爾/升的磷酸緩沖液(pH 8. 0)洗滌后離心，得透性化細胞。按實施例1方法檢 測透性化細胞的酶活，以確定最佳滲透試劑。表1不同滲透試劑處理后所得透性化細胞的酶活
滲透劑酶活(U/克)倍數對照(無滲透劑)26.81.0DMSO24.30.90.2%Tween 8018.70.710%乙醇58.72.20.2%EDTA68.22.52%氯仿56.32.12%氯仿+ 10%乙醇54.92.02% 氯仿 +0.2%EDTA58.32.22%甲苯207.07.72%甲苯+ 10%乙醇86.43.22% 甲苯 +0.2%EDTA171.96.4 TS-1138菌體細胞經滲透劑滲透處理后，轉化DL-ATC生成L-半胱氨酸的能力見表2，其中2%甲苯對TS-1138菌體細胞的滲透效果優(yōu)于其它滲透劑，所得透性化細胞的酶 活性為未滲透細胞(靜息細胞)的7倍以上。甲苯與EDTA或乙醇對TS-1138菌體細胞酶 活的增加沒有協(xié)同增強作用。分別采用不同濃度的甲苯對細胞進行滲透處理，結果如圖1所示。添加2%的甲苯 滲透處理30分鐘效果較好。實施例3滲透處理溫度和時間對酶活的影響以相同的菌體量分別測定滲透的適宜溫度范圍和處理時間，結果如圖2所示，以 未滲透細胞的酶活為對照，在20-35°C處理15-90分鐘獲得的透性化細胞的酶活均增加2倍 以上。不過，在較低溫度和較短時間范圍內(如20 25°C處理15 60分鐘)，隨著滲透 時間的延長所得透性化細胞的酶活增加；當滲透時間繼續(xù)增長，酶活反而下降，可能是部分 胞內酶泄露的緣故(如20°C處理90分鐘)。在溫度較高情況下，如35°C處理15分鐘后，酶 活就開始降低，說明該酶的熱穩(wěn)定性不是很好。此外，雖然20°C滲透90分鐘的效果最好，所 得透性化細胞的酶活可達165U/克，與25°C滲透30分鐘(酶活為160U/克)相比酶活僅約 提高3%，但是卻需要3倍的滲透時間。由于低溫滲透及滲透時間的延長都會增加能耗，因 此綜合考慮，對于100克/升的菌懸液，在25°C下滲透處理30分鐘最佳。實施例4 TS-1138菌株透性化細胞懸液的制備將TS-1138菌株細胞以10毫摩爾/升的磷酸緩沖液(pH 8. 0)配制100克/升菌 懸液后加入0. 1-5% (ν/ν)的甲苯，20-351滲透處理15-90分鐘，然后于41下6，000轉離 心10分鐘，棄去上清液，透性化細胞以相同的磷酸緩沖液懸浮洗滌2次，4°C，6，000轉離心 10分鐘，收集透性化細胞，加入適量上述磷酸緩沖液，獲得透性化細胞懸液備用。實施例5凍干保護劑的篩選分別選取蔗糖、海藻糖、脫脂奶粉、山梨醇、甘露醇、維生素C、谷氨酸鈉和甘油8種 保護劑作為考察對象，利用Plackett-Burman實驗設計，對適用于TS-1138菌株透性化細胞 的凍干保護劑進行篩選，實驗設計及結果見表2。從表2可以看出，未添加保護劑的透性化 細胞凍干后僅殘存12. 5%的酶活，添加保護劑后，凍干透性化細胞的酶活均有不同程度的 提高，在實驗范圍內酶活保護率最高可達61.2%。表2Plackett_Burman 實驗設計及響應值(N = 12)
權利要求
酶法轉化生產L 半胱氨酸的微生物固體酶制劑的制備方法，其特征在于采用惡臭假單胞菌TS 1138菌體細胞，以甲苯為滲透劑，滲透處理獲得透性化細胞，采用冷凍干燥或噴霧干燥獲得透性化細胞干粉，即酶法轉化生產L 半胱氨酸的微生物固體酶制劑。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于滲透劑甲苯的體積濃度范圍在0.至 5%，滲透處理的溫度范圍為15-35°C，處理的時間范圍為15-90分鐘。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于甲苯的最佳體積濃度為2%，滲透處理的最 佳溫度為25°C，處理的最佳時間為30分鐘。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于采用冷凍干燥獲得透性化細胞干粉的制 備工藝中，使用的復合凍干保護劑為谷氨酸鈉、甘油和甘露醇的混合物，濃度范圍分別為谷 氨酸鈉5-15克/升、甘油10-50毫升/升和甘露醇10-50克/升。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于復合凍干保護劑中谷氨酸鈉的最佳濃度 為11. 21克/升、甘油32毫升/升和甘露醇35克/升。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于采用噴霧干燥獲得透性化細胞干粉的制 備工藝中，保護劑為谷氨酸鈉、阿拉伯膠或牛肉浸膏，濃度范圍為5-20克/升，進口溫度為 100-140°C，霧化速度范圍為0. 2-0. 6升/小時，進料菌濃范圍為100-200克/升。
7.根據權利要求6所述方法，其特征在于最佳噴霧干燥條件為10克/升的谷氨酸鈉 作為保護劑，進口溫度為120°C，霧化速度為0. 2升/小時，進料菌濃為200克/升。
8.權利要求1所述方法制備的固體酶制劑在酶法轉化生產L-半胱氨酸中的應用，其 特征在于以 DL-2-氨基-Δ2 噻唑啉-4 羧酸(DL-2-Amino-A2thiazoline-4-Carboxylic Acid,ATC)為底物，以權利要求1制備的透性化細胞干粉即固體酶制劑為酶源，該酶制劑可 酶法轉化生產L-半胱氨酸，每小時內每克酶制劑可催化718至741. 7毫克的底物ATC生成 595. 1至614. 7克的L-半胱氨酸；凍干酶粉和噴干酶粉的反應溫度分別為35°C或40°C，反 應體系最佳PH8. 0，反應最佳時間2. 5小時，底物ATC的初始最佳濃度為4克/升，羥胺的最 佳濃度1毫摩爾/升。
全文摘要
一種酶法轉化生產L-半胱氨酸的微生物固體酶制劑的制備及應用。本發(fā)明以甲苯為滲透劑，處理菌懸液獲得TS-1138菌株透性化細胞，其酶活高達229.9U/克，約為原始細胞的7倍。在冷凍干燥透性化細胞中，采用谷氨酸鈉、甘油和甘露醇為復合凍干保護劑，冷凍干燥后的殘存酶活最高達66.7％，4℃貯存3個月后，酶活仍可以保持90％以上。在噴霧干燥細胞中，可采用谷氨酸鈉、阿拉伯膠或牛肉浸膏為保護劑，噴霧干燥后殘存酶活最高達68.92％，制得的噴干酶粉活力達614.7U/克，在4℃密封可穩(wěn)定保存3個月。本發(fā)明所獲得的微生物固體酶制劑活性高利于保存，可用于酶法制備L-半胱氨酸的工業(yè)化生產。
文檔編號C12P13/12GK101948779SQ201010267648
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權日2010年8月31日
發(fā)明者劉磊, 姚瑞娟, 張奇, 張璽, 陳曉蕓, 高智慧 申請人:天津啟仁醫(yī)藥科技有限公司